陸地棉E3泛素連接酶基因GhPUB19D的克隆與功能分析

金姝雯,安曉暉,葛冬冬,劉康

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室/現(xiàn)代作物生產(chǎn)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京210095)

棉花是我國重要的經(jīng)濟作物。在棉花生長發(fā)育過程中遭受的各種生物和非生物脅迫會降低棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)。提高棉花耐鹽性對于合理規(guī)劃棉花生產(chǎn)布局,避免糧棉爭地和過度依賴灌溉脫鹽具有重要意義[1]。棉花黃萎病是一種通過植株根部侵染的土傳真菌維管束病害,每年可造成200億元人民幣損失。培育耐鹽、抗病棉花品種是最經(jīng)濟有效的途徑。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)是廣泛存在于真核生物中的一種蛋白質(zhì)降解途徑,參與調(diào)控植物的光形態(tài)建成、激素反應(yīng)以及對逆境脅迫的響應(yīng)[2]。其中,E3泛素連接酶能特異識別靶蛋白,并將泛素化的蛋白轉(zhuǎn)移到26S蛋白酶體降解,是UPS中決定底物蛋白特異性的關(guān)鍵酶[3-4]。

U-box E3泛素連接酶(PUB)是植物特有的一類E3泛素連接酶[5]。U-box結(jié)構(gòu)域含有約75個高度保守的氨基酸序列,是RING finger結(jié)構(gòu)域的變體[6]。在擬南芥、水稻、大麥的基因組中,根據(jù)U-box結(jié)構(gòu)域的位置以及U-box結(jié)構(gòu)域以外其他結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)特點,將PUB蛋白劃分為10類亞族[7-9]。目前已有不少PUB被鑒定證實參與植物的非生物脅迫響應(yīng):辣椒CaPUB1負調(diào)控植株脫水和耐鹽性,過表達CaPUB1顯著降低干旱脅迫誘導(dǎo)基因RD29a的表達[10];AtPUB30促進降解BKI1從而減弱植株的耐鹽性[11];擬南芥pub22和pub23突變體對鹽脅迫的耐受性增強,pub22pub23雙突變體則表現(xiàn)出加性效應(yīng)[12];水稻OsPUB15正調(diào)節(jié)植物對鹽度的耐受性,H2O2、鹽和干旱脅迫誘導(dǎo)OsPUB15累積,從而增強對這些非生物脅迫的抵御能力[13];TaPUB1可介導(dǎo)鹽脅迫負調(diào)節(jié)因子TaMP的降解,增強轉(zhuǎn)基因煙草的鹽脅迫耐受性[14],過表達TaPUB1可以增強轉(zhuǎn)基因植株Na+外排和 K+保持能力,減少H+流入,使細胞質(zhì)內(nèi)維持較低的Na+/K+,轉(zhuǎn)TaPUB1基因小麥苗期和開花期耐鹽性明顯增強,而TaPUB1-RNAi植株對鹽脅迫敏感[15]。PUB蛋白在植物的免疫應(yīng)答中的作用也有報道。PUB22介導(dǎo)病原相關(guān)分子模型觸發(fā)免疫(PTI)所必需的亞基Exo70B2的泛素化和降解[16];PUB12和PUB13泛素化免疫受體FLS2并促進其降解,且pub12和pub13突變體表現(xiàn)出更高的免疫應(yīng)答[17]。OsSPL11可降解SPIN6,并提高其對稻瘟病和白葉枯病的抗性[18]。在煙草和番茄中,U-box蛋白CMPG1可有效激活由多個抗性基因觸發(fā)的防御機制[19]。棉花根中的GhPUB17在大麗輪枝菌侵染或外源激素(茉莉酸和水楊酸)處理后顯著上調(diào)表達,過表達GhPUB17增強植株對病原菌的敏感性,敲除基因植株對大麗輪枝菌的抗性增強[20]。

植物PUB基因功能及其作用機制具有多樣性,但是棉花PUB的研究報道較少。本研究鑒定了1個棉花U-box E3泛素連接酶基因GhPUB19D,通過分析其組織表達特征及其對不同非生物脅迫處理的響應(yīng),以及VIGS沉默和過表達轉(zhuǎn)基因植株的表型,初步了解GhPUB19D在調(diào)控生物和非生物脅迫中的作用。

1 材料與方法

1.1 植物材料與菌株

植物供試材料為陸地棉遺傳標準系TM-1和擬南芥哥倫比亞型野生型Col-0。大麗輪枝菌Vd991菌株、大腸桿菌感受態(tài)DH5α菌株、根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101菌株、根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105菌株以及亞細胞定位載體pBINPLUS-GFP4、植物過表達載體pBI121-GUS、VIGS載體(pTRV1與pTRV2)均由本實驗室保存。

1.2 基因克隆與基因表達分析

棉花總RNA用EASYspin Plus RNA快速提取試劑盒(北京艾德萊)提取,擬南芥總RNA采用TRizol?試劑(Thermo Fisher Scientific公司)提取。提取步驟按產(chǎn)品說明書進行。每個樣品取500 ng總RNA用于cDNA合成。以棉花cDNA為模板,PCR擴增GhPUB19DORF全長(引物為:F:ATGATACAAAAGAAATTCAATGAAG,R:CCAAACATGAACTGATTGTTCATTC)。應(yīng)用7500實時PCR系統(tǒng)(ABI公司)進行qRT-PCR分析,分別以GhACT9(AY305737)和UBQ10作為棉花和擬南芥的內(nèi)參基因,3個生物學(xué)重復(fù),采用2-ΔΔCT法計算基因的相對表達量[21]。

1.3 棉花激素與脅迫處理分析

在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)棉花無菌苗,生長至1周時,分別用200 mg·L-1聚乙二醇PEG-6000和200 mmol·L-1NaCl溶液灌根處理0、1、3、6、12、24、48 h后取樣。用0.1 mmol·L-1ABA、2.5 mmol·L-1SA、0.1 mmol·L-1GA3、2.5 mmol·L-1乙烯利(ET)溶液均勻噴灑于棉花葉片表面,分別在處理后0、1、3、6、12、24、48 h取樣。所有樣品取樣后立刻用液氮速凍,保存于-80 ℃冰箱備用。

1.4 病毒介導(dǎo)的基因沉默(VIGS)分析

利用基于煙草脆裂病毒(TRV)的pTRV1和pTRV2載體進行棉花VIGS分析。利用SGN VIGS Tool(http://vigs.solgenomics.net/)設(shè)計GhPUB19D基因和陽性對照基因GhCLA1的VIGS干擾序列,通過同源重組分別插入pTRV2載體。將pTRV1、pTRV2、pTRV2:GhCLA1、pTRV2:GhPUB19D載體分別轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中。將pTRV1與pTRV2或其他插入了基因片段的pTRV2衍生載體按1∶1比例(體積比)混合后注射到棉花子葉下表皮,黑暗中孵育24 h后轉(zhuǎn)移到26 ℃溫室中繼續(xù)生長。

1.5 亞細胞定位

將GhPUB19D全長ORF序列插入pBIN-GFP4質(zhì)粒構(gòu)成pBIN-GhPUB19D-GFP融合蛋白表達載體,將其與高爾基體標記的融合蛋白表達載體Man49-RFP分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后,共同注射到煙草下表皮,置于培養(yǎng)箱中孵育48 h,然后在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察GFP和RFP熒光信號并拍照。

1.6 大麗輪枝菌Vd991的培養(yǎng)、接種以及抗病性鑒定

挑取大麗輪枝菌Vd991的菌絲于含有潮霉素B的Czapek’s液體培養(yǎng)基,25 ℃條件下200 r·min-1培養(yǎng)5～7 d,用4層滅菌紗布過濾后的濾液即為孢子懸浮液。用血球計數(shù)板計數(shù)孢子數(shù)目,用液體Czapek’s培養(yǎng)基稀釋至5×106CFU·mL-1。選用5周齡的棉花,用針頭在葉節(jié)下方1 cm處主莖上刺1個小孔至木質(zhì)部,再用微量注射器注射2 μL孢子懸浮液到小孔內(nèi)。接菌21 d后統(tǒng)計發(fā)病率和病情指數(shù)。選用3周齡擬南芥植株,用水洗去培養(yǎng)基質(zhì)后,將根系在孢子液中浸泡10 min再移植到滅菌的營養(yǎng)土中。以無菌水代替孢子液接種為對照,每個處理16株,3次生物學(xué)重復(fù)。接種大麗輪枝菌24 h后取樣,通過qRT-PCR分析擬南芥抗病相關(guān)基因表達水平;接種大麗輪枝菌12 d時,取同一位置的蓮座葉,提取總DNA,采用qPCR定量檢測擬南芥蓮座葉中真菌DNA含量,擴增引物為:F:5′-CATCAGTCTCTCTGTTTATACCAACG-3′和R:5′-CGATGCGAGCTGTAACTACTACGCAA-3′,3次生物學(xué)重復(fù)。棉花和擬南芥病情分級標準、發(fā)病率和病情指數(shù)的計算參照文獻[22]的方法。

1.7 擬南芥抗逆性鑒定

將擬南芥種子春化后,點播在含有0、1、5、10 μmol·L-1ABA的1/2 MS培養(yǎng)基。22 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 d,觀察擬南芥種子的萌發(fā)情況。將4日齡擬南芥移植到營養(yǎng)土中,生長3周后,加入200 mmol·L-1NaCl溶液浸透,1周后拍照觀察。每個處理3個生物學(xué)重復(fù)。

1.8 生物信息學(xué)分析

利用BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)查找GhPUB19D同源蛋白,利用 ClustalX 2.0進行多重序列比對,利用MEGA-X10鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[23],bootstrap 重復(fù)1 000次。利用SeqHunter從陸地棉TM-1參考基因組序列中提取GhPUB19D上游2 000 bp 基因組序列,利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預(yù)測順式調(diào)控元件。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhPUB19D基因克隆及其序列分析

陸地棉基因組中有2個編碼PUB19的基因,分別位于A12(Gh_A12G2472)和D12(Gh_D12G2600)染色體上。NCBI公共數(shù)據(jù)庫RNA-seq數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明,2個基因均受低溫、NaCl、PEG誘導(dǎo)表達。利用RNAseq發(fā)現(xiàn),大麗輪枝菌處理TM-1幼苗可以誘導(dǎo)GhPUB19D(GenBank:XP_040963758)上調(diào)表達。為了分析該基因的功能,以cDNA為模板,擴增獲得GhPUB19D基因的全長ORF序列,序列長2 043 bp,編碼680個氨基酸,預(yù)測等電點為8.46,蛋白相對分子質(zhì)量為75.8×103;含有1個修飾的RING指型U-Box結(jié)構(gòu)域和3個ARM重復(fù)(Armadillo repeats)結(jié)構(gòu)域。與其他植物PUB19蛋白序列進行比對,結(jié)果顯示:陸地棉GhPUB19D與GhPUB19A相似性達99.71%,與亞洲棉GaPUB19、海島棉GbPUB19、雷蒙德氏棉GrPUB19都高度相似,在系統(tǒng)進化樹上聚為一類;與榴蓮DzPUB19-like、可可TcPUB19、黃麻CcPUB19相似度在80%左右,這些物種的PUB19聚為另一類;與甜橙CsPUB19-like、楊樹PtPUB19、葡萄VvPUB19-like、擬南芥AtPUB19的同源性較低,這些物種的PUB19在系統(tǒng)進化樹上歸屬不同類型(圖1-A)。水稻中沒有發(fā)現(xiàn)與之高度相似的直系同源蛋白。從功能結(jié)構(gòu)域的構(gòu)成來看,所有的PUB19蛋白都含有1個U-box結(jié)構(gòu)域,但是擬南芥的U-box還含有zf-Nse和zf-RING_UBOX結(jié)構(gòu)域,除甜橙CsPUB19-like外,其他PUB19蛋白都有Arm結(jié)構(gòu)域(圖1-B)。

圖1 植物PUB19蛋白的進化樹與功能結(jié)構(gòu)域分析Fig.1 Phylogenetic tree and function domain of PUB19 in plant A. 利用ClustalX 2.0對12個PUB19蛋白進行多重序列比對,利用MEGA-X10構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,分支上的數(shù)字為Bootstrap值;B. 利用Pfam分析的功能結(jié)構(gòu)域示意圖。A. Multiple sequence alignment of 12 PUB19 proteins was carried out using ClusalX 2.0,and the phylogenetic tree was constructed by MEGA-X10,numbers on branches were indicative of the bootstrap values;B. Schematic diagram of functional domain analyzed by Pfam.

2.2 GhPUB19D表達特征分析

利用PlantCARE對GhPUB19D的上游基因組序列進行順式調(diào)控元件預(yù)測,發(fā)現(xiàn)在啟動子區(qū)存在ABA響應(yīng)元件ABRE、干旱脅迫響應(yīng)元件MBS、厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件ARE、赤霉素反應(yīng)元件GARE-motif和P-box、低溫響應(yīng)元件LTR、光響應(yīng)元件(如AE-box、ATCT-motif、Box4和G-box等)以及MYBHv1結(jié)合元件CCAAT-box等多種順式作用元件。因此,GhPUB19D可能參與對激素、環(huán)境以及逆境脅迫的響應(yīng)。

利用qRT-PCR分析GhPUB19D在陸地棉不同組織的相對表達量,發(fā)現(xiàn)GhPUB19D在陸地棉根、莖、葉、胚珠中均有表達,在根和葉中表達量較高,而在莖和幼嫩胚珠中的表達量較低(圖2)。

圖2 GhPUB19D在陸地棉TM-1不同組織中的表達量Fig.2 GhPUB19D expression level in different tissues of cotton 根、莖、葉采自3葉期棉花植株,-1 DPA、0 DPA、1 DPA、3 DPA胚珠分別采自開花期1 d、開花當天、開花后1 d和3 d花蕾中的完整胚珠(含表皮毛)。Roots,stems and leaves were collected from cotton plants at 3-leaf stage,and -1 DPA,0 DPA,1 DPA and 3 DPA ovules were collected from intact ovules(bearing trichome)in flower buds at 1 day before anthesis,anthesis,1 day and 3 days post-anthesis,respectively.

分析PEG、NaCl、ABA、ET、GA3、SA處理對GhPUB19D表達的影響,發(fā)現(xiàn)PEG、NaCl、ABA、ET、GA3處理1 h,GhPUB19D誘導(dǎo)上調(diào)表達達到峰值,而SA處理表現(xiàn)為先下調(diào)表達,處理后24 h上調(diào)表達達到峰值。GhPUB19D的表達對ABA處理最為敏感,處理后1 h其表達上調(diào)355倍,NaCl、ET、PEG和GA3分別為62倍、31倍、28倍和22倍,而SA處理24 h后,該基因的表達才達到峰值,為對照的2.7倍(圖3)。上述結(jié)果表明,GhPUB19D可能參與激素信號的轉(zhuǎn)導(dǎo),調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育以及多種脅迫響應(yīng)。

圖3 不同非生物脅迫和激素對棉花GhPUB19D表達的影響Fig.3 Effects of different abiotic stresses and hormones on GhPUB19D expression in cotton**P<0.01. The same below.

2.3 GhPUB19D蛋白的亞細胞定位

亞細胞定位結(jié)果(圖4)顯示,GhPUB19D-GFP融合蛋白與高爾基體標記的融合蛋白Man49-RFP高度重合,表明GhPUB19D定位于高爾基體。GhPUB19D可能參與蛋白的加工。

圖4 GhPUB19D蛋白在本氏煙草中的亞細胞定位Fig.4 Subcellular localization of GhPUB19D protein in Nicotiana benthamiana A. GhPUB19D-GFP融合蛋白的亞細胞定位;B. Man49-RFP融合蛋白的細胞定位;C. GFP和RFP信號疊加。A. Localization of GhPUB19D-GFP fusion protein in a cell;B. Localization of Man49-RFP fusion protein in a cell;C. Superimposition of GFP and RFP signals.

2.4 VIGS沉默GhPUB19D對棉花黃萎病抗性的影響

U-box決定GhPUB19D的泛素化功能,而Arm結(jié)構(gòu)域在胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。為了分析GhPUB19D的生物學(xué)功能,我們利用VIGS分別針對GhPUB19D的U-box結(jié)構(gòu)域(TRV2∶GhPUB19D-a)和Arm結(jié)構(gòu)域(TRV2∶GhPUB19D-b)沉默棉花GhPUB19D基因,分析其對表型的影響。將對照和VIGS幼苗接種大麗輪枝菌Vd991孢子21 d后,所有棉花植株均出現(xiàn)黃化和枯萎等黃萎病典型病癥,但與對照TRV∶00植株相比,TRV∶GhPUB19D沉默植株病癥更為嚴重(圖5-A)。當TRV2∶GhCLA1陽性對照植株出現(xiàn)白化時,qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)VIGS沉默植株(TRV∶GhPUB19D-a和TRV∶GhPUB19D-b)中GhPUB19D的mRNA水平均顯著低于對照植株(TRV∶00)(圖5-B),表明GhPUB19D得到有效沉默。沉默植株發(fā)病率和病情指數(shù)極顯著增加(圖5-C、D)。表明VIGS沉默GhPUB19D顯著減弱棉花對大麗輪枝菌Vd991的抗性,因此GhPUB19D是陸地棉抗黃萎病所必需的。

圖5 病毒誘導(dǎo)沉默GhPUB19D對棉花抗黃萎病的影響Fig.5 Effect of virus-induced silencing GhPUB19D on Verticillium wilt resistance of cotton A. 大麗輪枝菌Vd991侵染棉花21 d后的癥狀;B. qRT-PCR分析棉花植株中GhPUB19D的轉(zhuǎn)錄水平;C. Vd991侵染21 d后棉花黃萎病發(fā)病率;D. Vd991侵染21 d后棉花黃萎病病情指數(shù)。A. Symptoms of cotton plants at 21 d after inoculation with V.dahliae Vd991;B. The transcript levels of GhPUB19D in cotton analyzed using qRT-PCR;C. The incidence of Verticillium wilt disease at 21 d;D. Disease index Verticillium wilt disease at 21 d.

2.5 轉(zhuǎn)GhPUB19D基因擬南芥的ABA敏感性鑒定

將CaMV 35S啟動子驅(qū)動的GhPUB19D,通過農(nóng)桿菌泡花法導(dǎo)入擬南芥,獲得7株陽性苗。從中挑選2個GhPUB19D基因表達水平較高的株系。為了分析GhPUB19D對種子萌發(fā)及其ABA敏感性的影響,分別將擬南芥種子置于含有0、1、5和10 μmol·L-1ABA的1/2 MS培養(yǎng)基上進行發(fā)芽試驗。1 μmol·L-1ABA對種子的萌發(fā)率沒有顯著影響,隨著ABA濃度的增加,野生型擬南芥(WT)和轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的發(fā)芽率均降低,但轉(zhuǎn)基因擬南芥的發(fā)芽率顯著高于野生型擬南芥(圖6-A、B)。以上結(jié)果表明,轉(zhuǎn)GhPUB19D顯著降低ABA對擬南芥種子萌發(fā)的抑制作用。

圖6 轉(zhuǎn)GhPUB19D基因?qū)M南芥種子萌發(fā)及其對ABA敏感性的影響Fig.6 Effects of transgenic GhPUB19D on Arabidopsis seed germination and sensitivity to ABAA. 不同濃度ABA處理對擬南芥種子萌發(fā)的影響;B. 不同濃度ABA處理后擬南芥種子的發(fā)芽率。A. Effects of ABA treatment on seed germination of Arabidopsis;B. Germination rate of Arabidopsis seeds treated with different concentrations of ABA.

2.6 轉(zhuǎn)GhPUB19D基因擬南芥的耐鹽性鑒定

以200 mmol·L-1NaCl處理3周的擬南芥幼苗,鹽脅迫7 d后,擬南芥植株葉片發(fā)生黃化和枯萎等鹽害癥狀。與WT相比,GhPUB19D轉(zhuǎn)基因擬南芥株系癥狀相對較弱,其中GhPUB19D表達水平最高的5#株系最輕(圖7-A、B)。鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥的蓮座葉葉面積顯著大于WT(圖7-C)。說明GhPUB19D能夠增強擬南芥幼苗期的耐鹽性。

圖7 轉(zhuǎn)GhPUB19D基因?qū)M南芥苗期耐鹽性的影響Fig.7 Effect of transgenic GhPUB19D on the salt tolerance of Arabidopsis seedlings A. 鹽脅迫下擬南芥植株的表型;B. 鹽脅迫下擬南芥蓮座葉的比較;C. 鹽處理擬南芥蓮座葉葉面積。A. Phenotype of Arabidopsis in salt stress;B. Comparison of Arabidopsis rosette leaves in stress;C. The rosette leaf areas of Arabidopsis under salt treatment. *P<0.05. The same below.

利用qRT-PCR分析轉(zhuǎn)GhPUB19D基因?qū)M南芥AtRD26、AtABF1、AtABF3、AtABF4、AtSLAH3、AtRAB18、AtMYB44這7個與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和脅迫響應(yīng)相關(guān)基因表達的影響。結(jié)果(圖8)表明,7個基因的表達量在未經(jīng)鹽脅迫處理的WT和轉(zhuǎn)基因擬南芥中均沒有顯著差異。200 mmol·L-1NaCl處理后,AtABF1和AtRAB18在WT和轉(zhuǎn)基因擬南芥中均顯著上調(diào)表達,但在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達水平顯著低于WT;AtABF3和AtABF4只在鹽脅迫的轉(zhuǎn)基因擬南芥中顯著上調(diào)表達;AtRD26和AtSLAH3只在鹽脅迫的WT中顯著上調(diào)表達;AtMYB44則在鹽脅迫的轉(zhuǎn)基因擬南芥中顯著下調(diào)表達。轉(zhuǎn)GhPUB19D基因提高了ABA信號通路中SnRK2.3/2.6下游的AtABF3和AtABF4對鹽脅迫的響應(yīng),鈍化或削弱了由滲透脅迫強烈誘導(dǎo)的ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的正調(diào)節(jié)因子AtRD26和AtMYB44、響應(yīng)干旱脅迫的AtRAB18以及S型陰離子通道蛋白SLAH3對鹽脅迫的響應(yīng)。

圖8 轉(zhuǎn)GhPUB19D基因?qū)M南芥鹽脅迫相關(guān)基因表達的影響Fig.8 Effect of transgenic GhPUB19D on the expression of salt stress related genes in Arabidopsis plants不同大、小寫字母表示在0.01和0.05水平差異顯著。下同。Different capital and small letters represent significant difference at 0.01 and 0.05 levels. The same below.

2.7 轉(zhuǎn)GhPUB19D基因擬南芥的抗病性鑒定

采用蘸根法對3周齡擬南芥幼苗定量接種大麗輪枝菌Vd991的孢子。接菌12 d后,WT出現(xiàn)葉片黃化、枯萎、萎蔫等黃萎病病癥,與WT相比,GhPUB19D轉(zhuǎn)基因擬南芥病癥相對較弱(圖9-A),植株中真菌DNA相對含量顯著低于對照(圖9-B)。說明轉(zhuǎn)GhPUB19D基因能顯著增強擬南芥幼苗對大麗輪枝菌抗性。

圖9 轉(zhuǎn)GhPUB19D基因擬南芥對大麗輪枝菌Vd991抗性的影響Fig.9 Effect of transgenic GhPUB19D Arabidopsis on the resistance to V.dahliae A. 接種大麗輪枝菌Vd991孢子12 d的擬南芥幼苗;B. 接種大麗輪枝菌Vd991孢子12 d擬南芥植株中大麗輪枝菌含量。A. Seedlings of Arabidopsis at 12 d after inoculation with V.dahliae Vd991;B. The content of V.dahliae in Arabidopsis plants at 12 d after inoculation with V.dahliae Vd991.

為了分析轉(zhuǎn)GhPUB19D基因提高擬南芥抗病性的分子機制,利用qRT-PCR分析AtPR1、AtPR2、AtPR3、AtPR4、AtPR5、AtNPR1這6個與系統(tǒng)獲得抗性(SAR)信號通路相關(guān)基因的表達量。結(jié)果(圖10)表明:無論是否接種Vd991,轉(zhuǎn)基因GhPUB19D擬南芥AtPR1、AtPR2、AtPR3、AtPR5、AtNPR1的表達量均高于WT。接種大麗輪枝菌轉(zhuǎn)基因擬南芥中AtPR2、AtPR3、AtPR4和AtNPR1的表達量分別上調(diào)16.4、30.4、20.4、3.19倍?？梢?GhPUB19D可以調(diào)節(jié)水楊酸(AtPR2、AtNPR1)和乙烯/茉莉酸(AtPR3、AtPR4)信號通路,提高對黃萎病的抗性。

圖10 轉(zhuǎn)GhPUB19D基因?qū)M南芥抗病相關(guān)基因表達的影響Fig.10 Effect of trasgenic GhPUB19D on the expression of resistance-related genes in Arabidopsis plants

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植物U-box蛋白在植物生長發(fā)育、逆境脅迫應(yīng)答和抗病過程中均發(fā)揮著重要作用[24]。U-box結(jié)構(gòu)域是植物U-box E3泛素連接酶(PUB)的特征結(jié)構(gòu)域,含有約75個高度保守的氨基酸序列。擬南芥基因組編碼64個含有U-box的蛋白,其中含ARM結(jié)構(gòu)域的蛋白有41個[25];棉花基因組中有185個蛋白含有 U-box,其中78個有ARM結(jié)構(gòu)域,占42%[26],數(shù)目比擬南芥多。說明棉花有更為復(fù)雜的U-box/ARM基因家族參與調(diào)控棉花的生長發(fā)育和逆境響應(yīng)。已有報道證明GhPUB17負調(diào)控棉花對大麗輪枝菌的抗性[20]。但尚未見有關(guān)其他棉花PUB基因的研究報道。本研究從陸地棉中分離鑒定了1個U-box E3泛素連接酶基因GhPUB19D,該基因上游啟動子區(qū)存在多種逆境脅迫響應(yīng)順式作用元件,NaCl、PEG、ABA、GA3、ET均能誘導(dǎo)該基因迅速上調(diào)表達,對ABA尤為敏感,對SA響應(yīng)較慢且上調(diào)表達的倍數(shù)最低。轉(zhuǎn)GhPUB19D基因降低擬南芥萌發(fā)期對ABA的敏感性,表明GhPUB19D在種子萌發(fā)過程中作為ABA信號的負調(diào)控因子。轉(zhuǎn)GhPUB19D基因?qū)BA抑制植物的生長效應(yīng)沒有影響,但是可以提高擬南芥的耐鹽性。研究表明,擬南芥PUB18或者PUB19的單突變體對ABA或者NaCl的響應(yīng)與WT沒有差異,而pub18pub19雙突變體對ABA和NaCl的敏感性都顯著降低[27],本研究結(jié)論與之相反。但是,也有PUB正向調(diào)節(jié)植物耐鹽性的報道:鹽脅迫下TaPUB1過表達會導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株中的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如脯氨酸、可溶性糖積累,減輕鹽脅迫的危害[14];轉(zhuǎn)OsPUB15擬南芥在鹽處理下生長比野生型植株更快,到后期野生型植株已經(jīng)嚴重萎蔫時,轉(zhuǎn)基因擬南芥生長依舊正常[13]?？梢姴煌参锏牟煌琍UB蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能和分子調(diào)節(jié)功能與機制具有多樣性。轉(zhuǎn)GhPUB19D基因使ABA信號通路中SnRK2.3/2.6下游的AtABF3和AtABF4對鹽脅迫的響應(yīng)增強,而滲透脅迫誘導(dǎo)的ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的正調(diào)節(jié)因子AtRD26[1]和AtMYB44、干旱脅迫的AtRAB18[12]以及S型陰離子通道蛋白SLAH3對鹽脅迫的響應(yīng)被削弱[28]?？梢?GhPUB19D可通過ABA信號調(diào)節(jié)對非生物脅迫的反應(yīng)。

很多PUB蛋白被證明在植物的免疫應(yīng)答過程中起重要的調(diào)控作用。例如:PUB12與PUB13通過共受體BAK1招募來泛素化降解FLS2,最終導(dǎo)致PUB12和PUB3負調(diào)控鞭毛蛋白-FLS2引起的PTI抗性反應(yīng)。pub22pub23pub24三突變體由鞭毛蛋白、幾丁質(zhì)和elf18等引起的PTI反應(yīng)明顯增強,PUB22、PUB23和PUB24負調(diào)控植物的免疫反應(yīng)[24]。棉花GhPUB17對棉花黃萎病抗性也起負調(diào)控作用[20]。本研究中,VIGS沉默GhPUB19D使棉花黃萎病發(fā)病率和病情指數(shù)極顯著增加,而轉(zhuǎn)GhPUB19D基因則顯著減輕擬南芥黃萎病病癥并顯著降低植株體內(nèi)真菌DNA相對含量。轉(zhuǎn)GhPUB19D可以提高AtPR1、AtPR2、AtPR3、AtPR5、AtNPR1的表達量,而接種大麗輪枝菌可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因擬南芥中與乙烯/茉莉酸信號相關(guān)的AtPR3、AtPR4過量表達20倍以上,同時也可以使與水楊酸信號相關(guān)的AtPR2、AtNPR1大幅上調(diào)表達,不符合典型的茉莉酸-水楊酸拮抗關(guān)系[29],但對乙烯/茉莉酸通路的基因表達調(diào)控作用更大。

本研究發(fā)現(xiàn)GhPUB19D可以通過調(diào)節(jié)ABA信號提高植物耐鹽性,而通過乙烯/茉莉酸信號通路能調(diào)節(jié)植物對黃萎病的抗性。由于GhPUB19D是一種E3泛素連接酶,研究GhPUB19D如何通過U-box和ARM與其他蛋白相互作用,是進一步闡述其作用分子機制的關(guān)鍵。