植物乳桿菌與反芻動(dòng)物專用復(fù)合酶混合處理對(duì)玉米秸稈瘤胃降解的影響

張盛明,于興華,劉雨龍,金天浩,梅鐵瀚,馬涼非,劉紋芳

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)工程博士后科研流動(dòng)站,黑龍江 哈爾濱 150030;3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030)

玉米秸稈含有纖維素、半纖維素和蛋白質(zhì)等飼草動(dòng)物可以消化利用的營養(yǎng)成分。新鮮的玉米秸稈可以直接飼喂食草動(dòng)物或通過青貯處理等方法來提高利用率[1-2]。然而,風(fēng)干玉米秸稈的質(zhì)地粗糙,適口性差,不適宜直接飼喂食草動(dòng)物,而且難以滿足青貯飼料的原料要求。植物乳桿菌是一類可以產(chǎn)生乳酸的厭氧或兼性厭氧乳酸菌,乳酸可以軟化秸稈木質(zhì)纖維,賦予物料酸香氣味,并抑制病原菌生長[3]。目前,不同的植物乳桿菌已經(jīng)廣泛用于制備青貯秸稈飼料[3-4]。但是,單獨(dú)依靠植物乳桿菌的產(chǎn)酸作用,不足以克服秸稈木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)的頑抗特性。為了進(jìn)一步提高秸稈的飼用品質(zhì),植物乳桿菌可以與酵母菌、枯草芽胞桿菌等菌株混合使用[5-6]。但是,多菌株發(fā)酵對(duì)過程控制要求較高,需要嚴(yán)格篩選菌株,而且需要避免瘤胃微生物菌群紊亂[7]。飼用酶制劑具有高催化活性和強(qiáng)專一性,可以降低纖維素的聚合度,破壞木質(zhì)纖維聚集態(tài)結(jié)構(gòu),從而提高木質(zhì)纖維原料的易降解程度[8-9]。但是酶制劑所需反應(yīng)條件溫和,處理過程容易滋生雜菌,所以對(duì)原料、處理過程及產(chǎn)品貯存環(huán)境的要求較高。

本研究以風(fēng)干玉米秸稈為原料,利用植物乳桿菌和市售反芻動(dòng)物專用復(fù)合酶制劑(復(fù)合酶)對(duì)風(fēng)干玉米秸稈進(jìn)行混合處理,研究處理?xiàng)l件和方法,再綜合利用化學(xué)分析法、X-射線衍射儀(XRD)和掃描電子顯微鏡(SEM)分析處理前與處理后玉米秸稈的物理和化學(xué)結(jié)構(gòu)變化,利用瘤胃降解試驗(yàn)評(píng)價(jià)玉米秸稈的消化率,揭示玉米秸稈理化結(jié)構(gòu)變化與瘤胃降解率的內(nèi)在關(guān)聯(lián),為風(fēng)干玉米秸稈的飼料化利用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

玉米秸稈于2019年10月取自黑龍江省哈爾濱市成高子鎮(zhèn),采用飼草揉搓機(jī)搓絲處理后,剪成0.5～1.0 cm小段,40 ℃鼓風(fēng)干燥24 h,作為原料備用。原料秸稈的水分和灰分含量分別為8.0%和5.5%。植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)購自廣東省微生物菌種保藏中心,編號(hào):GIM 1.191(ACCC 11095),用MRS培養(yǎng)基對(duì)菌種凍干粉活化及復(fù)壯,獲得研究用菌液,該菌液活菌數(shù)為8×108CFU·mL-1。反芻動(dòng)物專用復(fù)合酶購自北京衛(wèi)諾恩生物技術(shù)有限公司,該復(fù)合酶的主要成分為:纖維素酶(2 000 U·g-1)、木聚糖酶(30 000 U·g-1)、β-甘露聚糖酶(3 000 U·g-1)、β-葡聚糖酶(5 000 U·g-1)和α-半乳糖苷酶(200 U·g-1),使用0.05 mol·L-1乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH4.8)配制成0.01 g·mL-1的酶溶液,貯存?zhèn)溆?。紅糖購自南京甘汁園糖業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品處理

1.2.1 植物乳桿菌單獨(dú)處理?xiàng)l件的確定(1)處理時(shí)間篩選:將2 mL植物乳桿菌液、2 g紅糖、148 mL蒸餾水和50 g玉米秸稈試樣混合均勻,裝入自封袋密封(排出袋內(nèi)空氣,下同),轉(zhuǎn)移至電熱恒溫培養(yǎng)箱中,在32 ℃條件下分別培養(yǎng)24、72、120、168和240 h,對(duì)照組為原料秸稈試樣;處理結(jié)束后,將試樣轉(zhuǎn)移至鼓風(fēng)干燥箱,40 ℃干燥24 h,用于后續(xù)試驗(yàn)與檢測。(2)植物乳桿菌添加量篩選:植物乳桿菌液的添加量分別為1、4和6 mL(補(bǔ)蒸餾水至150 mL),處理時(shí)間為168 h,其他條件與(1)相同;(3)紅糖添加量篩選:紅糖添加量為0、1和4 g,處理時(shí)間為168 h,其他條件與(1)相同。

1.2.2 復(fù)合酶單獨(dú)處理時(shí)間的確定根據(jù)復(fù)合酶使用說明中精料補(bǔ)充料的添加量0.04%進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整,將添加量定為0.4%。將20 mL酶溶液、130 mL蒸餾水與50 g秸稈試樣混勻,裝入自封袋密封。32 ℃分別處理24、36和48 h,然后將試樣轉(zhuǎn)移至鼓風(fēng)干燥箱,40 ℃干燥24 h后,用于后續(xù)試驗(yàn)與檢測。

1.2.3 植物乳桿菌單獨(dú)處理、復(fù)合酶單獨(dú)處理與混合處理的比較試驗(yàn)組1:將2 mL植物乳桿菌液、2 g紅糖、148 mL蒸餾水與50 g秸稈試樣混合均勻,裝入自封袋密封,32 ℃處理168 h;試驗(yàn)組2:將20 mL酶溶液、130 mL蒸餾水與50 g秸稈試樣混合均勻,裝入自封袋密封,32 ℃處理36 h;試驗(yàn)組3:將2 mL植物乳桿菌液、2 g紅糖、128 mL蒸餾水、20 mL酶溶液與50 g秸稈混合均勻,裝入自封袋密封,32 ℃處理168 h;對(duì)照組:加未處理秸稈試樣。試驗(yàn)結(jié)束后,將試樣轉(zhuǎn)移至鼓風(fēng)干燥箱,40 ℃干燥24 h,用于后續(xù)試驗(yàn)與檢測。上述每組處理均重復(fù)3次。

1.3 玉米秸稈的物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分分析

1.3.1 化學(xué)成分分析根據(jù)文獻(xiàn)[10]的方法測定處理前、后玉米秸稈試樣的化學(xué)成分:利用硝酸-乙醇法測定纖維素含量;利用亞氯酸鈉法測定總纖維素含量;總纖維素含量減去纖維素含量,計(jì)算得到半纖維素含量;利用硫酸兩步水解法測定酸不溶性木質(zhì)素含量;利用紫外可見分光光度計(jì)測定酸溶性木質(zhì)素含量;利用烘箱干燥法和灼燒法測定水分和灰分含量;利用苯酚-硫酸法測定總糖與還原糖含量;采用海能K1100凱氏定氮儀(濟(jì)南海能儀器股份有限公司)測定粗蛋白(CP)含量。以上測試結(jié)果均用原料秸稈干物重的百分?jǐn)?shù)表示。

1.3.2 纖維素相對(duì)結(jié)晶度分析使用Empyrean智能X射線衍射儀(荷蘭Panalytical分析儀器公司)記錄處理前、后秸稈試樣的XRD譜圖。測試條件:射線源Cu/Kα,管流40 mA,管壓40 kV,掃描范圍10°～50°,掃描速度2°·min-1。根據(jù)Segal公式[11-12]計(jì)算秸稈試樣的纖維素相對(duì)結(jié)晶度(CrI):

CrI=(I002-Iam)/I002×100%,

式中:I002為21.7°附近最高峰衍射強(qiáng)度,即結(jié)晶區(qū)與非結(jié)晶區(qū)之和(002 面衍射強(qiáng)度);Iam為18.5°處附近小峰衍射強(qiáng)度,即非結(jié)晶區(qū)強(qiáng)度。

1.4 秸稈試樣的形貌分析

將秸稈試樣轉(zhuǎn)移至鼓風(fēng)干燥箱內(nèi),105 ℃干燥6 h,取出試樣粘貼到樣品臺(tái),噴金處理,使用FEI QUATA200掃描電子顯微鏡(荷蘭FEI公司)觀察試樣的形貌變化。

1.5 玉米秸稈在瘤胃降解情況分析

根據(jù)周爽等[13]和van Soest等[14]的方法測定瘤胃降解試驗(yàn)前、后不同玉米秸稈試樣的干物質(zhì)(DM)、中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量。根據(jù)李洋等[15]的方法測定不同玉米秸稈試樣在牛瘤胃的降解率。選用3頭體重約650 kg、裝有瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛,準(zhǔn)確稱取7 g秸稈試樣裝入稱重后的尼龍袋投入牛瘤胃,每頭牛每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)平行,降解時(shí)間為24和48 h,取出測定營養(yǎng)成分,最后根據(jù)瘤胃降解參數(shù)和Excel 2018處理的數(shù)據(jù),計(jì)算DM、NDF和ADF的消失率。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0軟件的單因素方差法分析數(shù)據(jù),利用Duncan’s多重比較法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌處理對(duì)玉米秸稈化學(xué)成分的影響

從表1可見:隨著乳桿菌處理時(shí)間延長,玉米秸稈pH值下降,當(dāng)處理時(shí)間達(dá)到72 h,pH值降至4.0左右,然后趨于穩(wěn)定,表明植物乳桿菌進(jìn)入生長穩(wěn)定期;處理168 h,纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量趨于穩(wěn)定,與處理前差異顯著(P<0.05),纖維素與木質(zhì)素在纖維素、半纖維素和木質(zhì)素總含量中的占比分別提高2.1%和2.3%,半纖維素在纖維素、半纖維素和木質(zhì)素總含量中的占比降低4.7%;乳桿菌對(duì)玉米秸稈總糖含量的影響不大, 但處理72 h,還原糖含量比處理前減少69.1%(P<0.05); 除試樣1-3以外,其他檢測的8組試樣的粗蛋白含量差異不顯著(P>0.05),植物乳桿菌單獨(dú)處理不能提高玉米秸稈試樣的粗蛋白含量。當(dāng)菌液添加量低于2 mL或紅糖添加量少于2 g時(shí),處理168 h玉米秸稈的pH值不能降低至4.0,表明植物乳桿菌不能較快進(jìn)入生長穩(wěn)定期、積累乳酸,處理效果未達(dá)預(yù)期;試樣1-5、1-6、2-2、2-3和3-3的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量差異不顯著(P>0.05),因此,菌液和紅糖的最低添加量分別定為2 mL和2 g。

表1 植物乳桿菌處理對(duì)玉米秸稈化學(xué)成分的影響Table 1 The effect of Lactobacillus plantarum on chemical composition of corn straw

2.2 復(fù)合酶處理對(duì)玉米秸稈化學(xué)成分的影響

從表2可見:復(fù)合酶處理前、后秸稈木質(zhì)素和粗蛋白含量差異不顯著(P>0.05);處理24 h后,試樣的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量趨于穩(wěn)定;當(dāng)處理時(shí)間為48 h,部分處理組試樣出現(xiàn)變質(zhì)現(xiàn)象。雖然處理36 h試樣與處理24 h試樣的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量差異均不顯著(P>0.05),但處理36 h試樣與未處理試樣的纖維素、半纖維素含量差異顯著(P<0.05),所以將復(fù)合酶單獨(dú)處理時(shí)間定為36 h。

表2 復(fù)合酶處理時(shí)間對(duì)玉米秸稈化學(xué)成分的影響Table 2 The effect of treatment time of ruminant complex enzyme on chemical composition of corn straw

2.3 不同處理?xiàng)l件對(duì)玉米秸稈化學(xué)成分的影響

乳桿菌單獨(dú)處理168 h和復(fù)合酶單獨(dú)處理24～36 h,試樣纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量均趨于穩(wěn)定,將混合處理時(shí)間定為168 h。從表3可見:復(fù)合酶單獨(dú)處理試樣與未處理試樣相比,纖維素與木質(zhì)素含量差異均不顯著(P>0.05);混合處理試樣與未處理試樣相比,纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量差異顯著(P<0.05),纖維素與木質(zhì)素含量分別提高7.4%和7.7%,半纖維素含量降低4.0%;與其他3組試樣相比,混合處理試樣的纖維素在纖維素、半纖維素和木質(zhì)素中的質(zhì)量占比提高量最大,半纖維素的質(zhì)量占比降低量最大;復(fù)合酶單獨(dú)處理與混合處理均不能提高試樣的粗蛋白含量。

表3 不同處理對(duì)玉米秸稈化學(xué)成分的影響Table 3 The effect of different treatment conditions on chemical composition of corn straw

2.4 玉米秸稈營養(yǎng)成分的瘤胃降解情況

從表4可見:與處理Ⅰ相比,處理Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的DM 24 h消失率分別提高36.0%、6.9%和44.7%,48 h消失率分別提高9.9%、3.6%和14.2%;NDF 24 h消失率分別提高21.2%、5.9%和42.1%,48 h消失率分別提高15.0%、1.9%和16.4%;ADF 24 h消失率分別提高25.6%、15.5%和28.3%,48 h消失率分別提高10.7%、3.3%和16.7%。與其他處理相比,混合處理對(duì)玉米秸稈試樣DM、NDF和ADF消失率的提高效果最為顯著。

表4 不同處理玉米秸稈干物質(zhì)(DM)、中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)的消失率Table 4 The disappearance rate of dry matter(DM),neutral detergent fiber(NDF)and aciddetergent fiber(ADF)of different treated corn straw samples

2.5 不同處理玉米秸稈的SEM分析

從圖1可見:處理Ⅰ的結(jié)構(gòu)致密,纖維表面光滑、平整;與處理Ⅰ相比,處理Ⅳ的纖維表面較為粗糙,表面孔洞數(shù)量增加,形成較大裂痕及間隙,在秸稈表面觀察到植物乳桿菌菌體。

圖1 未處理和混合處理玉米秸稈試樣的掃描電鏡圖Fig.1 Scanning electron microscopy of the untreated and mixed treated corn straw samples A. 玉米秸稈試樣Ⅰ(×300)Corn straw sample Ⅰ(×300);B. 玉米秸稈試樣Ⅳ(×300)Corn straw sample Ⅳ(×300);C. 玉米秸稈試樣Ⅰ(×3 000)Corn straw sample Ⅰ(×3 000);D. 玉米秸稈試樣Ⅳ(×3 000)Corn straw sample Ⅳ(×3 000).

圖2 不同處理玉米秸稈的X-射線衍射儀(XRD)譜圖Fig.2 X-ray diffraction(XRD)spectra of different treated corn straw samples

2.6 不同處理玉米秸稈的纖維素相對(duì)結(jié)晶度

從圖2可見:處理Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ在18.5°處的衍射峰強(qiáng)度分別為14 370、16 431、13 293和13 419,在21.7 °處的衍射峰強(qiáng)度分別為21 488、25 976、17 878和19 125。根據(jù) Segal公式計(jì)算,處理Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的CrI值分別為33.13%、36.75%、25.65%和29.84%。結(jié)果表明,混合處理和復(fù)合酶單獨(dú)處理均可以降低玉米秸稈試樣的纖維素相對(duì)結(jié)晶度。

3 討論

本研究表明:采用植物乳桿菌單獨(dú)處理玉米秸稈0～72 h,試樣的pH值顯著下降,還原糖含量顯著降低,表明植物乳桿菌在生長繁殖過程中利用了來源于紅糖和還原糖的碳源,乳酸積累導(dǎo)致pH值降低。處理72 h,試樣的還原糖含量降低至0.30%左右,處理120 h半纖維素含量顯著下降。Garde等[16]研究發(fā)現(xiàn),短乳桿菌和戊糖乳桿菌可以轉(zhuǎn)化利用木糖和阿拉伯糖。Zhao等[17]研究發(fā)現(xiàn),半纖維素在酸性條件下易降解為木聚糖,而植物乳桿菌可以轉(zhuǎn)化利用木聚糖。因此,試樣還原糖近乎消耗殆盡后,植物乳桿菌開始利用來源于半纖維素的碳源。半纖維素降解可以導(dǎo)致木質(zhì)纖維基質(zhì)產(chǎn)生孔洞和間隙,比表面積增大[18]。因此,試樣半纖維素含量降低提高了瘤胃微生物對(duì)纖維素組分的降解效率。粗飼料NDF的瘤胃消失率越高,表明反芻動(dòng)物對(duì)營養(yǎng)成分的消化利用率越好[19-20]。植物乳桿菌處理24和48 h試樣NDF消失率分別提高21.2%和15.0%。本研究結(jié)果與劉晶晶等[21]的乳酸菌發(fā)酵有利于提高秸稈飼料的家畜消化率一致。

采用復(fù)合酶單獨(dú)處理玉米秸稈,試樣的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素在纖維素、半纖維素和木質(zhì)素總質(zhì)量中的占比變化不大,但纖維素相對(duì)結(jié)晶度降低了18.2%,處理24 h和48 h的NDF消失率分別提高5.9%和1.9%。馬歡等[22]研究發(fā)現(xiàn),纖維素的無定形區(qū)比結(jié)晶區(qū)更容易被生物轉(zhuǎn)化或化學(xué)降解。張俊等[23]研究表明,纖維素酶可以降低纖維素的相對(duì)結(jié)晶度,從而使纖維素更容易發(fā)生降解。因此,本研究試樣NDF消失率的提高可以歸因于復(fù)合酶處理降低了玉米秸稈纖維素的相對(duì)結(jié)晶度。

與未處理、乳桿菌單獨(dú)處理和復(fù)合酶單獨(dú)處理相比,混合處理試樣的NDF 48 h消失率分別提高16.4%、1.2%和14.2%,特別是NDF 24 h消失率分別提高42.1%、5.9%和21.2%,表明混合處理試樣更容易被動(dòng)物快速消化利用。復(fù)合酶在混合處理過程中的作用:降低試樣纖維素的相對(duì)結(jié)晶度,提高瘤胃微生物對(duì)纖維素組分的降解效率;試樣相對(duì)結(jié)晶度降低可以提高植物乳桿菌對(duì)秸稈木質(zhì)纖維基質(zhì)的處理效率。值得注意的是,混合處理試樣的纖維素相對(duì)結(jié)晶度高于復(fù)合酶單獨(dú)處理試樣。任海偉等[24]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)玉米秸稈纖維素結(jié)晶區(qū)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定形區(qū)后,秸稈更容易被生物轉(zhuǎn)化為沼氣。然而,姚蘭等[25]研究發(fā)現(xiàn),稀酸處理可以破壞纖維素的無定形區(qū),使氫鍵重排,發(fā)生重結(jié)晶現(xiàn)象,導(dǎo)致纖維素相對(duì)結(jié)晶度提高,但稀酸處理試樣的纖維素酶解轉(zhuǎn)化率仍然有所提高。此外,一些研究發(fā)現(xiàn)農(nóng)作物秸稈中木質(zhì)素和半纖維素含量的改變會(huì)對(duì)纖維素相對(duì)結(jié)晶度的測定值產(chǎn)生影響[26-27]。因此,玉米秸稈木質(zhì)纖維的實(shí)際降解效率由其化學(xué)組分、化學(xué)結(jié)構(gòu)和纖維形態(tài)等多因素共同決定。

綜上所述,玉米秸稈的混合處理?xiàng)l件為8×108CFU·mL-1植物乳桿菌液2 mL,紅糖2 g,蒸餾水128 mL,0.01 g·mL-1復(fù)合酶溶液20 mL,秸稈50 g,混勻后密封在自封袋中,32 ℃處理168 h。混合處理后,秸稈試樣在瘤胃中的DM、NDF和ADF的24和48 h消失率均顯著提高,處理后秸稈試樣的氣味酸香,飼料化利用價(jià)值顯著提高。