飼糧中添加染料木黃酮對產(chǎn)蛋后期種母雞繁殖性能的影響

魏全偉,呂增鵬,胡晨輝,戴宏建,李思夢,孫濤,石放雄*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,江蘇 南京 210095;2.德州市陵城區(qū)畜牧獸醫(yī)服務(wù)中心,山東 德州 253500)

蛋雞產(chǎn)蛋高峰期過后,產(chǎn)蛋性能逐步降低,這在地方品種種母雞上表現(xiàn)特別明顯。產(chǎn)蛋后期蛋雞卵巢功能衰退、雌激素水平下降是造成產(chǎn)蛋性能急劇下降的主要原因[1]。因此,研究植物源雌激素對產(chǎn)蛋后期種母雞繁殖性能的影響,對于提高種母雞的利用率,延遲下架時間,提高經(jīng)濟效益具有重要意義。

染料木黃酮是一種異黃酮類植物提取物,廣泛存在于豆科植物中,結(jié)構(gòu)與雌激素類似。染料木黃酮在一定劑量范圍內(nèi)能夠與雌激素受體結(jié)合,發(fā)揮類雌激素作用[2]。研究表明,植物雌激素能夠參與機體代謝,調(diào)節(jié)體內(nèi)生殖激素合成和分泌[3]。染料木黃酮具有多酚羥基的分子結(jié)構(gòu),可以消除機體內(nèi)多種自由基,是抗氧化能力最強的大豆異黃酮,經(jīng)常在試驗中被用作抗氧化劑[4]。據(jù)此,我們推測染料木黃酮能夠改善卵巢抗氧化能力和生殖功能,提高蛋雞的繁殖性能。本試驗在日糧中添加染料木黃酮,旨在闡明其對產(chǎn)蛋后期種母雞繁殖性能和卵巢抗氧化能力的作用,對于開發(fā)染料木黃酮作為新型種母雞飼料添加劑具有重要參考價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試驗動物

染料木黃酮:提取自金雀花,純度98%(西安凱萌生物技術(shù)有限公司)。試驗動物選用棲嶺草雞種母雞,基礎(chǔ)日糧參照中國雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(2004)配制成粉狀全價料?；A(chǔ)日糧配方及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成和營養(yǎng)組成水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets(air dry basis) %

1.2 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

動物飼養(yǎng)試驗地點為江蘇三德利牧業(yè)發(fā)展有限公司土山種雞場,試驗流程嚴(yán)格按照南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物福利委員會相關(guān)規(guī)定進行。試驗選用體重和生理狀態(tài)相近的58周齡棲嶺草雞180只,隨機分為3組:對照組(Con)、低劑量染料木黃酮組(L-Gen)、高劑量染料木黃酮組(H-Gen),每組5個重復(fù),每重復(fù)12只雞。采用負(fù)壓通風(fēng)的雞舍常規(guī)階梯式籠養(yǎng),每籠3只雞。對照組喂養(yǎng)玉米-豆粕型基礎(chǔ)日糧。L-Gen組和H-Gen組在基礎(chǔ)日糧中分別添加20和40 mg·kg-1染料木黃酮,添加劑量參照相關(guān)文獻[5-6]設(shè)定。預(yù)飼期2周,統(tǒng)一飼喂對照組日糧,期間根據(jù)產(chǎn)蛋率進行適當(dāng)調(diào)整,保證每個重復(fù)產(chǎn)蛋率接近。正式試驗從60周齡開始,連續(xù)進行28 d,每只雞每天給料112 g,自由飲水,采用正常人工輸精。雞舍采用光照16 h和黑暗8 h的照明程序,相對濕度(50±5)%,溫度(25±3)℃。

1.3 樣品采集

試驗第28天,每個重復(fù)中隨機選擇2只雞翅靜脈采血,靜脈放血處死。收集血液,4 ℃靜置12 h后,低溫下3 000 r·min-1離心10 min,得到血清并保存于-30 ℃用于分析。此外,采集下丘腦、卵巢組織和小黃卵泡樣品迅速置于液氮,-80 ℃保存用于分析。

1.4 產(chǎn)蛋性能測定及蛋品質(zhì)測定

每天記錄每個重復(fù)的產(chǎn)蛋數(shù)、蛋重,計算試驗期間每周產(chǎn)蛋率、平均蛋重。產(chǎn)蛋率=每周產(chǎn)蛋總蛋數(shù)/(種雞數(shù)×7)×100%。試驗最后1天從每個重復(fù)中隨機抽取10枚種蛋,測定蛋白高度、蛋殼強度、哈氏單位、蛋黃色澤、蛋黃重、蛋殼厚度。稱取蛋重后,采用蛋品質(zhì)檢測儀(奧卡,美國)檢測蛋殼強度。將蛋殼去除殼膜后,用游標(biāo)卡尺分別測量蛋殼大、中、小端的蛋殼厚度3次,然后取平均數(shù)。采用羅氏比色扇進行等級比色,確定蛋黃色澤等級。蛋黃稱重后,用蛋白高度檢測儀(奧卡,美國)檢測蛋白高度,計算哈氏單位:哈氏單位=100 lg(蛋白高度-1.7×蛋重×0.37+7.57)。

1.5 血清中雌二醇和孕酮含量測定

采用放免法(RIA)試劑盒(上海生工生物工程有限公司)檢測血清中雌二醇和孕酮的含量。血漿中的雌二醇、孕酮抗原與I125-E2、I125-P4抗體競爭結(jié)合,形成抗原抗體復(fù)合物。加入免疫分離劑,靜置30 min使免疫復(fù)合物沉淀出來,4 ℃條件下3 600 r·min-1離心20 min,棄上清液,用γ計數(shù)儀測量沉淀的放射性計數(shù)。雌二醇、孕酮濃度與I125標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物呈負(fù)相關(guān)的函數(shù)關(guān)系,并表現(xiàn)在劑量反應(yīng)曲線上,以該曲線為依據(jù)即可對樣品進行定量。

1.6 基因表達檢測

取100 mg下丘腦和卵巢組織樣品加入1 mL Trizol提取液(Invitrogen),按照試劑盒說明書提取總RNA。提取的總RNA用核酸分光光度計(AG 22331,Eppendorf)檢測其純度。取1 μg總RNA加入20 μL反應(yīng)體系,采用M-MLV cDNA試劑盒(Invitrogen)進行反轉(zhuǎn)錄。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1∶1稀釋后,選用SYBR?Select Master Mix PCR Kit并按照說明書進行RT-PCR操作,反應(yīng)儀器為7500熒光檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems,USA)。目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列如表2所示。PCR程序:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán)。使用熔解曲線驗證單個產(chǎn)品的擴增。對內(nèi)參基因GADPH標(biāo)準(zhǔn)化后,采用2-ΔΔCT法分析基因相對表達水平。

表2 基因的引物序列Table 2 The primer sequence of genes

1.7 卵巢抗氧化能力檢測

取卵巢組織1 g,4 ℃勻漿1 min,在4 ℃條件下12 000 r·min-1離心10 min。使用BCA試劑盒測量蛋白濃度后,采用試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)檢測總超氧化物歧化酶(SOD)活性和總抗氧化能力(T-AOC)。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

圖1 染料木黃酮對種母雞生產(chǎn)性能的影響(n=5)Fig.1 Effects of genistein on the laying performance of breeder hens Control:對照組Control group;L-Gen:20 mg·kg-1染料木黃酮組20 mg·kg-1 genistein group;H-Gen:40 mg·kg-1染料木黃酮組40 mg·kg-1 genistein group. 下同The same as follows. *表示與對照組相比具有顯著差異(P<0.05)。 *indicates significant difference compared with control group(P<0.05).

2 結(jié)果與分析

2.1 染料木黃酮對生產(chǎn)性能的影響

飼糧中添加染料木黃酮對產(chǎn)蛋后期種母雞產(chǎn)蛋率的影響如圖1所示:試驗第2周開始,H-Gen組種母雞產(chǎn)蛋率高于對照組(P=0.074),第3、4周產(chǎn)蛋率顯著高于對照組(P<0.05)。此外,L-Gen組平均蛋重在第3、4周時較對照組顯著增加;H-Gen組在第4周平均蛋重顯著高于對照組(P<0.05)。

2.2 染料木黃酮對種蛋品質(zhì)的影響

如表3所示:種母雞飼糧中添加染料木黃酮對于種蛋的蛋白高度、哈氏單位、蛋黃重均沒有顯著影響。L-Gen組和H-Gen組蛋殼強度和蛋黃色澤等級相比對照組顯著提高(P<0.05)。此外,相比于對照組,L-Gen處理顯著增加蛋殼厚度(P<0.05)。

表3 染料木黃酮對種母雞蛋品質(zhì)的影響(n=5)Table 3 Effects of genistein on egg quality of breeder hens

2.3 染料木黃酮對血清雌激素和孕酮含量的影響

如圖2所示:L-Gen組血清中雌激素(P=0.079)和孕酮(P=0.098)含量與對照組相比有提高的趨勢;H-Gen 組血清中雌激素和孕酮含量與對照組相比顯著提高(P<0.05)。

圖2 染料木黃酮對種母雞血清中雌激素、孕酮含量的影響(n=8)Fig.2 Effects of genistein on the serum estrogen and progesterone content

2.4 染料木黃酮對卵泡中雌激素受體mRNA表達水平的影響

圖3 染料木黃酮對種母雞卵泡中雌激素受體 基因mRNA表達水平的影響Fig.3 Effects of genistein on the estrogen receptor gene(ER)mRNA expression level in the ovarian follicle

如圖3所示:飼糧中添加20或40 mg·kg-1染料木黃酮均顯著提高了種母雞小黃卵泡中ERαmRNA表達水平(P<0.05);L-Gen組小黃卵泡中ERβmRNA表達水平較對照組顯著上調(diào)(P<0.05)。

2.5 染料木黃酮對下丘腦GnRH和卵泡FSHR、LHR mRNA表達水平的影響

如圖4所示:L-Gen組種母雞下丘腦GnRH(促性腺激素釋放激素)基因的mRNA表達水平顯著高于對照組(P<0.05)。同時,染料木黃酮處理組小黃卵泡FSHR(卵泡刺激素受體)mRNA相對于對照組表達水平顯著上調(diào)(圖4,P<0.05)。染料木黃酮處理對小黃卵泡LHR(黃體生成素受體)mRNA表達水平?jīng)]有影響。

圖4 染料木黃酮對下丘腦中GnRH基因和卵泡中激素受體FSHR、LHR基因mRNA表達的影響Fig.4 Effects of genistein on the mRNA expression of GnRH gene in the hypothalamus,and FSHR, LHR genes in the ovarian follicle

2.6 染料木黃酮對卵巢抗氧化能力的影響

從圖5中可以看出:飼糧中添加染料木黃酮顯著提高種母雞卵巢組織中SOD活性(P<0.05)。此外,L-Gen組和 H-Gen 組卵巢組織中的T-AOC含量也顯著高于對照組(P<0.05)。

圖5 染料木黃酮對種母雞卵巢超氧化物歧化酶(SOD)活性和總抗氧化能力的影響Fig.5 Effect of genistein on SOD activity and total antioxidative capability(T-AOC)of ovary

3 討論

3.1 染料木黃酮對產(chǎn)蛋后期種母雞生產(chǎn)性能的影響

大量研究表明,飼糧中添加大豆異黃酮能夠提高家禽的生產(chǎn)性能[7-8]。曹滿湖等[7]研究表明,在產(chǎn)蛋后期海蘭褐蛋雞飼糧中添加大豆異黃酮4周后,產(chǎn)蛋率和卵巢內(nèi)卵泡數(shù)量顯著提高。染料木黃酮結(jié)構(gòu)與雌激素相似,在大豆異黃酮中具有最強的類雌激素功效。本研究結(jié)果表明,飼糧中添加40 mg·kg-1染料木黃酮顯著提高產(chǎn)蛋后期棲嶺草雞的產(chǎn)蛋率;飼糧中添加20 mg·kg-1染料木黃酮4周后,平均蛋重顯著提高。周玉傳等[8]研究也表明,飼糧中添加染料木黃酮顯著提高紹興鴨產(chǎn)蛋率,降低料蛋比。我們推測這可能與染料木黃酮類雌激素參與到機體生殖激素調(diào)控,改善卵巢功能有關(guān)。

3.2 染料木黃酮對產(chǎn)蛋后期種母雞蛋品質(zhì)的影響

大量的鈣在蛋雞腸道被吸收后運送到輸卵管殼腺部,從而形成蛋殼。因此,蛋殼品質(zhì)與鈣的吸收和利用密切相關(guān)。據(jù)報道,在飼糧中添加染料木黃酮可以提高機體對鈣的吸收,提高血清中鈣濃度[9],增加殼腺形成過程中鈣的沉積量[10]。在鵪鶉的飼養(yǎng)試驗中發(fā)現(xiàn),飼糧中添加800 mg·kg-1的染料木黃酮顯著提高蛋殼厚度、蛋殼重和哈氏單位[11]。本試驗中染料木黃酮提高種雞蛋殼強度和蛋殼厚度的結(jié)果與之相一致。此外,染料木黃酮處理組蛋黃顏色較對照組顯著加深,這表明染料木黃酮已沉積在雞蛋中,這與Saitoh等[12]的報道一致。因此,飼糧中添加染料木黃酮能夠提高產(chǎn)蛋后期種雞的蛋品質(zhì)。

3.3 染料木黃酮對產(chǎn)蛋后期種母雞血清中雌激素和孕酮含量的影響

家禽的生殖功能是受內(nèi)分泌調(diào)控的復(fù)雜生理過程,下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)控發(fā)揮著重要作用。下丘腦分泌的GnRH,垂體分泌的LH、FSH以及卵巢分泌的雌激素、孕酮共同參與生殖調(diào)控[13]。本試驗結(jié)果表明,種母雞飼糧中添加40 mg·kg-1染料木黃酮顯著提高血清中雌激素、孕酮含量,這與產(chǎn)蛋率提高的結(jié)果相一致。雌激素和孕酮對顆粒細(xì)胞的發(fā)育具有重要的調(diào)控作用,而顆粒細(xì)胞的發(fā)育狀況直接決定卵泡的生長、選擇和閉鎖[14]。據(jù)報道,血清中生殖激素的變化可能是由于染料木黃酮激活下丘腦-垂體-性腺軸,促進雌激素分泌,進而促進孕酮分泌引起的[15]。本試驗進一步檢測發(fā)現(xiàn),染料木黃酮處理顯著上調(diào)下丘腦GnRHmRNA的表達水平。這進一步驗證了染料木黃酮通過激活丘腦-垂體-性腺軸參與機體生殖激素調(diào)控。

3.4 染料木黃酮對產(chǎn)蛋后期種母雞卵泡中ER和FSHR的影響

母雞卵巢內(nèi)只有極少的卵泡能夠發(fā)育成熟然后排卵,絕大多數(shù)的卵泡最終都會發(fā)生閉鎖。禽類卵泡按照嚴(yán)格的等級體系順序發(fā)育,每天有1個大黃卵泡成熟后排出,同時會有1個小黃卵泡被選中進入等級體系。在整個過程中,被選入進入排卵前等級體系小黃卵泡的發(fā)育極其重要。產(chǎn)蛋后期家禽產(chǎn)蛋率下降的主要原因是小黃卵泡的數(shù)量減少[16]。本研究發(fā)現(xiàn),在種母雞飼糧中分別加入20和40 mg·kg-1染料木黃酮4周后,小黃卵泡中FSHR、ERα和ERβmRNA表達水平較對照組顯著提高。筆者前期研究表明,飼糧中添加染料木黃酮能夠提高種母雞血清中FSH水平[17]。FSH是促進卵泡發(fā)育的重要生殖激素,能夠激活FSHR,促進卵巢血液循環(huán),增加卵泡壁的攝氧量,促進卵黃物質(zhì)的沉積和卵泡質(zhì)量的增加,減少卵泡閉鎖。ER則通過對卵巢直接作用和在下丘腦-垂體軸的負(fù)反饋作用2條途徑調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育和排卵[18]。下丘腦內(nèi)的GnRH作為調(diào)控垂體分泌FSH的重要激素,其表達水平的提高可能是引起FSHR和ER水平變化的主要原因。

3.5 染料木黃酮對產(chǎn)蛋后期種母雞卵巢抗氧化能力的影響

隨著年齡增長,雌激素水平下降,緩解卵巢氧化應(yīng)激的作用降低[19]。組織內(nèi)自由基聚集導(dǎo)致的氧化應(yīng)激是卵巢功能衰退的重要誘因之一[20]。年齡相關(guān)的卵母細(xì)胞退化伴隨著自由基過量,導(dǎo)致線粒體功能失常,對細(xì)胞造成的損傷加劇[21]。飼糧中添加抗氧化劑來減少氧化應(yīng)激對機體的損傷,已經(jīng)成為一種重要的營養(yǎng)調(diào)控手段。染料木黃酮結(jié)構(gòu)中的酚羥基能夠作為氫供體結(jié)合氧自由基,緩解氧化應(yīng)激。研究表明,染料木黃酮處理體外培養(yǎng)的牛乳腺上皮細(xì)胞,可顯著提高其抗氧化能力,減少丙二醛含量[22]。臧長江等[23]研究發(fā)現(xiàn),在伊犁母馬飼料中添加染料木黃酮可以顯著提高機體的抗氧化能力。在本試驗中,給種母雞飼糧中分別添加20和40 mg·kg-1染料木黃酮顯著提高卵巢組織的T-AOC含量,增強卵巢的抗氧化能力,這與卵巢雌激素等分泌功能增強相一致。前人報道,染料木黃酮能夠結(jié)合在雌激素受體,激活ERK1/2和NFκB信號通路,從而上調(diào)MCF-7細(xì)胞的MnSOD基因表達[24]。在本研究飼糧中添加染料木黃酮顯著提高卵巢組織SOD活性。總之,飼糧中添加染料木黃酮可能通過提高機體抗氧化能力改善產(chǎn)蛋后期蛋雞卵巢功能。

綜上,產(chǎn)蛋后期種母雞飼糧中添加染料木黃酮能提高血清中雌激素和孕酮含量,上調(diào)下丘腦GnRH表達水平以及卵泡中FSHR和ERαmRNA表達水平,提高卵巢抗氧化能力,從而改善產(chǎn)蛋性能和蛋品質(zhì)。40 mg·kg-1染料木黃酮添加水平對于改善種母雞產(chǎn)蛋性能的效果更佳。