碳酸酐酶對豬鏈球菌生長及抗氧化應(yīng)激的影響

陳琳,王碩玥,姚火春,吳宗福

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

豬鏈球菌(Streptococcussuis)是豬的重要細(xì)菌性病原,可引致豬的敗血癥、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎等癥狀,在全球范圍內(nèi)對養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失;豬鏈球菌還是重要的人畜共患病病原,可導(dǎo)致生豬從業(yè)人員感染或致病。豬鏈球菌血清型眾多,根據(jù)不同莢膜多糖的抗原性,可分為29種傳統(tǒng)血清型(1～19、21、23～25、27～31、1/2)、Chz血清型、26種新莢膜基因簇菌株(NCL1～26)及部分未定型菌株,其中血清2型對人和豬的致病性最強(qiáng)[1-5]。

本課題組前期通過比較蛋白組學(xué)方法發(fā)現(xiàn),豬鏈球菌碳酸酐酶(S.suiscarbonic anhydrase,SCA)在H2O2處理組顯著上調(diào)表達(dá),提示其參與豬鏈球菌抗氧化應(yīng)激[16]。通過NCBI序列比對,發(fā)現(xiàn)sca在至今已公布的67株豬鏈球菌全基因組中均有分布,但其在豬鏈球菌中的生物學(xué)功能及在致病中的作用未見報(bào)道。本試驗(yàn)構(gòu)建sca無痕缺失株,比較野生株與缺失株在不同條件下的生長能力,以及通過H2O2應(yīng)激、小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬與存活、豬全血存活等試驗(yàn)闡明其在豬鏈球菌抗氧化應(yīng)激中的作用,為深入了解豬鏈球菌致病機(jī)制及防控該類疫病提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

THB培養(yǎng)基購自美國BD公司;綿羊血購自北京鼎國生物科技有限公司;DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)培養(yǎng)基購自美國Thermo Fisher Scientific公司;胎牛血清購自美國Gibco公司;2×Rapid Taq Master Mix、DNA片段回收試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 菌株、細(xì)胞和培養(yǎng)條件

豬鏈球菌2型野生株SC070731由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)豬鏈球菌病參考實(shí)驗(yàn)室保存,分離自患腦膜炎病豬[17]。豬鏈球菌在THB液體培養(yǎng)基或THB固體培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)箱或搖床(180 r·min-1)條件下培養(yǎng),需要時(shí)添加終質(zhì)量濃度100 μg·mL-1壯觀霉素(spc)。小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7(ATCCTIB-71)購自美國ATCC公司,在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3 缺失株Δsca的構(gòu)建

缺失株的構(gòu)建參照文獻(xiàn)[18],引物見表1,由南京擎科生物有限公司合成。采用兩步篩選法,第1步以壯觀霉素耐受(spc)為正向篩選,第2步以蔗糖敏感(sacB)作為反向篩選,經(jīng)染色體基因組自身同源重組完成無痕替換。

1.3.1 spc耐受正向篩選以SC070731基因組為模板,以Δsca-A/B為引物對擴(kuò)增上游同源臂AB;以sacB-F/R為引物對擴(kuò)增sacB-spc片段(sacB-spc重組基因盒由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)OIE豬鏈球菌病參考實(shí)驗(yàn)室保存,可直接用于PCR模板);以SC070731基因組為模板,以Δsca-C/D為引物對擴(kuò)增下游同源臂CD;混合AB、sacB-spc、CD片段為模板,以Δsca-A/D為引物對進(jìn)行融合PCR。PCR反應(yīng)程序:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,54 ℃ 30 s,72 ℃ 5 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。用10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳分離PCR 3段融合產(chǎn)物,使用DNA膠回收試劑盒切膠回收。挑取SC070731單菌落,于37 ℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)至對數(shù)期,按 1∶40 (體積比)轉(zhuǎn)接至4 mL THB液體培養(yǎng)基,培養(yǎng)至A600≈ 0.04～0.05(約20～60 min);取100 μL菌液,添加5 μL信號(hào)肽(GNWGTWVEE)和10 μL上述 PCR 3段融合產(chǎn)物,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)2 h,涂布TS平板(含100 μg·mL-1spc的THB固體培養(yǎng)基);次日挑取單菌落,以Δsca-G1/G2和Δsca-E1/E2為引物對進(jìn)行有痕缺失株的PCR鑒定。

表1 本試驗(yàn)所用引物序列Table 1 Primers sequences in this study

1.3.2sacB反向篩選以SC070731基因組為模板,用Δsca-A/B1為引物對擴(kuò)增上游同源臂AB1;用SC070731基因組為模板,以Δsca-C1/D為引物對擴(kuò)增下游同源臂C1D;以混合的AB1、C1D片段為模板,用Δsca-A/D為引物對進(jìn)行融合PCR。PCR反應(yīng)程序:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。用10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳分離PCR 2段融合產(chǎn)物,使用DNA膠回收試劑盒切膠回收。挑取SC070731有痕缺失株Δsca單菌落于37 ℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)至對數(shù)期,按1∶40轉(zhuǎn)接至4 mL THB液體培養(yǎng)基,培養(yǎng)至A600≈ 0.04～0.05(約20～60 min);取100 μL菌液,添加5 μL信號(hào)肽和 10 μL 上述PCR 2段融合產(chǎn)物,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)2 h,涂布于THB平板(含100 g·L-1蔗糖的THB固體培養(yǎng)基),含SacB片段的菌無法在含蔗糖的平板上生長;次日挑取單菌落以Δsca(inter)-F/R為引物對進(jìn)行無痕缺失株的PCR鑒定,且用Δsca-A/D為引物對擴(kuò)增產(chǎn)物并送至蘇州金唯智生物科技有限公司測序。

1.4 野生株和Δsca株在不同條件下生長曲線的測定

1.4.1 在CO2缺乏和CO2豐富條件下的生長曲線挑取SC070731和Δsca株單菌落,37 ℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期(A600≈0.6),按1∶100(體積比)轉(zhuǎn)接至10 mL THB液體培養(yǎng)基后,分別置于普通培養(yǎng)箱(CO2缺乏)和5% CO2培養(yǎng)箱(CO2豐富),于37 ℃條件下靜置培養(yǎng);每隔1 h測1次A600值。分別繪制各菌株的生長曲線,每個(gè)菌株3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.4.2 不同濃度NaHCO3條件下Δsca株的生長曲線挑取SC070731和Δsca株單菌落,37 ℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期,按1∶100轉(zhuǎn)接至10 mL THB液體培養(yǎng)基后,添加不同濃度的 NaHCO3于THB液體培養(yǎng)基,使NaHCO3終濃度分別為10、30和40 mmol·L-1,37 ℃條件下于普通培養(yǎng)箱(CO2缺乏)靜置培養(yǎng),每隔3 h測1次A600值。分別繪制各菌株的生長曲線,每個(gè)菌株3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.4.3 添加不同代謝中間產(chǎn)物后Δsca株的生長曲線挑取SC070731和Δsca株單菌落,37 ℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期,按1∶100轉(zhuǎn)接至10 mL THB液體培養(yǎng)基后,分別向培養(yǎng)基添加體積分?jǐn)?shù)均為0.1%的Tween-80、Tween-20、Tween-40和0.01 mmol·L-1十六烷酸、0.01 mmol·L-1油酸,37 ℃普通培養(yǎng)箱(CO2缺乏)靜置培養(yǎng),每隔3 h測1次A600。分別繪制各菌株的生長曲線,每個(gè)菌株3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.5 野生株和Δsca株抗氧化應(yīng)激能力的測定

挑取SC070731和Δsca株單菌落,37 ℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)至對數(shù)期,按1∶100轉(zhuǎn)接至5 mL THB液體培養(yǎng)基(1∶50加血清)培養(yǎng)至A600≈ 0.6。各取500 μL菌液,用THB液體培養(yǎng)基稀釋10倍至 5 mL,加入20 μL 30%(體積分?jǐn)?shù))H2O2(終濃度40 mmol·L-1),37 ℃條件下置5% CO2培養(yǎng)箱20 min后,取 100 μL 用PBS(pH7.2)進(jìn)行10倍比稀釋;選擇3個(gè)合適濃度,涂布THB平板并進(jìn)行計(jì)數(shù)。陰性對照不添加H2O2,處理步驟同上。相對存活率=活菌數(shù)20 min/活菌數(shù)0 min。每個(gè)菌株3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.6 野生株和Δsca株抗吞噬與存活能力的測定

挑取SC070731和Δsca株單菌落,37 ℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)至A600≈0.6,按1∶100轉(zhuǎn)接5 mL THB液體培養(yǎng)基,培養(yǎng)至A600≈0.6。各取5 mL菌液,4 ℃、8 000 r· min-1離心5 min后,用PBS(pH7.2)洗滌2次,DMEM重懸至A600≈0.6。取(5.0～7.0)×105mL-1RAW264.7細(xì)胞鋪入24孔板(每孔中有500 μL含10%血清的DMEM培養(yǎng)液),生長12～18 h。吸棄培養(yǎng)液,DMEM洗滌3次后,用臺(tái)盼藍(lán)法計(jì)算每孔所含的細(xì)胞數(shù),并以感染比(細(xì)菌∶細(xì)胞)≈ 20∶1將菌液分別添加到24孔板中。37 ℃、800 r·min-1離心10 min后,37 ℃條件下置5% CO2培養(yǎng)箱孵育1 h。用不含血清的DMEM將RAW267.4細(xì)胞洗滌3次后,在含100 μg·mL-1慶大霉素和5 μg· mL-1青霉素的DMEM培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)1和3 h,洗滌3次后,加1 mL ddH2O形成低滲條件,使細(xì)胞脹裂后,對每孔進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。吞噬率為抗生素處理1 h后巨噬細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌數(shù)占原始接菌數(shù)的比值。將抗生素處理1 h后的巨噬細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)作為100%,計(jì)算3 h細(xì)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活率。胞內(nèi)存活率=活菌數(shù)3 h/活菌數(shù)1 h。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 野生株和Δsca株在豬全血中存活能力的測定

采集經(jīng)ELISA檢測豬鏈球菌抗體為陰性的健康豬血液備用。挑取SC070731和Δsca株單菌落,37 ℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)至A600≈0.6,按1∶100轉(zhuǎn)接至5 mL THB液體培養(yǎng)基,再培養(yǎng)至A600≈0.6。各取1 mL菌液,4 ℃、8 000 r·min-1離心5 min,用PBS(pH7.2)洗滌2次;用適量PBS(pH7.2)重懸細(xì)菌,使細(xì)菌量達(dá)到 5.0×106CFU·mL-1;取一部分菌液進(jìn)行倍比稀釋,以確認(rèn)加入血液中的細(xì)菌數(shù);另取0.1 mL細(xì)菌懸液與0.9 mL新鮮豬血液混勻于2 mL EP管,37 ℃條件下置5% CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng),每隔15 min上下顛倒輕緩混勻1次,1 h后取0.1 mL全血培養(yǎng)物進(jìn)行倍比稀釋,涂THB平板計(jì)數(shù),以確認(rèn)細(xì)菌在豬血液中的存活率;將細(xì)菌懸液與THB液體培養(yǎng)基在上述同等條件下孵育作為陰性對照。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 缺失株Δsca的構(gòu)建和鑒定

采用兩步篩選法構(gòu)建缺失株Δsca。用引物對Δsca(inter)-F/R擴(kuò)增sca基因內(nèi)部片段,野生株SC070731能擴(kuò)增出495 bp片段,Δsca株不能擴(kuò)增出該片段(圖1-A)。用引物對Δsca-A/D區(qū)分野生株和Δsca株,野生株SC070731能擴(kuò)增出2 414 bp片段,Δsca株能擴(kuò)增出1 919 bp片段(圖1-B)。上述結(jié)果表明,Δsca株構(gòu)建成功。

圖1 不同引物對缺失株Δsca的PCR鑒定Fig.1 PCR identification of Δsca strain by different primer pairs A. 引物對Δsca(inter)-F/R擴(kuò)增sca基因內(nèi)部片段(M. Marker;1. Δsca株;2. 野生株SC070731)。B. 引物對Δsca-A/D區(qū)分野生株和缺失株(M. Marker;4、6. Δsca株;1、2、3、5. SC070731)。A. The primer pairs Δsca(inter)-F/R amplified the internal fragment of sca(M. Marker;1. Δsca strain;2. The wild-type strain SC070731). B. The primer pairs Δsca-A/D identified the wild-type strain and the deletion mutant strain(M. Marker;4,6. Δsca strain;1,2,3,5. SC070731).

2.2 SCA對豬鏈球菌生長的影響

如圖2-A所示:Δsca株在CO2缺乏下的生長受到顯著抑制,生長12 h后A600值低于0.5。如圖2-B所示:在5% CO2下,雖然Δsca株的遲緩期(接種后0～4 h)較野生株長,但平臺(tái)期(接種后10 h)的生長水平基本恢復(fù)到與野生株相同的水平,生長12 h后A600值均接近1.6。

從圖2-C可知:隨著培養(yǎng)基中NaHCO3濃度的提高,Δsca株在CO2缺乏條件下的生長逐漸增強(qiáng),與NaHCO3濃度呈正相關(guān)。由圖2-D可知:在CO2缺乏下,分別添加0.01 mmol·L-1不飽和脂肪酸(UFA)油酸或0.1% Tween-80、0.1% Tween-20等UFA衍生物后顯著促進(jìn)Δsca株生長;而分別添加0.1% Tween-40、0.01 mmol·L-1十六烷酸等飽和脂肪酸衍生物對Δsca株的生長沒有影響。

圖2 SC070731和Δsca株在不同條件下的生長曲線Fig.2 The growth curve of SC070731 and Δsca strain under different conditions A. CO2缺乏,SC070731和Δsca株的生長曲線;B. 5% CO2下SC070731和Δsca株的生長曲線;C. CO2缺乏,添加不同濃度NaHCO3后Δsca株的生長曲線;D. CO2缺乏,添加不飽和脂肪酸及其衍生物后Δsca株的生長曲線。A. The growth curves of SC070731 and Δsca strain in the absence of CO2;B. The growth curves of SC070731 and Δsca strain under 5% CO2;C. In the absence of CO2,the growth curves of Δsca strain after adding different concentrations of NaHCO3;D. In the absence of CO2,the growth curves of Δsca strain after adding unsaturated fatty acid(UFA)or UFA derivatives.

圖3 SCA對SC070731抗氧化應(yīng)激能力的影響Fig.3 The effects of SCA on the oxidative stress response of SC070731 A. 40 mmol·L-1 H2O2作用20 min,SC070731和Δsca株在THB液體培養(yǎng)基中的存活率;B. SC070731和Δsca株在不添加H2O2的THB液體培養(yǎng)基中孵育20 min的生長率(陰性對照)。 **P<0.01。下同。A. After 40 mmol·L-1H2O2 treatment for 20 min,the survival rates of SC070731 and Δsca strain in THB liquid medium;B. The growth rates of SC070731 and Δsca strain in THB liquid medium without H2O2 for 20 min(negative control). **P<0.01. The same bellow.

2.3 SCA對豬鏈球菌抗氧化應(yīng)激能力的影響

在40 mmol·L-1H2O2的THB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱作用20 min后,野生株SC070731存活率為99.48%,而Δsca株存活率極顯著降低,為74.04%(P<0.01)(圖3-A)。陰性對照顯示,野生株SC070731和Δsca株在不添加H2O2的THB液體培養(yǎng)基孵育20 min后,生長無顯著性差異(圖3-B)。證明SCA參與豬鏈球菌的抗氧化應(yīng)激。

2.4 SCA對豬鏈球菌抗巨噬細(xì)胞吞噬與存活能力的影響

產(chǎn)生活性氧是巨噬細(xì)胞殺菌的主要方式之一。采用小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7,探究SCA對豬鏈球菌抗巨噬細(xì)胞吞噬能力以及對在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活能力的影響。如圖4-A所示:RAW264.7細(xì)胞對野生株SC070731和Δsca株的吞噬率無顯著差異(P>0.05)。存活試驗(yàn)(圖4-B)顯示:經(jīng)抗生素處理3 h后,野生株SC070731的存活率為77.98%,而Δsca株的存活率顯著下降,僅為38.93%(P<0.01)。證明SCA不是豬鏈球菌的抗吞噬因子,其主要通過抗氧化應(yīng)激的方式促進(jìn)豬鏈球菌在巨噬細(xì)胞中存活。

圖4 SC070731和Δsca株的RAW264.7吞噬(A)與存活(B)試驗(yàn)Fig.4 RAW264.7 phagocytosis(A)and survival(B)assay of SC070731 and Δsca strain

2.5 SCA對豬鏈球菌在豬全血中存活能力的影響

為引起宿主致病,豬鏈球菌首先必須要能在宿主血液中存活[19],且產(chǎn)生活性氧是血液中的免疫活性細(xì)胞殺菌的主要方式之一。如圖5-A所示:在豬血液中孵育1 h,野生株的存活率為110.02%,表明其不僅可抵抗血液中免疫活性細(xì)胞清除,還可生長;而Δsca株的存活能力極顯著下降,僅為51.39%(P<0.01)。陰性對照(圖5-B)顯示,野生株SC070731和Δsca株在THB液體培養(yǎng)基中孵育1 h,生長無顯著性差異。證明SCA與豬鏈球菌在豬血液中存活相關(guān)。

圖5 SCA對SC070731在豬全血中存活能力的影響Fig.5 The effects of SCA on survival ability of SC070731 in pig blood A. 在健康豬血液中孵育1 h的存活率;B. 在THB液體培養(yǎng)基中孵育1 h的生長率(陰性對照)。A. The survival rates of SC070731 and Δsca strain in pig blood after incubated for 1 h;B. The growth rates of SC070731and Δsca strain in THB liquid medium after incubated for 1 h(negative control).

3 討論