苗期及灌漿期抗Bipolaris sorokiniana葉枯病小麥品種（系）鑒定及相關(guān)性分析

李夢鈺 高 闖 李巧云 徐凱歌 王絲雨 牛吉山

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)/國家小麥工程技術(shù)研究中心，450046，河南鄭州）

小麥葉枯病主要危害小麥葉片與葉鞘，是一種世界性的小麥病害[1-4]。近年來，隨著全球氣候變暖、栽培條件的改變以及矮稈小麥的推廣，該病害在我國的危害日趨嚴(yán)重，發(fā)生范圍已從東北和西北麥區(qū)等病害常發(fā)區(qū)域蔓延到黃淮、長江中下游和華南等小麥主產(chǎn)區(qū)[4]，一般年份減產(chǎn)5%～20%，嚴(yán)重則減產(chǎn)50%以上[5]。葉枯病的病原菌種類較多，主要有麥根腐平臍蠕孢菌（Bipolaris sorokiniana）、雪霉葉枯菌（Gerlachia nivalis）、鏈格孢（Alternaria alternata）和殼針孢（Septoria tritici）等。不同地區(qū)其主要致病菌不盡相同，其中B.sorokiniana是較為常見的葉枯病致病菌之一，在我國南北麥區(qū)都有分布[6-8]。除引起葉枯病外，有些小麥葉枯病致病菌也是其他病害的致病菌，如B.sorokiniana還是小麥根腐病[9]和黑胚病[10-11]的致病菌，小麥被該病菌侵染后，不僅會(huì)因葉枯和根腐等引起減產(chǎn)[6]，還會(huì)形成大量黑胚籽粒而影響小麥籽粒的外觀，造成收購等級的下降[12]，此外，感染B.sorokiniana黑胚病籽粒還有嚴(yán)重的毒素污染[13-14]。

目前，關(guān)于小麥葉枯病的發(fā)生與防控主要集中在栽培和藥劑手段方面，無法從根本上解決問題，種植小麥抗病品種、實(shí)施小麥病害綠色防控和減少農(nóng)藥使用量是最重要的措施[15]。優(yōu)異的抗病資源是小麥抗葉枯病育種的基礎(chǔ)，而抗病性鑒定是其重要環(huán)節(jié)。受小麥生育期限制，大田灌漿期葉枯病抗性的接菌鑒定每年只能進(jìn)行1次，要經(jīng)過接菌、套袋和去袋等步驟，歷時(shí)長且工作量大，而且容易受大田氣象因子等環(huán)境因素的影響。本研究通過“孢子液噴灑和套袋（罩）保濕”方法分別在苗期（培養(yǎng)箱中）與灌漿期（大田環(huán)境）對130個(gè)小麥品種（系）進(jìn)行接菌鑒定，篩選抗B.sorokiniana葉枯病的優(yōu)異種質(zhì)資源，為B.sorokiniana葉枯病抗性育種以及抗病機(jī)理的研究提供優(yōu)異種質(zhì)資源，并將大田灌漿期的抗性及苗期抗性進(jìn)行相關(guān)性分析，以期為通過小麥苗期抗性預(yù)測大田灌漿期葉枯病抗性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與設(shè)計(jì)

130個(gè)小麥品種（系）為本課題組（國家小麥工程技術(shù)研究中心小麥遺傳育種課題組）收集的小麥品種或育種高代系。

材料于2019年10月在河南省滎陽市廣武鎮(zhèn)后王村的河南賽德種業(yè)有限公司育種站種植。每份材料種植2行，行長2m，行距20cm，株距3cm，人工開溝點(diǎn)播，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)。澆水、施肥、蟲害及草害管理同一般育種田。

1.2 致病菌與孢子液制備

致病菌為本課題組分離鑒定的B.sorokiniana強(qiáng)致病菌株Ta-BP33[10]，分別于2019年10月（用于苗期鑒定）與2020年4月（用于灌漿期鑒定）進(jìn)行孢子液的制備。

將冰箱保存的Ta-BP33在無菌條件下切下0.3cm2左右的小塊，放置在直徑9cm的培養(yǎng)皿中，皿中預(yù)先倒入馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂（PDA）培養(yǎng)基約10mL，置于培養(yǎng)箱中，在25℃下暗培養(yǎng)10～12d，待菌落變黑且布滿分生孢子時(shí)取出。每皿加5mL滅菌蒸餾水，用載玻片輕輕將孢子刮下，用4層紗布過濾去除混雜的菌絲后，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子液濃度，最后濃度調(diào)整為5×104個(gè)/mL，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 小麥苗期B.sorokiniana葉枯病接菌鑒定

于2019年10月挑選供試小麥健康籽粒各60粒，在70%酒精中浸泡2min，進(jìn)行表面滅菌，然后用無菌蒸餾水充分洗滌3～5次，放入直徑9cm的培養(yǎng)皿中（提前加2層濾紙并滅菌），每個(gè)培養(yǎng)皿放置5份小麥材料，每份材料15粒種子，4次重復(fù)。

每個(gè)培養(yǎng)皿加4mL蒸餾水后放置在培養(yǎng)箱中，在25℃下暗培養(yǎng)3d，然后去掉培養(yǎng)皿蓋子，加20mL蒸餾水后繼續(xù)培養(yǎng)，條件為光照11h、25℃與黑暗13h、20℃交替進(jìn)行再培養(yǎng)7d至幼苗一葉一心。

將制備好的孢子懸浮液用手動(dòng)噴霧器均勻噴灑在幼苗葉片上，直至葉片上有液滴落下，對照（CK）使用無菌蒸餾水處理，然后罩上透明塑料罩保濕。25℃暗培養(yǎng)24h后，光照11h、25℃與黑暗13h、20℃交替培養(yǎng)9d，每天早晚2次在罩子內(nèi)噴水保濕。

1.4 小麥灌漿期B.sorokiniana葉枯病接菌鑒定

用本課題組建立的“孢子液噴灑、套袋保濕”專利技術(shù)進(jìn)行接菌鑒定[16]。于2020年4月中下旬選擇花期一致、旗葉完好的分蘗掛牌標(biāo)記，在開花后10d，16∶00后，將保存的B.sorokiniana孢子液搖勻后用噴壺均勻地噴灑在旗葉上，然后套袋保濕5d，每袋5片葉。根據(jù)河南省滎陽市的氣象數(shù)據(jù)調(diào)查結(jié)果，2020年接菌鑒定期間（5月1日-15日），滎陽市最高氣溫在20℃～40℃之間，最低氣溫在14℃～22℃之間，平均相對濕度在24%～87%之間，其中有5d風(fēng)力為3～5級。

1.5 小麥對B.sorokiniana葉枯病抗性評價(jià)方法

在接菌后第10天，目測幼苗第一片葉（苗期）或旗葉（灌漿期）的病斑面積占葉片總面積的百分比（病葉面積，diseased leaf area，DLA），并根據(jù)DLA進(jìn)行抗性評價(jià)，分為5級：免疫無癥狀、高抗、中抗、中感和高感[17]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2000整理數(shù)據(jù)，利用SPSS 19.0進(jìn)行相關(guān)性與回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同小麥品種（系）B.sorokiniana葉枯病DLA變化

由表1可知，不同小麥品種（系）間葉枯病DLA變動(dòng)較大，苗期DLA最小值8.9%（10M24），最大值79.2%（溫麥10號(hào)），平均值38.8%；灌漿期葉枯病DLA最小值與最大值分別為11.2%（新麥13）和97.7%（天02-204），平均值54.9%。

表1 130個(gè)小麥品種（系）苗期與灌漿期B.sorokiniana葉枯病DLATable 1 DLA of 130 wheat cultivars(lines)inoculated with B.sorokiniana at seedling stage and filling stage %

2.2 不同小麥品種（系）對B.sorokiniana葉枯病抗性評價(jià)

按照葉枯病的5級抗性指標(biāo)進(jìn)行評價(jià)（表2），130個(gè)小麥品種（系）中，在苗期和灌漿期均無對B.sorokiniana葉枯病免疫的材料。苗期高抗品種（系）有2個(gè)（10M24和鄭2062），占供試品種（系）的1.5%；中抗有40個(gè)（陜優(yōu)225和品質(zhì)所材料6等），占30.8%；中感有27個(gè)（豫優(yōu)1號(hào)和山農(nóng)737等），占20.8%；高感有61個(gè)（山農(nóng)4143和溫麥10號(hào)等），占46.9%。130個(gè)小麥品種（系）中，67.7%苗期感B.sorokiniana葉枯病。灌漿期無高抗品種（系），只有15個(gè)中抗品種（系），占11.5%；中感與高感品種（系）分別有19個(gè)（山農(nóng)737和10M8等）和96個(gè)（豫優(yōu)1號(hào)和山農(nóng)4143等），感病品種（系）占88.5%。

表2 130個(gè)小麥品種（系）在苗期與灌漿期對B.sorokiniana葉枯病的抗性評價(jià)Table 2 Resistance evaluation of 130 wheat cultivars(lines)to leaf blight caused by B.sorokiniana at seedling stage and filling stage

根據(jù)抗性評價(jià)結(jié)果，篩選出苗期與灌漿期均表現(xiàn)為抗病的小麥品種（系）12個(gè)，分別是新麥13、鄂麥170、10M24、鄭麥132、中麥170、陜優(yōu)225、10M23、宛原白1號(hào)、良星99、65498、濟(jì)程2號(hào)與11YC173，其苗期與灌漿期平均DLA分別為17.4%與20.8%；篩選出山農(nóng)4143、SP1777-6-8、PIC420、溫麥10號(hào)和天02-204等高感B.sorokiniana葉枯病小麥品種（系）57個(gè)，其苗期與灌漿期平均DLA分別為58.1%與69.8%（表1）。

無論在苗期培養(yǎng)箱條件下，還是在灌漿期大田條件下，抗病小麥品種（系）接菌后均出現(xiàn)病斑，但是病斑擴(kuò)展很慢，到第10天調(diào)查時(shí)還是小斑點(diǎn)，葉片其他部位呈現(xiàn)正常葉片的綠色（圖1a和圖1c），而感病小麥品種（系）被B.sorokiniana侵染后，病斑迅速擴(kuò)大，在調(diào)查時(shí)，病斑連在一起，幾乎整個(gè)葉片枯黃（圖1b和圖1d）。

圖1 抗、感小麥品種（系）苗期與灌漿期B.sorokiniana葉枯病發(fā)病情況Fig.1 Performance of wheat cultivars(lines)resistant and susceptible to leaf blight caused by B.sorokiniana at seedling and filling stage

2.3 小麥苗期與灌漿期對B.sorokiniana葉枯病抗性的相關(guān)性分析

對小麥苗期與灌漿期B.sorokiniana葉枯病DLA進(jìn)行抗性相關(guān)性分析，結(jié)果（圖2）表明，苗期B.sorokiniana葉枯病抗性與灌漿期呈顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.72?；貧w分析的結(jié)果顯示，小麥苗期B.sorokiniana葉枯病抗性與灌漿期抗性為線性回歸，回歸方程為y=0.76x+25.22。

圖2 小麥苗期與灌漿期DLA相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis of disease leaf area(DLA)between seedling stage and filling stage

3 討論

小麥葉枯病于20世紀(jì)70年代在河南地區(qū)有零星發(fā)生，80年代初發(fā)病面積逐年增加，到80年代中期已遍及全省大部分麥區(qū)，小麥產(chǎn)量受到嚴(yán)重影響，成為小麥生產(chǎn)上的重要病害[5,17]。B.sorokiniana是葉枯病主要的致病菌[6-8]，而且該病菌還可引起其他的小麥病害[9-11]。培育抗病品種是從根本上解決小麥葉枯病的主要措施，而優(yōu)異的抗病資源與表型鑒定是培育抗病品種的重要組成部分[18]。為給抗葉枯病小麥育種提供優(yōu)異的抗源并為建立室內(nèi)鑒定預(yù)測大田鑒定方法提供依據(jù)，本研究通過噴灑接菌的方法對130個(gè)小麥品種（系）進(jìn)行苗期與灌漿期B.sorokiniana葉枯病抗性鑒定，苗期抗病材料（高抗、中抗）占供試品種（系）的32.3%，其中高抗材料只有2個(gè)，灌漿期無高抗材料，中抗材料僅占11.5%，在接菌鑒定的情況下，多數(shù)小麥材料感葉枯病，這與前人的研究結(jié)果[19-20]一致。如Mahto等[19]于2009-2010年在溫室條件下，用B.sorokiniana對116份小麥種質(zhì)資源進(jìn)行苗期抗性接菌鑒定，僅有30%的供試小麥品系表現(xiàn)抗病。徐淑霞等[20]通過大田種植感病品種誘發(fā)的方法，對河南120份小麥品種進(jìn)行成株期葉枯病抗性調(diào)查，其中抗病與感病品種分別為54%與46%。以上研究結(jié)果表明，在菌源充足且環(huán)境適宜的情況下，大部分小麥品系感葉枯病，葉枯病是危害小麥生產(chǎn)的重要病害。到目前為止，真正能保持穩(wěn)定抗性的品種資源并不多[21]。

由于小麥葉枯病有多種致病菌，不同菌之間還可能存在互作[6-8]，菌的侵染又受環(huán)境因素的影響[22-23]，在自然大田條件下很難準(zhǔn)確評價(jià)小麥品系對葉枯病的抗性，由于環(huán)境的不適宜或菌源的不充分，在大田自然條件下，通過DLA篩選的抗葉枯病品系未必真的抗病。如邢小萍等[24]于2005-2007年采用自然病圃法對河南省49份主栽小麥品種進(jìn)行葉枯病抗性調(diào)查，其中80%以上的品種表現(xiàn)抗葉枯病，但是這些抗病品種有待于進(jìn)一步接菌鑒定的驗(yàn)證。

大田條件下進(jìn)行小麥抗葉枯病的接菌鑒定費(fèi)時(shí)費(fèi)力，鑒定結(jié)果還容易受環(huán)境因素的影響。本研究組對小麥苗期（第一片真葉）B.sorokiniana葉枯病抗性與灌漿期（旗葉）B.sorokiniana葉枯病抗性進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)二者呈顯著正相關(guān)關(guān)系，這為通過苗期室內(nèi)葉枯病抗性鑒定結(jié)果預(yù)測大田葉枯病抗性提供了依據(jù)。與大田鑒定相比，室內(nèi)的苗期鑒定時(shí)間短且環(huán)境條件易于控制。如果能建立一種預(yù)測模型，通過室內(nèi)快速準(zhǔn)確的苗期鑒定預(yù)測大田的葉枯病抗性，將大大減少大田葉枯病抗性鑒定的繁重工作量，并提高結(jié)果的可靠性。

4 結(jié)論

通過接菌鑒定篩選出的12個(gè)在苗期與灌漿期都表現(xiàn)抗B.sorokiniana葉枯病的小麥品種（系），為開展小麥葉枯病抗性育種和抗病機(jī)理研究提供了優(yōu)異的種質(zhì)，苗期抗性與灌漿期抗性顯著的正相關(guān)關(guān)系提供了根據(jù)苗期葉枯病葉面積預(yù)測小麥大田葉枯病抗性的思路。