響應(yīng)面法在儀器分析實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用
——以響應(yīng)面法優(yōu)化HPLC測(cè)定飲料苯甲酸的條件為例

加列西·馬那甫，賈娜爾·吐?tīng)栠d，萬(wàn)越，馬福東

新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，烏魯木齊 830052

1 選擇背景

儀器分析實(shí)驗(yàn)課程是理論課程的重要組成部分，為學(xué)生提供研究思路和分析方法。課程所用的儀器涉及多種學(xué)科和分析方法；教學(xué)難度較大，教師花很多時(shí)間講解，學(xué)生卻仍一頭霧水，易產(chǎn)生畏難情緒，學(xué)習(xí)積極性不高。解決上述問(wèn)題的有效途徑是豐富和改進(jìn)教學(xué)方式方法，讓學(xué)生參與創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，充分發(fā)揮學(xué)生的實(shí)驗(yàn)自主性，培養(yǎng)學(xué)生發(fā)現(xiàn)問(wèn)題、分析問(wèn)題和解決問(wèn)題的能力[1–4]。響應(yīng)面分析法是統(tǒng)計(jì)和數(shù)學(xué)方法的結(jié)合，可采用多元二次回歸方程對(duì)受多個(gè)變量影響的問(wèn)題進(jìn)行建模和分析，優(yōu)化各試驗(yàn)因素水平的響應(yīng)值；主要包括試驗(yàn)設(shè)計(jì)、響應(yīng)面擬合及優(yōu)化計(jì)算等步驟。而將響應(yīng)面法應(yīng)用到儀器分析實(shí)驗(yàn)課程具有一定的難度和挑戰(zhàn)性。在儀器分析實(shí)驗(yàn)教學(xué)中采用響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，可以培養(yǎng)學(xué)生的自學(xué)、科研能力[5,6]。下面以響應(yīng)面法優(yōu)化HPLC測(cè)定飲料苯甲酸的條件實(shí)驗(yàn)為例，將響應(yīng)面法應(yīng)用于儀器分析實(shí)驗(yàn)教學(xué)中[7–9]。

2 教學(xué)方法與內(nèi)容的改進(jìn)

實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容的設(shè)計(jì)既要滿足教學(xué)大綱要求，又要有基本操作和技能訓(xùn)練；同時(shí)必須不斷更新內(nèi)容，與學(xué)科發(fā)展相結(jié)合。因此，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容要綜合考慮各方面的因素。

2.1 教學(xué)方法的改進(jìn)

傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)方法是，教師做實(shí)驗(yàn)前期工作，學(xué)生不參與實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作，處于被動(dòng)學(xué)習(xí)地位，對(duì)過(guò)程一無(wú)所知。因此，通過(guò)讓學(xué)生參與到實(shí)驗(yàn)的前期準(zhǔn)備工作中，激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)的主動(dòng)性，同時(shí)培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立思考創(chuàng)新的能力。在課程的講授過(guò)程中，教師不是按部就班的教學(xué)，而是讓學(xué)生參加實(shí)驗(yàn)的前期準(zhǔn)備工作。激發(fā)學(xué)生的求知欲望，開(kāi)展自由討論，最后教師進(jìn)行歸納總結(jié)。在整個(gè)過(guò)程中師生共同實(shí)驗(yàn)，通過(guò)及時(shí)糾正操作上的錯(cuò)誤來(lái)達(dá)到實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范化的要求。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后學(xué)生寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告，并由實(shí)驗(yàn)教師進(jìn)行評(píng)閱、打分。

2.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的改進(jìn)

將響應(yīng)面法應(yīng)用于儀器分析實(shí)驗(yàn)教學(xué)，選取“響應(yīng)面法優(yōu)化HPLC測(cè)定飲料苯甲酸的條件”實(shí)驗(yàn)，首先進(jìn)行兩水平的Plackett-Burman設(shè)計(jì)方法，Plackett-Burman設(shè)計(jì)(以下簡(jiǎn)稱(chēng)P-B設(shè)計(jì))是一種經(jīng)濟(jì)而有效的實(shí)驗(yàn)方法，可以用較少的實(shí)驗(yàn)達(dá)到分析各因素主效應(yīng)的效果；可以快速地從眾多因素中篩選出對(duì)實(shí)驗(yàn)條件有顯著影響的因素，從而達(dá)到篩選的目的，避免在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中由于部分因素不顯著而浪費(fèi)實(shí)驗(yàn)資源。針對(duì)影響因素，可用單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)選擇，并進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證優(yōu)化條件的合理，得到最后的響應(yīng)值。對(duì)于響應(yīng)面法優(yōu)化HPLC測(cè)定飲料苯甲酸的條件實(shí)驗(yàn)，選取的主要因素有超聲時(shí)間(A)、氨水濃度(B)和pH值(C)為自變量。根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出的顯著因子效應(yīng)的大小設(shè)計(jì)它們的變化方向和步長(zhǎng)，取各因素的中點(diǎn)作為最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)，以垂直于擬和曲面等高線的直線方向?yàn)閷?shí)驗(yàn)值變化的梯度方向。根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)得到的中心點(diǎn)，利用Design-Experts軟件對(duì)確定的影響因素進(jìn)行中心復(fù)合設(shè)計(jì)，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行最小二乘二次回歸，得到帶交互項(xiàng)和平方項(xiàng)的二次方程，通過(guò)方差分析各因素的主效應(yīng)和交互效應(yīng)，在一定范圍求出最優(yōu)條件。該方法的目的是利用數(shù)學(xué)模型描述因素與響應(yīng)值的關(guān)系，在此基礎(chǔ)上，確定其最佳條件。該方法能在設(shè)計(jì)合理的有限次數(shù)實(shí)驗(yàn)下，評(píng)價(jià)各因素對(duì)響應(yīng)值以及各個(gè)因素之間的交互作用，最后求得其最優(yōu)化條件[10]。

3 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析實(shí)例

綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用響應(yīng)面法，在三因素三水平上對(duì)飲料中苯甲酸的測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化研究。

3.1 實(shí)驗(yàn)步驟

3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

加水稀釋成0、20、40、60、80和100 μg·mL?1的苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，過(guò)濾。按色譜條件，進(jìn)樣測(cè)定。

以苯甲酸峰面積A為縱坐標(biāo)，苯甲酸質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y= 0.7 ×104x+ 131634，線性相關(guān)系數(shù)為R= 0.9988。

3.1.2 樣品前處理

精取飲料樣品10.00 mL，超聲一定時(shí)間除去CO2，用氨水調(diào)節(jié)pH約為7，加水定容至100.0 mL，濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化飲料中苯甲酸的提取率

3.2.1 試驗(yàn)安排與結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果、以超聲時(shí)間(A)、氨水濃度(B)、pH值(C)為自變量，苯甲酸提取率(Y)為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。響應(yīng)面因素水平編碼見(jiàn)表1；響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素和水平

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理

3.2.2 模型方程的建立與方差分析

應(yīng)用SAS軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到超聲時(shí)間、氨水濃度、pH值與飲料苯甲酸提取率之間的二次多項(xiàng)回歸方程：

根據(jù)表3中的P值可以評(píng)判模型中各項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值影響的顯著程度，即P< 0.01表示“高度顯著”，0.01 0.05表示“不顯著”。模型項(xiàng)P< 0.01說(shuō)明y與x1回歸方程的關(guān)系是極顯著的，該模型可用。失擬項(xiàng)越小越好，對(duì)應(yīng)的P值越大越好，如果P> 0.05，說(shuō)明所得方程與實(shí)際擬合中非正常誤差所占比例小，說(shuō)明y與x回歸方程的關(guān)系是好的，否則可能是有的因素沒(méi)有考慮到。

表3 方差分析結(jié)果

3.2.3 響應(yīng)曲面分析

應(yīng)用Design-Expert軟件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化；根據(jù)回歸模型作出相應(yīng)的響應(yīng)曲面圖和等高線圖，考查擬合響應(yīng)曲面的形狀，分析各因素對(duì)飲料中苯甲酸提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 各因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖

圖1為所得的優(yōu)化響應(yīng)曲面圖，反映了三因素中任意兩因素的交互作用對(duì)苯甲酸提取率的影響。圖形曲面呈現(xiàn)為陡峭則表明該因素對(duì)提取率影響顯著，響應(yīng)值比較敏感；曲面呈現(xiàn)為平緩則表明該因素對(duì)提取率影響不顯著，響應(yīng)值不敏感。等高線的形狀則反映任意兩因素的交互作用的強(qiáng)弱，橢圓形表明兩因素交互作用強(qiáng)，對(duì)提取率的影響較顯著，圓形表明兩因素交互作用弱，對(duì)提取率的影響不顯著。

3.2.4 參數(shù)優(yōu)化

通過(guò)軟件分析，響應(yīng)面法優(yōu)化飲料中苯甲酸的最佳條件為超聲時(shí)間10.0 min、氨水濃度12.5%、pH為7.0。在此條件下，苯甲酸的提取率為140 mg·kg?1。

4 結(jié)語(yǔ)

4.1 激發(fā)學(xué)生興趣

學(xué)生根據(jù)興趣和理解程度鞏固和消化所學(xué)知識(shí)，縮減了教師課程上枯燥說(shuō)教的時(shí)間，又培養(yǎng)了學(xué)生的自學(xué)能力、學(xué)習(xí)興趣。此外將響應(yīng)面法應(yīng)用于儀器分析實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，學(xué)生根據(jù)設(shè)計(jì)題目將整個(gè)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容更清晰直觀地展示出來(lái)，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行科學(xué)分析，培養(yǎng)了學(xué)生的獨(dú)立思維能力和基本科研素質(zhì)。

4.2 提高學(xué)生的動(dòng)手能力

采用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，學(xué)生必須通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)才能得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。允許學(xué)生在課余時(shí)間進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)掌握實(shí)驗(yàn)技術(shù)，緩解大型分析測(cè)試儀器不足的矛盾。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程是一種探究過(guò)程，重在科研能力的訓(xùn)練和創(chuàng)新思維的培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)教學(xué)中將開(kāi)放式實(shí)驗(yàn)教學(xué)和科技訓(xùn)練相結(jié)合，形式靈活，不受課時(shí)限制，是值得大力推廣的新教學(xué)手段。

4.3 培養(yǎng)學(xué)生的團(tuán)隊(duì)精神

應(yīng)用Design-Experts軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以拓展實(shí)驗(yàn)形式開(kāi)展，分組做不同題目；構(gòu)建新的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容體系，避免了傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的內(nèi)容單一、重復(fù)、無(wú)創(chuàng)新性的弊端。同時(shí)，響應(yīng)面法利用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)建立數(shù)學(xué)模型來(lái)解決受多因素影響的最優(yōu)組合問(wèn)題，可以在更廣泛的范圍內(nèi)考慮因素組合、預(yù)測(cè)響應(yīng)值。響應(yīng)面法優(yōu)勢(shì)明顯，如試驗(yàn)次數(shù)少，精度高，適合于多因素、多水平試驗(yàn)。另一方面，學(xué)生作為主角，充分參與前期準(zhǔn)備工作，能彌補(bǔ)傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)不足，培養(yǎng)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)能力、應(yīng)用軟件能力、科研能力等。

4.4 促進(jìn)教師自身素質(zhì)的提高

儀器分析實(shí)驗(yàn)課程采用響應(yīng)面法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，指導(dǎo)教師不僅需要具備系統(tǒng)的理論知識(shí)和熟練的操作技能，還必須結(jié)合學(xué)科發(fā)展前沿提出新的實(shí)驗(yàn)選題，指導(dǎo)學(xué)生分析和解決實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的新問(wèn)題，以創(chuàng)新思維影響和培養(yǎng)學(xué)生。這也是一種加強(qiáng)教學(xué)科研相結(jié)合、促進(jìn)教師隊(duì)伍整體素質(zhì)提高的新途徑。軟件應(yīng)用與實(shí)驗(yàn)教學(xué)的結(jié)合，使實(shí)驗(yàn)課程更接近科學(xué)研究，提高學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性，促進(jìn)教學(xué)相長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)教改目的。實(shí)驗(yàn)課程對(duì)學(xué)生的綜合能力要求較高，為學(xué)生的畢業(yè)論文實(shí)驗(yàn)和今后的生產(chǎn)實(shí)踐打下良好的理論基礎(chǔ)[11]。