Super-ARMS法檢測(cè)肺腺癌患者血漿循環(huán)腫瘤DNA表皮生長(zhǎng)因子受體T790M基因突變的臨床研究

周傲雪 史亮 李琨 車南穎 劉喆

肺癌是全世界范圍內(nèi)導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，其中約85%～90% 是非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC），而腺癌占大多數(shù)[1]。EGFR 是NSCLC 發(fā)生發(fā)展的主要驅(qū)動(dòng)基因，表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）的研發(fā)顯著改善了NSCLC 患者的預(yù)后，然而9～14個(gè)月的無(wú)進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）后獲得性耐藥是不可避免的[2-4]。具有EGFR 敏感突變的患者在第一代或第二代EGFR-TKIs 治療過(guò)程中出現(xiàn)疾病進(jìn)展，約有50%病例出現(xiàn)T790M 耐藥突變[5-7]，第三代EGFR-TKIs 如奧希替尼對(duì)EGFR T790M 突變患者有較好的療效[8]。因此，在第一、二代EGFRTKIs 失敗后，檢測(cè)EGFR T790M 突變是決定后續(xù)治療策略的重要步驟[9-11]。然而，在肺癌患者的臨床治療中，可能存在無(wú)法使用侵入性方法（如支氣管鏡和穿刺活檢）對(duì)復(fù)發(fā)部位進(jìn)行再活檢的情況，因此需要易于獲取的外周血標(biāo)本進(jìn)行液體再活檢。本研究旨在評(píng)估真實(shí)世界中EGFR-TKIs 治療進(jìn)展后，外周血ctDNA 中檢測(cè)EGFR T790M 突變對(duì)NSCLC 患者的臨床策略和預(yù)后的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2019年1月至2020年6月于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院確診的307例肺腺癌患者資料。納入標(biāo)準(zhǔn): 1）病理確診為肺癌；2）病理類型為腺癌；3）有完整的臨床病理信息，包括吸煙、性別、年齡等。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）年齡<18 歲；2）懷孕女性。共計(jì)納入307例肺腺癌患者（圖1）。本研究是一項(xiàng)回顧性、單中心臨床研究，由本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

圖1 患者入組流程

儀器及試劑：Mx3000P 即時(shí)熒光定量PCR 儀購(gòu)自美國(guó)Aglient 公司，Qubit 熒光定量?jī)x購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公 司，Applied Biosystems 9700PCR 儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司，QIAamp CirculatingNucleic Acid Kit 購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，ADxSuper-ARMS EGFR 基因位點(diǎn)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司，人血液樣本EGFR 基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 組織標(biāo)本和血液標(biāo)本收集 所有患者通過(guò)CT導(dǎo)引下經(jīng)皮肺腫物穿刺或經(jīng)支氣管鏡取活檢等方法收集腫瘤組織標(biāo)本。收集到的標(biāo)本使用4%甲醛溶液浸泡，經(jīng)包埋固定后制成石蠟切片。蘇木精伊紅（H&E）染色，在顯微鏡下病理學(xué)專家進(jìn)行細(xì)胞類型確診，保證80%以上的腫瘤細(xì)胞成分，通過(guò)顯微切割移除非腫瘤成分。QIAamp DNA 試劑盒定量提取石蠟切片腫瘤組織的DNA。血液樣本的收集：利用EDTA 抗凝管，抽取10 mL 的靜脈血液樣本，離心后分離4 mL血漿。血漿游離腫瘤DNA 采用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit 提取。上述提取的DNA 樣本采用Qubit 熒光定量?jī)x檢測(cè)濃度。

1.2.2 Super-ARMS 技術(shù)檢測(cè)患者血漿中EGFR 基因突變類型 通過(guò)Super-ARMS 技術(shù)檢測(cè)患者血漿中EGFR 基因突變類型，此部分結(jié)果均從本院病理科獲得。血漿ctDNA EGFR 基因突變結(jié)果的敏感度與特異度以腫瘤組織檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 療效評(píng)估 依據(jù)RECIST 1.1 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行腫瘤治療療效評(píng)估。PFS 定義為有EGFR 基因敏感突變的肺癌患者從接受EGFR-TKIs 治療開始，至觀察到疾病進(jìn)展或發(fā)生因任何原因死亡的時(shí)間。末次隨訪時(shí)間為2020年11月。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。通過(guò)Kaplan-Meier 法分析患者PFS。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床病理特征

納入的307例肺腺癌患者中，179例患者接受第一代或第二代EGFR-TKIs 治療后疾病進(jìn)展，153例腺癌患者進(jìn)行再活檢。其中男性57例，女性96例，中位年齡64（26～84）歲；接受組織再活檢74例，接受液體再活檢141例，同時(shí)接受組織再活檢和液體再活檢62例?；颊叩幕€臨床特征，包括年齡、性別、吸煙狀態(tài)、美國(guó)東部腫瘤協(xié)作組（ECOG）評(píng)分、基因突變類型和臨床分期見表1。

表1 153例接受再活檢肺腺癌患者的臨床特征

2.2 EGFR-TKIs 治療進(jìn)展后肺癌組織EGFR 基因突變檢測(cè)結(jié)果

179例患者在EGFR-TKIs 治療后進(jìn)展。74例患者進(jìn)行組織再活檢，組織再活檢標(biāo)本來(lái)源：58例（78.4%）為肺穿刺，8例（10.8%）為胸水沉淀包埋，3例（4.0%）為淋巴結(jié)穿刺活檢，5例（6.8%）為支氣管活檢標(biāo)本。其中34例（45.9%）存在EGFR T790M 基因突變，其中18例（52.9%）存在Exon19 del 突變合并Exon20 T790M 突 變，16例（47.1%）存 在Exon21 1858R 突變合并Exon20 1790M 突變。接受組織再活檢患者中有62例進(jìn)行血液樣本再活檢。

2.3 EGFR-TKIs 治療進(jìn)展后血漿EGFR 基因突變檢測(cè)結(jié)果

179例EGFR-TKIs 治療后進(jìn)展的患者中，141例患者進(jìn)行血液樣本再活檢，應(yīng)用Super-ARMS 技術(shù)檢測(cè)到血漿ctDNA 中EGFR T790M 基因突變51例（36.2%）。45例存在Exon19 del 突變，其中31例合并Exon20 T790M 突變；59例存在Exon21 L858R 突變，其中20例合并Exon20 T790M 突變；1例Exon18 G719X 突變；41例EGFR 檢測(cè)陰性。以組織檢測(cè)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，62例患者的血液Super-ARMS 檢測(cè)敏感度為22.2%，特異性為71.4%，與組織檢測(cè)的符合度為50.0%（表2）。

表2 患者腫瘤組織與外周血中EGFR T790M 突變狀態(tài)比較 例

2.4 組織與血漿EGFR T790M 基因突變患者接受第三代EGFR-TKIs 治療后療效分析

EGFR T790M 基因耐藥突變患者中, 73例接受了第三代EGFR-TKIs 藥物治療，將可評(píng)估的患者進(jìn)行生存分析，組1 為血漿檢測(cè)EGFR T790M 突變陽(yáng)性42例，組2 為組織檢測(cè)EGFR T790M 突變陽(yáng)性31例。組織EGFR T790M 突變陽(yáng)性患者接受第三代EGFR-TKIs 的 中 位PFS 為16.3 個(gè)月（95%CI：7.5～25.2），外周血EGFR T790M 突變陽(yáng)性患者為11.4 個(gè)月（95%CI：7.0～15.8），兩者相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=1.138，P>0.05），提示外周血檢測(cè)陽(yáng)性和組織檢測(cè)陽(yáng)性患者在接受第三代EGFR-TKIs 治療后，對(duì)患者PFS 影響無(wú)顯著性差異。再活檢EGFR T790M陰性且未接受第三代EGFR-TKIs 藥物治療患者40例（組3），其中位PFS 為8.3 個(gè)月（95%CI：5.8～10.8）。組1、組2與組3 之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=9.69，P<0.05，圖2）。

圖2 Kaplan-Meier 分析組織與血漿EGFR T790M 基因突變患者接受第三代EGFR-TKIs 治療后的PFS

2.5 組織與血漿EGFR T790M 基因突變陰性患者未接受第三代EGFR-TKIs 治療后的療效分析

EGFR T790M 基因突變陰性患者中，將可評(píng)估的患者進(jìn)行生存分析（圖3），組1 為血漿檢測(cè)EGFR T790M 突變陰性者36例，組2 為組織檢測(cè)EGFR T790M 突變陰性22例。組織EGFR T790M 突變陰性患者未接受第三代EGFR-TKIs 治療患者的中位PFS 為7.0 個(gè)月（95% C1：6.0～8.0），外周血EGFR T790M 突變陰性患者為7.0 個(gè)月（95% CI：4.4～9.6）,兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=0.470，P>0.05），提示外周血檢測(cè)陰性和組織檢測(cè)陰性患者在未接受第三代EGFR-TKIs 治療，接受其他治療方案后，對(duì)患者PFS 影響無(wú)顯著性差異（P>0.05）。

3 討論

再活檢對(duì)EGFR-TKIs 耐藥的患者后續(xù)治療策略具有關(guān)鍵作用，然而臨床中并非所有患者均可進(jìn)行組織再活檢。既往臨床研究顯示，患者EGFR-TKIs 耐藥后組織再活檢比例僅約50%[12-13]。本研究回顧性分析了153例肺腺癌患者的臨床特征，患者經(jīng)過(guò)第一代或第二代EGFR-TKIs 治療后病情進(jìn)展，并進(jìn)行了再活檢，其中接受組織再活檢74例，接受外周血液體再活檢141例，同時(shí)接受組織再活檢和外周血液體再活檢62例。在179例接受第一代或第二代EGFRTKIs 治療后進(jìn)展的患者中進(jìn)行組織再活檢比例（41.3%，74/179）與既往研究相比略低[12-13]?？赡苡捎诓唤邮芑蛏眢w狀況不能耐受再活檢的患者較多。在本研究中，再活檢患者中檢測(cè)到的EGFR T790M 突變的頻率為51.6%（79/153），與既往研究數(shù)據(jù)一致[14-15]。

本研究中，73例患者在檢測(cè)EGFR T790M 突變后接受了第三代EGFR-TKIs 治療，并對(duì)可評(píng)估的患者進(jìn)行第三代EGFR-TKIs 療效評(píng)估。研究發(fā)現(xiàn)，組織EGFR T790M 突變陽(yáng)性患者接受三代EGFRTKIs 后的中位PFS 為16.3 個(gè)月（95% C1：7.5～25.2），與既往大型臨床研究結(jié)果一致[8,15-16]，外周血EGFR T790M 突變陽(yáng)性患者為11.4 個(gè)月（95% CI：7.0～15.8），兩者相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），兩者與再活檢T790M 陰性且未接受第三代EGFR-TKIs 藥物治療組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。EGFR T790M 基因突變陰性患者中，將可評(píng)估的患者進(jìn)行生存分析，組織EGFR T790M 突變陰性患者未接受第三代EGFR-TKIs 的中位PFS 為7.0 個(gè)月（95% C1：6.0～8.0），外周血EGFR T790M 突變陰性患者為7.0 個(gè)月（95% CI：4.4～9.6），兩者生存曲線趨勢(shì)相似，提示外周血檢測(cè)陽(yáng)性和組織檢測(cè)陰性患者在未接受第三代EGFR-TKIs 治療的情況下接受其他治療方案，對(duì)患者PFS 影響無(wú)顯著性差異。

上述結(jié)果提示液體再活檢結(jié)果可以一定程度上替代組織再活檢，用于無(wú)組織標(biāo)本進(jìn)行再活檢的耐藥后患者；且EGFR T790M 陽(yáng)性患者接受第三代EGFRTKIs 治療后PFS 優(yōu)于T790M 陰性未接受第三代EGFR-TKIs 治療患者。在真實(shí)世界中，患者醫(yī)囑依從性可能比參與臨床試驗(yàn)的患者低，當(dāng)患者拒絕接受、不能耐受組織再活檢或組織再活檢有效成分較少時(shí)，液體活檢結(jié)果可能是一種替代方法，可指導(dǎo)耐藥后的治療。

本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)組織和液體標(biāo)本兩種檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性的病例，接受第三代EGFR-TKIs 治療后的中位PFS 較僅一種檢測(cè)呈陽(yáng)性者短，可能是由于兩種檢測(cè)均為陽(yáng)性的病例且多數(shù)存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，腫瘤負(fù)荷大，故療效較差，但該結(jié)論仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究存在一定局限性：1）本研究為單中心進(jìn)行的回顧性研究，與之前的研究相比，血漿樣本和組織樣本中EGFR T790M 檢測(cè)的一致性率相對(duì)較低，提示基于ARMS 的方法存在局限性；2）組織再活檢的時(shí)間和液體再活檢的時(shí)間均為第一代或第二代EGFR-TKIs治療進(jìn)展后，但未完全匹配；3）本研究使用的PCR 檢測(cè)系統(tǒng)中，EGFR T790M 突變的存在僅被報(bào)道為“檢測(cè)到”或“未檢測(cè)到”，因此無(wú)法估計(jì)EGFR T790M 突變的豐度，即腫瘤細(xì)胞在所有EGFR 突變細(xì)胞中的比例。

綜上所述，靶向藥物耐藥后再活檢在NSCLC EGFR-TKIs 耐藥患者的治療中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，隨著診斷技術(shù)的發(fā)展，在組織標(biāo)本獲取困難的情況下，液體活檢可能是一種很好的補(bǔ)充替代選擇。Super-ARMS法檢測(cè)血漿ctDNA EGFR T790M 基因突變狀態(tài)具有可行性, 真實(shí)世界中可以在臨床上用于指導(dǎo)后續(xù)治療和療效評(píng)價(jià)。