miRNA-30b調(diào)控ITGB3表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡*

鐘科 鄧天芝 黃大翠

乳腺癌已成為嚴(yán)重威脅世界女性健康的實(shí)體惡性腫瘤。對(duì)于晚期乳腺癌，尚無有效的治療手段[1]，腫瘤的復(fù)發(fā)以及轉(zhuǎn)移是患者死亡的主要原因[2]。研究顯示，非編碼微小RNA（microRNA，miRNA）在腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮促癌或抑癌的調(diào)控功能[3]。miRNA-30b是miRNA-30 家族成員之一，miRNA-30b 表達(dá)與結(jié)腸癌、前列腺癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤的進(jìn)展關(guān)系密切[4]。Gao 等[5]研究顯示，沉默miRNA-30b 的表達(dá)，胃癌細(xì)胞的增殖與侵襲能力明顯增強(qiáng)。但有關(guān)miRNA-30b 在乳腺癌中的報(bào)道較少。整合素β3（integrin β3，ITGB3）是定位在胞膜上重要的跨膜蛋白受體。研究顯示，ITGB3 參與調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移等生物學(xué)過程程[6]。本研究旨在通過對(duì)miRNA-30b 和ITGB3 在乳腺癌中的作用進(jìn)行探討，為乳腺癌藥物的開發(fā)提供新的分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣本 選擇2016年3月至2019年3月144例于成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治的并均經(jīng)病理學(xué)確診的乳腺癌患者的組織標(biāo)本，其中原位乳腺癌51例、浸潤性乳腺癌48例和轉(zhuǎn)移性乳腺癌45例，及癌旁組織標(biāo)本144例，同時(shí)收集其臨床病理資料。本研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。

1.1.2 細(xì)胞及動(dòng)物 人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞株購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。SPF 級(jí)雌性BALB/c 小鼠30 只，周齡5～6 周，體質(zhì)量16～18 g，由本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心購自成都岐黃博恩生物科技有限公司，動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（川）2020-225，并獲得醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.3 試劑 miRNA-30b 模擬物、miRNA-NC 和過表達(dá)ITGB3（miRNA-30b 模擬物-pc）均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。GAPDH 抗體購自美國Jackson 公司；5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）試劑盒、Western blot 試劑盒均購自美國Invitrogen 公司；Transwell 小室購自美國Sigma-Aldrich 公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）檢測使用PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增[7]（95℃，5 s，單次循環(huán)后；95℃，5 s；60 ℃，60 s，采集熒光信號(hào)40 個(gè)循環(huán)）。各目的基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量采用2?△△CT表示，其中-ΔΔCt=ΔCt（標(biāo)準(zhǔn)基因）-ΔCt（目的基因）。RT-PCR 實(shí)驗(yàn)中miRNA-30b、ITGB3、U6 的引物序列見表1。

表1 目的基因引物序列

1.2.2 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn) 使用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫miRactDB 預(yù)測miRNA-30b 和ITGB3 存在特異性結(jié)合位點(diǎn)。依次構(gòu)建突變和野生質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染，48 h 后以PROMEGA 雙熒光素酶系統(tǒng)進(jìn)行檢測。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及培養(yǎng) 根據(jù)Tao 等[8]研究進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組。正常組：不加任何藥物，常規(guī)培養(yǎng)；對(duì)照組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染的miR-NC 后，常規(guī)培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-30b 模擬物后，常規(guī)培養(yǎng)；過表達(dá)組：細(xì)胞轉(zhuǎn)染的miRNA-30b 模擬物-pc，常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.4 BrdU 標(biāo)記實(shí)驗(yàn) 各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，10%甲醛固定并進(jìn)行BrdU 實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)格按照試劑盒操作要求進(jìn)行。

1.2.5 JC-1 染色 各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，制成單細(xì)胞懸液，5,5',6,6'-四氯-1,1',3,3'-四乙基苯并咪唑羰花青碘化物（JC-1）染色，孵育，觀察細(xì)胞中紅色（JC-1 單體）和綠色熒光（JC-1 復(fù)合物）的變化，統(tǒng)計(jì)紅色熒光和綠色熒光的比值。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù) 各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，胰酶消化細(xì)胞，離心3 min，分別收集細(xì)胞，重懸細(xì)胞后，置于FITC 標(biāo)記的Annexin-V 和PI 的混合液中30 min，流式細(xì)胞儀上檢測。

1.2.7 Transwell 小室侵襲實(shí)驗(yàn) 在Transwell 小室中平鋪Matrigel 基質(zhì)膠（約50 μL）并將以無血清培養(yǎng)基中的各組細(xì)胞的單細(xì)胞懸液（1×105/mL）加入2 mL 至上室，在小室下室平鋪10%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，清洗后，甲醛固定，染色后，顯微鏡下觀察。

1.2.8 小鼠皮下種植瘤實(shí)驗(yàn) 將各組細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，將小鼠隨機(jī)分為正常組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組（n=10）。將各組細(xì)胞單細(xì)胞懸液（1×106/mL）分別皮下注射2 mL 至對(duì)應(yīng)組小鼠體內(nèi)，并腹腔注射熒光標(biāo)志物L(fēng)uciferin，監(jiān)測瘤體的淋巴轉(zhuǎn)移情況。4 周后，無菌剝離瘤體，稱重。

1.2.9 Western blot 檢測 細(xì)胞培養(yǎng)24 h，裂解，常規(guī)提取總蛋白，電泳分離，轉(zhuǎn)模，清洗后，封閉加入一抗（1∶500），孵育，加入二抗（1∶1 000），DAB 顯色，以GAPDH 作為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。作圖工具采用GraphPad 5.01，計(jì)量資料以x±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌樣本中miRNA-30b 和ITGB3 的表達(dá)

RT-PCR 結(jié)果顯示，原位、浸潤性和轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織中的miRNA-30b 相對(duì)表達(dá)量分別為0.75、0.52 和0.23，ITGB3 mRNA 分別為2.17、3.76 和5.43，與癌旁組織（1.00）相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.001，圖1）。通過χ2檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示，miRNA-30b 和ITGB3 mRNA 的相對(duì)表達(dá)與乳腺癌患者的腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、TNM 臨床分期相關(guān)（均P<0.001），與患者的年齡、家族史、是否淋巴轉(zhuǎn)移無關(guān)（P>0.05），見表2。

圖1 乳腺癌樣本中miRNA-30b 和ITGB3 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量

表2 miRNA-30b 和ITGB3 mRNA 表達(dá)與乳腺癌患者的臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.2 miRNA-30b 靶向調(diào)控ITGB3 的表達(dá)

雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，野生型ITGB3 的熒光素酶活性被抑制（P<0.001），突變型ITGB3 熒光素酶活性無明顯變化（P>0.05），說明miRNA-30b 與ITGB3 具有靶向調(diào)控關(guān)系（圖2，3）。

圖2 miRNA-30b 和ITGB3 的結(jié)合位點(diǎn)

圖3 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)的檢測

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后檢測各組細(xì)胞中miRNA-30b 和ITGB3 mRNA 的相對(duì)表達(dá)

RT-PCR 結(jié)果顯示，與miRNA-30b 模擬物-NC相比，miRNA-30b 模擬物中的miRNA-30b 表達(dá)明顯升高，ITGB3 mRNA 的表達(dá)明顯降低（均P<0.001），與miRNA-30b 模擬物相比，miRNA-30b 模擬物-pc中的ITGB3 mRNA 的表達(dá)明顯升高（P<0.001，圖4）。

圖4 miRNA-30b 和ITGB3 mRNA 在細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量

2.4 各組細(xì)胞的增殖能力

與正常組相比，實(shí)驗(yàn)組BrdU 陽性細(xì)胞的比例明顯下降（P<0.001），與實(shí)驗(yàn)組相比，過表達(dá)組BrdU 陽性細(xì)胞的比例明顯升高（P<0.001），正常組與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖5。

圖5 miRNA-30b 和ITGB3 影響細(xì)胞的增殖

2.5 線粒體膜電位變化

與正常組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞紅色熒光與綠色熒光的比值明顯下降（P<0.001），線粒體膜電位隨之下降，正常組與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)意義（P>0.05），見圖6。

圖6 miRNA-30b 影響細(xì)胞的線粒體膜電位

2.6 各組細(xì)胞的凋亡率

與正常組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P<0.001），與實(shí)驗(yàn)組相比，過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率明顯降低（P<0.001），正常組與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖7。

圖7 miRNA-30b 和ITGB3 影響細(xì)胞的凋亡

2.7 各組細(xì)胞的侵襲能力

與正常組相比，實(shí)驗(yàn)組侵襲的細(xì)胞數(shù)量明顯下降（P<0.001），與實(shí)驗(yàn)組相比，過表達(dá)組侵襲的細(xì)胞數(shù)量明顯增多（P<0.001），正常組與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖8。

圖8 miRNA-30b 和ITGB3 影響細(xì)胞的侵襲

2.8 各組細(xì)胞的體內(nèi)生長與轉(zhuǎn)移能力

與正常組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠內(nèi)的瘤體重量明顯減少，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例明顯減?。ň鵓<0.001），正常組與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05），見圖9，10。

圖9 miRNA-30b 影響細(xì)胞的體內(nèi)生長

2.9 Western blot 檢測各組細(xì)胞中的ITGB3 表達(dá)水平

與正常組相比，實(shí)驗(yàn)組ITGB3 的表達(dá)明顯下降（P<0.001），與實(shí)驗(yàn)組相比，過表達(dá)組ITGB3 的表達(dá)明顯升高（P<0.001），正常組與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖11。

圖10 miRNA-30b 影響細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)移

圖11 Western blot 檢測ITGB3 的表達(dá)

3 討論

目前，乳腺癌的診斷、治療以及預(yù)后雖有較為明顯的進(jìn)展，但長期生存率仍不令人滿意。因此，揭示乳腺癌的病因機(jī)制，闡明腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，對(duì)于臨床上開展乳腺癌的分子靶向精準(zhǔn)治療具有重大意義。

作為miRNA-30 家族中的一員，miRNA-30b 在多種腫瘤如胃癌、肺腺癌等中發(fā)揮抑癌作用引起廣泛關(guān)注。Guan 等[9]研究證實(shí)，miRNA-30b 可抑制前列腺癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，下調(diào)癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。郭青松等[10]研究表明，過表達(dá)miRNA-30b 可抑制胰腺癌干細(xì)胞的成瘤性。Gao 等[11]研究證實(shí)，miRNA-30b 能抑制肝癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡。本研究對(duì)乳腺癌組織樣本進(jìn)行RT-PCR 檢測結(jié)果顯示，miRNA-30 呈現(xiàn)低表達(dá)，說明miRNA-30b 參與乳腺癌病情進(jìn)展過程。本研究以miRNA-30b 模擬物轉(zhuǎn)染MCF-7 細(xì)胞后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖、侵襲、體內(nèi)生長和轉(zhuǎn)移能力均明顯下降，細(xì)胞的線粒體膜電位明顯下降，凋亡率明顯升高。顯示miRNA-30b 對(duì)乳腺癌細(xì)胞有良好的抑制作用。

研究顯示，整合素α、β 家族參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲以及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移等生物學(xué)病理過程[12]。ITGB3 作為整合素β 家族的重要成員，可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的黏附，促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移與侵襲過程。Wu 等[13]研究顯示，過表達(dá)ITGB3 可增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。Thibaudeau 等[14]研究顯示，抑制ITGB3 表達(dá)能明顯抑制肺癌細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移的能力。Fuentes 等[15]研究顯示，在乳腺癌組織中ITGB3 表達(dá)異常，并且與患者的不良預(yù)后相關(guān)。本研究對(duì)乳腺癌患者的組織樣本檢測顯示，ITGB3 的表達(dá)明顯升高，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miRNA-30b 能靶向調(diào)控ITGB3 表達(dá)，上調(diào)miRNA-30b 表達(dá)后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中ITGB3 表達(dá)明顯降低；升高ITGB3 表達(dá)后，過表達(dá)組細(xì)胞的增殖與侵襲能力明顯好于實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，凋亡率低于實(shí)驗(yàn)組，證實(shí)了miRNA-30b 與ITGB3 的靶向調(diào)控關(guān)系。

綜上所述，在乳腺癌組織中miRNA-30b 和ITGB3表達(dá)異常，過表達(dá)miRNA-30b 后能明顯下調(diào)ITGB3表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲，并促使其凋亡，但有關(guān)miRNA-30b 在乳腺癌臨床治療的價(jià)值仍需更深入研究。