重度中暑豬早期胰島功能的變化

喬澤淵 倪 軍 張 靜 謝國(guó)旗

1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院研究生處，河南新鄉(xiāng) 453000；2.陸軍第八十三集團(tuán)軍醫(yī)院血液內(nèi)分泌科，河南新鄉(xiāng) 453000

人們?cè)诟邷馗邼癍h(huán)境作業(yè)時(shí)極易發(fā)生中暑，臨床依據(jù)患者的臨床癥狀將中暑分為輕度中暑（先兆中暑）、中度中暑（熱衰竭）、重度中暑（熱射?。1]。胰島素是重要的糖代謝調(diào)節(jié)激素，由胰島β 細(xì)胞分泌，是體內(nèi)唯一降血糖的激素，主要在肝臟被胰島素酶滅活，也有少量在腎臟和肌肉中被滅活[2]。重度中暑早期機(jī)體需要增加皮膚血流量來(lái)散熱，血液從內(nèi)臟血管網(wǎng)向皮膚血管重新分布，缺血、缺氧加上熱應(yīng)激，導(dǎo)致胰島、肝、腎組織損傷，影響胰島素穩(wěn)態(tài)[3-5]。重度中暑患者胰島狀態(tài)及胰島素的分泌水平對(duì)其早期糖代謝有重要影響。本研究通過(guò)構(gòu)建豬重度中暑模型，分析重度中暑豬早期血糖變化特點(diǎn)及其可能機(jī)制，以期為臨床重度中暑早期糖代謝干預(yù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康CV 級(jí)雄性巴馬小型豬12 只，體重10～15 kg，購(gòu)自泰州泰和生物科技有限公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（蘇）2017-0010。本研究經(jīng)陸軍第八十三集團(tuán)軍醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“我院”）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)且遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理原則。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物正常體溫范圍為38～39℃，均抽取血樣進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)，檢驗(yàn)結(jié)果顯示其血細(xì)胞計(jì)數(shù)、凝血功能、肝腎功能、心肌酶水平均在正常范圍[6-9]。分籠飼養(yǎng)于我院清潔動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，室內(nèi)溫度為（23±1）℃，濕度為（50±5）%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。

1.2 主要試劑與儀器

鹽酸艾司氯胺酮注射液（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：200325BL）；豬胰島素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，貨號(hào)：CSBE06828p）；豬胰島素免疫組織化學(xué)（immuno histo chemistry，IHC）一抗試劑盒（中國(guó)Affinity Biosciences公司，貨號(hào)：AF5109）；兔二步法二抗試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：PV-6001）；蘇木精-伊紅（hematoxylin-exosin，HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：G1120）。恒溫恒濕氣候艙（廣州富宸電器有限公司，型號(hào)：改良型F800-Z）；貝克曼生化分析儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司，型號(hào)：AU5800）；高靈敏度電子體溫計(jì)（湖南省瑞博科技有限公司，型號(hào)：PM-9000A）；酶標(biāo)定量測(cè)定儀（德國(guó)Thermo 公司，型號(hào)：Fluoroskan）。

1.3 分組及模型制備

將12 只巴馬小型豬按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組與模型組，每組6 只。兩組實(shí)驗(yàn)前禁食、水12 h，實(shí)驗(yàn)前0.5 h 內(nèi)測(cè)量3 次核心溫度，取均值作為基礎(chǔ)體溫。對(duì)照組置于室溫下，不做任何處理，模型組連接多參數(shù)心電監(jiān)護(hù)儀，待生命體征平穩(wěn)后，置于預(yù)熱的恒溫恒濕氣候艙中，保持在44～47℃，相對(duì)濕度（65±5）%。兩組核心溫度由可重復(fù)使用的高靈敏熱電偶探頭進(jìn)行監(jiān)測(cè)，電偶探頭的校準(zhǔn)溫度為0～50℃，將電偶探頭置于肛內(nèi)，每0.5 小時(shí)監(jiān)測(cè)一次核心溫度，記錄一般表現(xiàn)，模型組核心溫度＞42℃時(shí)終止實(shí)驗(yàn)，采集兩組股靜脈血送檢血糖、胰島素，耳后靜脈注射鹽酸艾司氯胺酮注射液20 mg/kg 進(jìn)行麻醉后，固定于清潔動(dòng)物解剖實(shí)驗(yàn)臺(tái)，備皮、消毒，無(wú)菌操作下逐層打開(kāi)腹腔，取胰腺、腎、肝組織樣本進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

股靜脈采血5 ml，用全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀檢測(cè)兩組血糖水平。另取股靜脈采血5 ml，用恒溫離心機(jī)1000 g 離心20 min 取上清液（有效離心半徑10 cm），嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作，計(jì)算兩組血液中胰島素水平。無(wú)菌操作下取胰腺、肝、腎組織標(biāo)本，生理鹽水沖洗后立即用10%中性甲醛固定48 h，石蠟包埋后制備組織切片，片厚2.5 μm，HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)改變。

取同一部位胰腺組織用10%中性甲醛固定保存，常規(guī)行乙醇脫水、透明、石蠟包埋，切片2.5 μm。經(jīng)烤片、脫蠟和水化、抗原修復(fù)、阻斷、封閉、一抗孵育（一抗按1∶100 比例用含3%非免疫血清的磷酸鹽緩沖液稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜，后于37℃孵育1 h 復(fù)溫，用磷酸鹽緩沖液沖洗3 次，每次5 min）、二抗孵育（滴加二抗，室溫孵育60 min，后磷酸鹽緩沖液漂洗3 次，每次5 min），顯色，復(fù)染，封片后，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件分析兩組胰島中胰島素的平均光密度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般情況及核心溫度

模型組進(jìn)入恒溫恒濕氣候艙后，核心體溫呈升高趨勢(shì)，對(duì)照組核心溫度無(wú)變化，見(jiàn)圖1。模型組核心溫度＞42℃時(shí)出現(xiàn)精神萎靡不振，步態(tài)不穩(wěn)，結(jié)膜充血，角膜反射減弱或消失，對(duì)照組無(wú)異常表現(xiàn)。

圖1 兩組核心溫度變化

2.2 兩組實(shí)驗(yàn)前后血糖及血液中胰島素水平比較

實(shí)驗(yàn)前兩組血糖及血液中胰島素水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。對(duì)照組實(shí)驗(yàn)前后血糖及血液中胰島素水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。實(shí)驗(yàn)后，模型組血糖水平高于實(shí)驗(yàn)前，血液中胰島素水平低于實(shí)驗(yàn)前，且模型組血糖水平高于對(duì)照組，血液中胰島素水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組實(shí)驗(yàn)前后血糖及血液中胰島素水平比較（）

表1 兩組實(shí)驗(yàn)前后血糖及血液中胰島素水平比較（）

2.3 兩組胰島、肝、腎組織改變

對(duì)照組胰島、肝、腎組織無(wú)明顯改變；模型組胰腺組織中胰島邊緣不清，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞水腫，少量粒細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血管瘀血；腎小管與集合管擴(kuò)張，血管內(nèi)可見(jiàn)血栓形成，上皮細(xì)胞顆粒變性，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝竇輕度瘀血擴(kuò)張，肝細(xì)胞輕度水腫、顆粒變性，見(jiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖2～4。

圖2 兩組胰腺組織形態(tài)（HE，400×）

2.4 兩組胰島中胰島素的表達(dá)比較

對(duì)照組觀察到數(shù)量較多、呈棕黃色的胰島素陽(yáng)性表達(dá)，細(xì)胞排列緊密均勻，形態(tài)完整；模型組觀察到胰島著色區(qū)域少，形態(tài)不規(guī)則，見(jiàn)圖5（封三）。模型組胰島中胰島素平均光密度值低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)圖6。

圖3 兩組腎組織形態(tài)（HE，200×）

圖4 兩組肝組織形態(tài)（HE，400×）

圖5 兩組胰腺組織中胰島素表達(dá)（IHC，400×）

圖6 兩組胰島中胰島素水平比較

3 討論

隨著全球氣候變暖，重度中暑患者死亡率可達(dá)10%～30%[10]。有研究表明重度中暑患者早期血糖異常升高[11-12]，異常升高的血糖可引起非特異性炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致組織損傷和器官衰竭，影響患者的預(yù)后[13-15]。重度中暑導(dǎo)致糖代謝紊亂，可能是由于胰腺、肝臟、腸道、腎臟、肌肉等不同程度的功能和器質(zhì)損傷，影響了血糖調(diào)節(jié)的過(guò)程，其中胰腺對(duì)熱損傷較為敏感[16-17]。有研究觀察到胰腺在中暑時(shí)易受缺血、缺氧影響，胰島素分泌功能紊亂[18-19]。

本研究分析和總結(jié)國(guó)內(nèi)外近年構(gòu)建重度中暑實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的相關(guān)文獻(xiàn)[20-22]，制訂大型動(dòng)物豬的重度中暑標(biāo)準(zhǔn)如下：①出現(xiàn)明顯的行為異常，如煩躁不安、站立不穩(wěn)等；②核心溫度＞42℃；③出現(xiàn)生理反射異常，如角膜反射、提肛反射減弱或消失等。本研究將巴馬小型豬置于恒溫恒濕氣候艙（模擬高溫高濕環(huán)境）中，當(dāng)熱暴露時(shí)間為4 h 左右時(shí)，模型組呼吸、心率加快，出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)、全身大汗及結(jié)膜充血、角膜反射減弱或消失等，測(cè)量核心體溫＞42℃，認(rèn)為造模成功。由于經(jīng)濟(jì)實(shí)用易重復(fù)，國(guó)內(nèi)多采用大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，但小型動(dòng)物的體型限制了部分臨床干預(yù)手段的實(shí)施，而且其生理代謝與人類(lèi)有較大差異。國(guó)外部分學(xué)者以狒狒作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，但其價(jià)格昂貴且不宜獲取，實(shí)際操作中難以推廣[23]。小型豬在糖代謝、胰島的發(fā)育形態(tài)等方面與人類(lèi)相近，而且溫順、繁殖力強(qiáng)、基因穩(wěn)定，相較于小型動(dòng)物大鼠等具有顯著的優(yōu)勢(shì)[24]。

本研究觀察到模型組胰島、肝、腎組織出現(xiàn)一定損傷，免疫組化染色進(jìn)一步觀察到胰島素染色平均光密度值降低，提示其胰島細(xì)胞分泌胰島素功能受損。王超等[25]研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激小鼠的血漿胰島素水平降低，認(rèn)為熱損傷對(duì)小鼠糖代謝有一定的抑制作用；李延森等[26]研究觀察到熱應(yīng)激抑制雄性巴馬香豬胰島素分泌，血糖水平升高；袁雄坤等[27]研究認(rèn)為母豬中暑早期血糖水平升高，隨著熱應(yīng)激時(shí)間延長(zhǎng)，會(huì)出現(xiàn)血糖水平降低；劉圈煒等[28]研究認(rèn)為持續(xù)熱應(yīng)激狀態(tài)下，豬血糖水平開(kāi)始時(shí)升高，之后下降，最后又有所升高。以上研究與本研究結(jié)果基本一致，提示豬重度中暑早期出現(xiàn)血糖升高，可能不單是胰島素水平的變化，肝腎組織損傷也可能加重了糖代謝紊亂的趨勢(shì)，還需要進(jìn)一步的深入研究。

綜上所述，豬重度中暑早期出現(xiàn)糖代謝紊亂。本研究不足之處在于沒(méi)有動(dòng)態(tài)連續(xù)觀察豬發(fā)生重度中暑后血糖及胰島素水平的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)論有一定的局限性，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究中給予補(bǔ)充完善。