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    基于凋亡機(jī)制院內(nèi)制劑抗瘤丸優(yōu)化方-4對(duì)U87裸鼠移植瘤動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)研究

    2021-09-26 08:05:52馮英楠陳菲王曉萌王海征林曉蘭
    環(huán)球中醫(yī)藥 2021年9期
    關(guān)鍵詞:微血管緩沖液膠質(zhì)瘤

    馮英楠 陳菲 王曉萌 王海征 林曉蘭

    膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的一類腫瘤,約占顱內(nèi)所有腫瘤的35.26%~60.9%[1]。膠質(zhì)瘤具有侵襲性生長、惡性程度高等特點(diǎn)。目前,治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤主要采取手術(shù)為主,輔助放療、化療等方法,但是膠質(zhì)瘤生存期短,死亡率高,對(duì)人類健康威脅極大。中藥因其較好的安全性和有效性在腫瘤的治療中發(fā)揮積極作用,抗瘤丸是適用于腦膠質(zhì)瘤、腦垂體瘤的輔助治療的院內(nèi)制劑,臨床應(yīng)用近30年,服用的患者累計(jì)10萬余人次,于2012年獲得國家發(fā)明專利(專利號(hào):ZL 2010 1 0234220.2)。

    課題組前期研究也證實(shí),抗瘤丸的抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞作用可能與誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡相關(guān)[2-3],提示對(duì)治療膠質(zhì)瘤有良好的開發(fā)和應(yīng)用前景??沽鐾鑳?yōu)化方-4是抗瘤丸的優(yōu)化處方之一,基于前期優(yōu)化處方研究[4-5]發(fā)現(xiàn),本實(shí)驗(yàn)的抗瘤丸優(yōu)化方-4抑瘤效果較好,故本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)抗瘤丸優(yōu)化方-4進(jìn)行研究??沽鐾鑳?yōu)化方-4是在原方的基礎(chǔ)上,通過中醫(yī)藥專家論證,減少了6味佐使藥。本實(shí)驗(yàn)通過觀察對(duì)相關(guān)指標(biāo)表達(dá)的影響,進(jìn)一步闡明抗瘤丸優(yōu)化方-4治療膠質(zhì)瘤的作用機(jī)制,為抗瘤丸處方優(yōu)化提供數(shù)據(jù),為進(jìn)一步開發(fā)抗瘤丸提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 動(dòng)物與細(xì)胞

    SPF級(jí)健康雄性BALB/c裸鼠,雄性,體質(zhì)量17~19 g,購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證號(hào):SCXK(京)2012-0001;人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞(株),購于中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心(ATCC,CCL-107)。

    1.2 藥物

    抗瘤丸是由白花蛇舌草、半枝蓮、白英等18味中藥組成的院內(nèi)復(fù)方制劑。抗瘤丸優(yōu)化方-4是抗瘤丸的優(yōu)化處方,由首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥劑科提供。陽性對(duì)照藥替莫唑胺(批號(hào):H20080313),購于美國先靈葆雅制藥公司。

    1.3 試劑及儀器

    胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)(批號(hào):20120517),購于天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司;DMEM培養(yǎng)基(高糖)(批號(hào):1177237)、胰蛋白酶(批號(hào):0458)、無鈣、鎂磷酸鹽緩沖液(10×PBS,PH 7.2-7.4)(批號(hào):20120815),均購于北京諾博萊德科技有限公司;注射用青霉素鈉(批號(hào):Y0302215)、注射用硫酸鏈霉素(批號(hào):030103),購于華北制藥股份有限公司;CD34抗體、兔抗人原始造血細(xì)胞單克隆抗體(批號(hào):12620110),購于北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司;VEGF抗體、rabbit IgG(批號(hào):10CM199),購于武漢博士德生物工程有限公司;二抗、(H+L)/HRP辣根酶標(biāo)記山羊抗兔(批號(hào):K126816A)、DAB濃縮顯色液、A液和B液(批號(hào):ZLI-9018)、原位末端標(biāo)記(TdT-mediated dUTP nick-end labeling,TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(批號(hào):12469600),均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

    6500型CO2培養(yǎng)箱(美國NAPCO),TE2101L型電子天平(德國賽多利斯),倒置顯微鏡(日本OLYMPUS),DM3000顯微鏡(德國Leica)。

    1.4 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的培養(yǎng)方法

    U87細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)基2~3天更換一次,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長情況。當(dāng)細(xì)胞生長至70%~80%融合時(shí)進(jìn)行傳代,用0.25%胰蛋白酶消化液進(jìn)行消化傳代,將培養(yǎng)基倒掉,用PBS洗兩遍,加消化液室溫下消化,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,當(dāng)細(xì)胞開始變圓,細(xì)胞間隙變大時(shí),加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化,用吸管輕輕吹打瓶底和瓶壁,按1瓶傳3瓶的比例接種,3到4天傳代一次。

    1.5 模型制備

    將U87細(xì)胞(5×107個(gè)細(xì)胞/只)接種到裸鼠(2只)右側(cè)腋窩、20天瘤塊長至2 cm(直徑),無菌剝離腫瘤成2 mm×2 mm×2 mm,用套管針將瘤塊移植至裸鼠(10只)右側(cè)腋窩,用火棉膠將切口粘住。17~19天再次長至2 cm(直徑),無菌剝離腫瘤成1 mm×1 mm×1 mm,再次移植裸鼠右側(cè)腋窩,用火棉膠將切口粘住。

    1.6 分組與給藥

    待動(dòng)物體內(nèi)瘤塊長至80~180 mm3時(shí),將裸鼠按瘤塊大小和體質(zhì)量采用分層隨機(jī)抽樣方法分為:模型組、陽性藥(替莫唑胺)對(duì)照組、抗瘤丸優(yōu)化方-4高、中、低劑量組,每組12只??沽鐾鑳?yōu)化方-4高、中、低劑量組藥物濃度分別為3.4 g、1.7 g、0.85 g生藥/kg,替莫唑胺膠囊藥物濃度為43 mg/kg。各藥物組按25 mL/kg灌胃給藥,模型組給予等體積去離子水,每天1次,連續(xù)給藥20天。

    1.7 指標(biāo)檢測

    給藥20天后處死裸鼠,取各組裸鼠的瘤塊,CD34免疫組化法染色,Weidner法計(jì)數(shù)微血管密度(microvascular density,MVD);血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)免疫組化法染色,圖像分析測定灰度值。TUNEL法檢測凋亡細(xì)胞,計(jì)算腫瘤細(xì)胞凋亡率。

    1.7.1 MVD檢測 取出經(jīng)10%福爾馬林固定,每組隨機(jī)取3個(gè)瘤塊,常規(guī)石蠟包埋、切片(每個(gè)腫塊切3張片子:第1切片取腫瘤最外側(cè)邊緣,第2切片取腫瘤正中,第3切片取前兩切片中間位置,厚度為4 μm)。CD34:(1)切片在65℃烤箱中烤片2小時(shí),常規(guī)脫蠟至水后PBS緩沖液洗2分鐘×5次;(2)3% H2O2室溫下孵育10分鐘,阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,PBS緩沖液洗2分鐘×5次;(3)0.01M檸檬酸緩沖液(PH=6.2)中進(jìn)行抗原熱修復(fù),高壓鍋中高溫高壓修復(fù)2小時(shí),自然冷卻后PBS緩沖液洗2分鐘×5次;(4)室溫下5%山羊血清封閉非特異性背景10分鐘,PBS緩沖液洗2分鐘×5次;(5)分別加CD34一抗(抗體用PBS稀釋,稀釋倍數(shù)1∶100)和VEGF一抗(抗體用PBS稀釋,稀釋倍數(shù)1∶20),4℃孵育過夜,PBS緩沖液洗2分鐘×5次;(6)物素化羊抗兔IgG(二抗),37℃孵育30分鐘,PBS緩沖液洗2分鐘×5次;(7)DAB顯色3~5分鐘,蘇木精復(fù)染2分鐘,清水沖洗干凈,鹽酸酒精快速分化,清水返藍(lán)5分鐘,逐級(jí)梯度酒精脫水、二甲苯透明,樹脂封片。

    MVD計(jì)數(shù)參照Weidner法如下:先在100倍下觀察整個(gè)切片,每張切片找出3個(gè)微血管密集區(qū),血管內(nèi)皮細(xì)胞被染成棕色,然后在200倍鏡下計(jì)數(shù)被CD34染色的微血管數(shù)目。微血管判斷標(biāo)準(zhǔn)如下:與鄰近的微血管、腫瘤細(xì)胞及其它結(jié)締組織成份不相連的、標(biāo)記清晰的內(nèi)皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞簇均可作為一個(gè)可計(jì)數(shù)的微血管。同一微血管的內(nèi)皮細(xì)胞,如染色清晰且相互分離,也可作為單獨(dú)的微血管計(jì)數(shù)。血管腔及腔內(nèi)紅細(xì)胞的存在不是確認(rèn)微血管的必備條件,對(duì)管腔直徑大于8個(gè)紅細(xì)胞或管壁有平滑肌存在的血管不進(jìn)行計(jì)數(shù)。

    1.7.2 VEGF灰度值檢測 VEGF免疫組化染色程序同CD34,每組選9張切片,用Leica DM顯微鏡在同一條件下觀察,每張切片上隨機(jī)選3個(gè)視野,通過Leica CAMER圖像采集系統(tǒng)(Lecia Qwin V3)采集圖像,分析測定每個(gè)視野內(nèi)30個(gè)免疫陽性反應(yīng)的灰度值。VEGF陽性判定如下:VEGF為細(xì)胞漿著色,染色陽性以細(xì)胞漿呈棕色顆粒狀為標(biāo)準(zhǔn),且著色明顯高于背景?;叶确譃?~256級(jí),反映不同的免疫陽性反應(yīng)著色強(qiáng)弱。測量所得灰度值越小,陽性表達(dá)越強(qiáng)。

    1.7.3 細(xì)胞凋亡率檢測 取材、包埋、切片同CD34和VEGF,石蠟包埋切片后采用TdT介導(dǎo)的TUNEL法檢測凋亡細(xì)胞,具體操作按說明書進(jìn)行。具體步驟如下:(1)切片常規(guī)脫蠟,二甲苯浸洗5分鐘×2次,梯度乙醇浸洗3分鐘×1次;(2)PBS漂洗2次,用proteinase K工作液處理組織15~30分鐘;(3)PBS漂洗2次,加入制備TUNEL反應(yīng)混合液(處理組用50 μL TdT+450 μL熒光素標(biāo)記的dUTP液混勻,模型組僅加50 μL熒光素標(biāo)記的dUTP液,陽性對(duì)照組先加入100 μL DNase I,反應(yīng)10分鐘,后面步驟同處理組;(4)加50 μL TUNEL反應(yīng)混合液(模型組僅加50 μL熒光素標(biāo)記的dUTP液)于標(biāo)本上,加蓋玻片在暗濕盒中37℃反應(yīng)1小時(shí);(5)PBS漂洗3次,加50 μL converter-POD于標(biāo)本上,加蓋玻片在暗濕盒中37℃反應(yīng)30分鐘;(6)PBS漂洗3次,加50 μL DAB底物,反應(yīng)在10分鐘;(7)PBS漂洗3次,蘇木素復(fù)染,常規(guī)脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。

    TUNEL染色切片觀察與分析:在Leica光學(xué)顯微鏡下觀察TUNEL染色,每組共取9個(gè)切片,每張切片在200倍視野下選取3個(gè)視野,計(jì)數(shù)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)和正常細(xì)胞數(shù)。凋亡細(xì)胞可見核中有棕褐色顆粒,凋亡細(xì)胞體積縮小,染色體斷裂成核碎片,形成膜包裹性的凋亡小體,正常細(xì)胞核呈藍(lán)色。統(tǒng)計(jì)凋亡陽性細(xì)胞所占的比例,計(jì)算腫瘤細(xì)胞凋亡率。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 各組U87裸鼠腫瘤組織MVD檢測

    與模型對(duì)照組比較,抗瘤丸優(yōu)化方-4低劑量組、陽性藥對(duì)照組的MVD值明顯降低(P<0.05)。經(jīng)免疫組化法染色顯示,CD34低表達(dá)。見表1、圖1。

    圖1 各組U87裸鼠腫瘤組織中CD34的表達(dá)(DAB,×200)

    表1 給藥20天后各組U87裸鼠腫瘤組織MVD比較

    2.2 各組U87裸鼠腫瘤組織VEGF檢測

    與模型對(duì)照組比較,抗瘤丸優(yōu)化方-4高、中、低劑量組、陽性藥對(duì)照組移植瘤灰度值明顯增高(P<0.05)。經(jīng)免疫組化法染色顯示,VEGF低表達(dá)。見表2、圖2。

    圖2 各組U87裸鼠腫瘤組織中VEGF的表達(dá)(DAB,×200)

    表2 給藥20天后各組U87裸鼠腫瘤VEGF灰度值比較

    2.3 各組U87裸鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率檢測

    與模型對(duì)照組比較,上述給藥組細(xì)胞凋亡率顯著增高 (P<0.05)。經(jīng)TUNEL染色,模型對(duì)照組可見少量呈棕褐色的凋亡細(xì)胞,抗瘤丸優(yōu)化方-4高、中、低劑量組、陽性藥對(duì)照組可見大量的凋亡細(xì)胞,具有明顯的促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。見表3、圖3。

    表3 給藥20天后各組U87裸鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率比較

    圖3 各組U87裸鼠腫瘤組織中的凋亡細(xì)胞TUNEL染色(×200)

    3 討論

    中醫(yī)認(rèn)為膠質(zhì)瘤的發(fā)生與痰濕凝聚、氣滯血瘀、肝腎不足密切相關(guān),主要治療法則是活血化瘀、扶正培本、健脾補(bǔ)腎、化痰軟堅(jiān)[6]??沽鐾枋怯?8味中藥組成的院內(nèi)制劑,其中君藥具有清熱利濕、活血化瘀的功效。臣藥配伍君藥起到清熱解毒,豁痰開竅的功效。白英等清熱利濕,解毒消腫;川貝母等潤肺祛痰開胸,利肺氣,通調(diào)水道以使痰濕下行;炒山楂等健脾開胃,可消食化積散瘀,防君臣之藥傷及脾胃。全方配伍共奏清熱解毒,活血化瘀,化痰散結(jié)之功。前期臨床研究表明,KLW可延長惡性膠質(zhì)瘤患者的生存時(shí)間,具有肯定療效,且價(jià)格低廉,有較好的開發(fā)價(jià)值和前景[7]。

    MVD是指生物組織如皮膚、肌肉、器官等組織中單位密度的微血管數(shù)量。MVD在臨床上應(yīng)用于惡性組織微血管新生、侵襲性以及預(yù)后評(píng)估的診斷,可以反映腫瘤的生長轉(zhuǎn)移[8]。VEGF是腫瘤血管生成的重要因子,與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系[9]。王奕丹等[10]研究MVD與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈正相關(guān),與患者的術(shù)后生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。李娜等[11]研究通過下調(diào)VEGF表達(dá),抑制了新生血管的生成,阻斷其營養(yǎng)供應(yīng),抑制腫瘤增殖,進(jìn)而發(fā)揮其抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用。抗瘤丸中白花蛇舌草、半枝蓮、白英等成分已有大量的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)證明了抗瘤機(jī)制。其中白花蛇舌草可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤細(xì)胞增值[12];半枝蓮能抑制腫瘤血管生成與轉(zhuǎn)移[13];白英可通過調(diào)控VEGF相關(guān)信號(hào)通路誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡[14]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,抗瘤丸優(yōu)化方-4能夠抑制VEGF的表達(dá),降低MVD,從而抑制腫瘤組織新生血管形成,同時(shí)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

    綜上所述,抗瘤丸優(yōu)化方-4對(duì)膠質(zhì)瘤有一定的作用效果,其作用機(jī)制可能與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,抑制VEGF的表達(dá)相關(guān),為抗瘤丸的進(jìn)一步開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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