竹節(jié)參超微粉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

張 鈺，李 鴻，鄭 露，黃 毅，

金星月1，涂 星2，3*，文德鑒2，3

1.湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部(湖北 恩施 445000)

2.武陵山中藥材檢驗(yàn)檢測中心(湖北 恩施 445000)

3.湖北本草鑒真生物科技有限公司(湖北 恩施 445000)

竹節(jié)參為五加科植物竹節(jié)參(Panax japonicusC.A.Mey.)的干燥根莖，其味甘、微苦，性溫，歸肝、脾、肺經(jīng)，有散瘀止血，消腫止痛，祛痰止咳，補(bǔ)虛的功效，常用于肺癆咯血，跌打損傷，咳嗽痰多，病后虛弱[1]，其野生資源瀕臨滅絕[2]，藥材多為栽培品種?，F(xiàn)代化學(xué)研究表明[3－6]竹節(jié)參含皂苷類、氨基酸、糖類、揮發(fā)油和微量元素等；其中皂苷為主要有效成分，以齊墩果烷型、達(dá)瑪烷型、奧寇梯木醇型和甾醇型為主?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)[7－8]竹節(jié)參具有多種生物活性，對消化系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、炎癥、糖尿病、肥胖、慢性疲乏綜合癥、腫瘤等均有不同程度的藥理作用。

超微粉碎技術(shù)是將物料顆粒粉碎至微米級甚至納米級微粉的過程。將竹節(jié)參采用現(xiàn)代粉體技術(shù)微粉化，既遵循了中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)前提、保留了傳統(tǒng)飲片的優(yōu)點(diǎn)，又能夠充分發(fā)揮微粉分散性好、溶解性強(qiáng)、生物利用度高的特點(diǎn)。但目前尚未見竹節(jié)參超微粉及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的相關(guān)報(bào)道。本研究以竹節(jié)參超微粉為研究對象，開展了顯微鑒別和薄層鑒別，并測定其粒徑，同時(shí)采用HPLC法測定其主要有效成分竹節(jié)參皂苷Ⅳa和人參皂苷Ro的含量，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定和質(zhì)量控制提供參考和借鑒。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥材與試劑竹節(jié)參鮮品(6年份栽培品)，采于恩施市新塘鄉(xiāng)雙河鎮(zhèn)，經(jīng)湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部朱敏英副教授鑒定為五加科植物竹節(jié)參[Panax ja-ponicusC.A.Mey.]的根及根莖；竹節(jié)參超微粉(批號S20191225、S20200107、S20200116，實(shí)驗(yàn)室自制，采用80℃干燥3 h竹節(jié)參藥材高頻震動(dòng)研磨機(jī)于5～10℃研磨12h所制)；竹節(jié)參皂苷Ⅳa標(biāo)準(zhǔn)品(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，批號17030201)，人參皂苷Ro(中國食品藥品檢定研究院，批號111903－201604)，乙腈(HPLC級，批號20200906)、甲醇(HPLC級，批號20201115)，均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器高頻震動(dòng)研磨機(jī)(LRVM－MHS－BE型，山東龍脈科技發(fā)展有限公司)；智能激光粒度分析儀(Winner3003型，濟(jì)南微納顆粒儀器股份有限公司)；高效液相色譜儀(LC－2030C，日本島津公司)；電子分析天平(XSR105/AC，梅特勒公司)；超純水機(jī)(Mili－Q Direct－Q?5UV，法國密理博)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ－500DE型，昆山市超聲儀器有限公司)；循環(huán)水真空泵(SHZ－Ⅲ型，上海亞榮生化儀器廠)；高速多功能粉碎機(jī)(YB－2000A型，浙江永康市速鋒工貿(mào)有限公司)；全自動(dòng)移液器(S1200 Smartpipette型，量程50～1 200μL，ronlabs公司)，離心機(jī)(TD5A－WS型，湖南湘儀)。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別竹節(jié)參超微粉末呈黃白色，取竹節(jié)參超微粉粉末裝片，顯微鏡下400倍觀察。可見極少量破碎厚角細(xì)胞和木栓細(xì)胞，破碎樹脂道、油細(xì)胞和淀粉粒較常見，見圖1。

2.2 薄層色譜鑒別取竹節(jié)參超微粉1.2 g，加60%甲醇溶液25 mL，超聲40min，3000 r/min離心5 min，取上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過，續(xù)濾液作為供試品溶液。取人參皂苷Ro和竹節(jié)參皂苷Ⅳa對照品，分別加入60%甲醇制成每1 mL溶液含人參皂苷Ro、含竹節(jié)參皂苷Ⅳa1 mg的溶液作為對照品溶液。吸取供試品溶液、對照品溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－甲酸－水(4.5∶1.5∶0.1∶0.3)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%的硫酸－乙醇溶液，在105℃下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，見圖2。

圖2 竹節(jié)參粉末薄層鑒別圖

2.3 竹節(jié)參超微粉粒徑分布取所制備的3批次竹節(jié)參超微粉，采用激光散射粒度分布儀測定其粒徑分布，以空氣作為介質(zhì)，分散氣壓0.2 MPa，物質(zhì)折射率1.520/0.1(實(shí)部/虛部)，介質(zhì)折射率1.000，折光率3～20，采用R－R分布模式進(jìn)行分析，以D90粒徑作為衡量粒徑的標(biāo)準(zhǔn)。測定3次，竹節(jié)參超微粉的D90粒徑均＜100μm，見表1。

表1 竹節(jié)參超微粉粒徑分布

2.4 竹節(jié)參主要有效成分的含量測定

2.4.1 溶液的制備

2.4.1.1 對照品溶液的配制 分別精密稱取人參皂苷Ro和竹節(jié)參皂苷Ⅳa對照品適量，加60%甲醇溶解制成每1 mL含1.0 mg的溶液，即得。

2.4.1.2 供試品溶液的配制 精密稱取竹節(jié)參超微粉1.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇25 mL，精密稱定其重量，25℃超聲處理(功率500 W，頻率28 KHz)40 min，精密稱重，補(bǔ)足減失的量，以3000 r/min，離心5 min，取上清液，0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性 以Shim－pack GIS C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm)為固定相，以乙腈－0.15%磷酸水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫:0～3 min，25∶75；3～11 min，25∶75→33∶67；11～35 min，33∶67；35～40 min，33∶67→37∶63；40～50 min，37∶63；檢測波長203 nm；柱溫40℃，進(jìn)樣量20 μL。取2.4.1項(xiàng)下對照品溶液、供試品溶液及60%甲醇按2.4.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣(見圖3)。在該色譜條件下，人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa的保留時(shí)間分別為10.3、17.5 min，分離度R＞1.5，理論塔板數(shù)以人參皂苷Ro≥10 000，表明樣品中的人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa分離良好，陰性無干擾。

圖3 HPLC圖譜

2.4.3 線性關(guān)系考察 精密量取2.4.1項(xiàng)下人參皂苷Ro和竹節(jié)參皂苷Ⅳa標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0于5 mL容量瓶中，用60%甲醇定容即得濃度分別為20、40、100、200、400μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液。將對照品溶液按2.4.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，以對照品溶液濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果人參皂苷Ro標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y＝15396.4509X－6214.1312，r＝0.9997；竹節(jié)參皂苷Ⅳa標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y＝29 686.483 5X－963 3，r＝0.9998。結(jié)果表明人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa在20～400μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.4 精密度實(shí)驗(yàn) 取2.4.1項(xiàng)下20、40、100μg/mL的人參皂苷Ro、竹節(jié)參皂苷Ⅳa對照品溶液，按2.4.2項(xiàng)下的色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10μL，以峰面積計(jì)算穩(wěn)定性RSD。人參皂苷Ro的RSD分別為1.71%、1.37%、1.21%，竹節(jié)參皂苷Ⅳa的RSD分別為1.52%、0.95%、0.87%，表明儀器精密度良好。

2.4.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取2.4.1項(xiàng)下S20191225批次供試品溶液，室溫放置，分別于0，2，4，6，8，10，12，18，24 h時(shí)分別進(jìn)樣，測定峰面積。結(jié)果人參皂苷Ro峰面積RSD為3.07%，竹節(jié)參皂苷Ⅳa峰面積RSD為2.31%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取S20191225批次竹節(jié)參超微粉6份，按照2.4.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照2.4.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果人參皂苷Ro和竹節(jié)參皂苷Ⅳa峰面積RSD分別為1.65%、1.87%，表明本方法重復(fù)性較好。

2.4.7 加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密稱取9份0.1 g已知人參皂苷Ro和竹節(jié)參皂苷Ⅳa含量分別為4.74%、3.51%的竹節(jié)參超微粉，分別加入人參皂苷Ro和竹節(jié)參皂苷Ⅳa標(biāo)準(zhǔn)品(相當(dāng)于超微粉中竹節(jié)參皂苷Ⅳa含量的80%、100%、120%)，按2.4.1項(xiàng)下制備方法制備供試品溶液，并按2.4.2項(xiàng)下進(jìn)樣，計(jì)算平均回收率。人參皂苷Ro平均加樣回收率分別為99.75%、100.78%、98.35%，RSD分別為0.75%、2.44%、0.45%；竹節(jié)參皂苷Ⅳa平均加樣回收率分別為98.52%、101.13%、100.28%，RSD分別為1.14%、1.17%、2.17%，見表2、表3。

表2 人參皂苷Ro加樣回收率試樣結(jié)果

表3 竹節(jié)參皂苷Ⅳa加樣回收率試樣結(jié)果

2.4.8 人參皂苷Ro和竹節(jié)參皂苷Ⅳa含量測定 取2.4.1項(xiàng)下供試品溶液，按照2.4.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，供試品進(jìn)樣3次，測定峰面積，計(jì)算人參皂苷Ro和竹節(jié)參皂苷Ⅳa含量，見表4。

表4 竹節(jié)參中竹節(jié)參皂苷Ⅳa含量的測定結(jié)果

3 討論

中藥超微粉是對傳統(tǒng)中藥材進(jìn)行處理后保留活性成分的粉末[9]。中藥超微粉碎后可以充分提取其化學(xué)成分，但可能會存在部分物質(zhì)的丟失和不良反應(yīng)的發(fā)生，中藥超微粉技術(shù)有95%以上的細(xì)胞破壁率，能使在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的中藥活性成分迅速釋放，發(fā)揮作用[10－12]。超微粉碎后中藥材原有的性質(zhì)發(fā)生了破壞，細(xì)胞破壁后的顯微特征破壞較為明顯，這導(dǎo)致原有的一些傳統(tǒng)方法不再是鑒別超微粉的主要方式[13]，所以需要一些方法來建立中藥超微粉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本研究發(fā)現(xiàn)，竹節(jié)參的顯微組織結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，見不到完整的導(dǎo)管、簇晶等鑒別特征，僅能見到碎片，D90粒徑均低于100μm，提示所制備的超微粉達(dá)到了破壁的基礎(chǔ)要求。本研究所建立的薄層色譜鑒別和含量測定方法與中國藥典要求一致，但所測得人參皂苷Ro和竹節(jié)參皂苷Ⅳa含量均超過3.0%，遠(yuǎn)超過藥典規(guī)定的1.5%限度標(biāo)準(zhǔn)[1]，可能與本研究所用藥材為6年生有關(guān)，也可能是超微粉有效成分溶出率增加所致，有待進(jìn)一步研究。