雞糞好氧堆肥腐熟度、重金屬殘留及微生物菌群分析

王秀紅，史向遠(yuǎn)，張紀(jì)濤，王豫霞，李欣欣，周 靜，趙紅葉

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西有機(jī)旱作農(nóng)業(yè)研究院，山西太原 030031；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究中心，山西太原 030031；3.太谷縣鴻昊養(yǎng)殖專業(yè)合作社，山西太谷 030800）

隨著禽類養(yǎng)殖的規(guī)?；?、集約化和產(chǎn)業(yè)化的快速發(fā)展，我國每年畜禽糞便的產(chǎn)生量大約有38 億t，其中，肉蛋雞糞便占到16.3%，約有6.2 億t[1-3]。由于畜禽糞污產(chǎn)生集中，而且排放量較大，再加上糞污處理的設(shè)施裝備落后，農(nóng)田消納跟不上，這些因素成為制約畜禽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要瓶頸[4]。雞的腸道較短，消化飼料的能力弱于其他畜種，排出的雞糞一旦暴露到空氣中即易形成NH3等惡臭氣體。為了防治疾病或促進(jìn)畜禽生長，一些重金屬元素如Cu、Zn、As、Cd 和Pb 等會(huì)通過飼料或以伴生礦的形式進(jìn)入畜禽體內(nèi)，由于這些元素不能完全被吸收且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，最后隨糞便排出體外[5-6]。此類有害氣體、重金屬和雞糞中存在的病原微生物不僅對環(huán)境造成污染而且危害到人體健康，成為我國主要的農(nóng)業(yè)面源污染[7-8]。雞糞中含有農(nóng)作物生長所必需的氮、磷、鉀等營養(yǎng)元素和豐富的有機(jī)質(zhì)，是很好的有機(jī)肥源[9]。如何高效快捷地對雞糞進(jìn)行無害化處理并得到資源化利用，已成為當(dāng)今農(nóng)業(yè)領(lǐng)域需要解決的熱點(diǎn)問題。

當(dāng)前，好氧堆肥技術(shù)是實(shí)現(xiàn)雞糞減量化、無害化和資源化的有效手段。好氧堆肥可以固化重金屬、抗生素、殺死蟲卵和多種病原微生物，從而獲得穩(wěn)定、安全的堆肥產(chǎn)品，再進(jìn)一步加工成有機(jī)肥施入農(nóng)田，可改善土壤結(jié)構(gòu)，提高土壤肥力[10-13]。在實(shí)際的生產(chǎn)應(yīng)用中，雞糞堆肥常出現(xiàn)腐熟不徹底，施入土壤后燒苗和長霉菌現(xiàn)象，有必要對有機(jī)肥廠的好氧堆肥過程進(jìn)行監(jiān)測，以確保堆肥效果。微生物群落的演替是堆肥過程順利進(jìn)行的反應(yīng)[14]，利用高通量測序技術(shù)研究雞糞堆肥發(fā)酵中微生物群落多樣性，可深入了解好氧發(fā)酵堆肥不同階段的菌群組成結(jié)構(gòu)及其演替過程[15]。

本研究通過對雞糞條垛堆的發(fā)酵過程進(jìn)行監(jiān)測，研究養(yǎng)殖場條垛式堆肥的腐熟度效果及對重金屬含量的影響，并對堆體內(nèi)微生物的豐度變化進(jìn)行分析，以期為養(yǎng)殖場有機(jī)肥生產(chǎn)初期堆肥產(chǎn)品的腐熟度及安全性提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

雞糞、煙絲和糠醛均由太谷縣鴻昊養(yǎng)殖專業(yè)合作社提供和購買。堆肥原料的基本理化性質(zhì)如表1所示。

表1 堆肥原料的基本理化性質(zhì)

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在太谷縣鴻昊養(yǎng)殖專業(yè)合作社養(yǎng)殖場的發(fā)酵車間進(jìn)行。以固液分離后的雞糞為主要原料，煙絲、糠醛為輔料進(jìn)行條垛式好氧堆肥。堆體大小為長20.0 m、寬1.5 m、高1.35 m，設(shè)置2 次堆肥試驗(yàn)，分別記為堆1 和堆2，在堆制第0、8、18、21、28、33、38、45、60 天堆溫升高欲降低時(shí)利用翻拋機(jī)翻堆，混合取樣，部分樣品冷藏或自然風(fēng)干用于腐熟度及其他理化指標(biāo)測定；部分樣品保存于-20 ℃冰箱用于高通量測序。

1.3 測定項(xiàng)目及方法

1.3.1 理化指標(biāo)測定 采用RC-4HC 型便攜式溫濕度記錄儀實(shí)時(shí)監(jiān)測定堆體內(nèi)40 cm 深度處溫度，每1.5 h 記錄一次；測試樣品物料于105 ℃的烘箱中烘干8 h 至恒質(zhì)量，測定含水率。采用馬弗爐高溫灼燒（600 ℃）4 h 至恒質(zhì)量測定有機(jī)質(zhì)含量。利用TOC 儀測定總有機(jī)碳，凱氏定氮儀測定總氮。

將新鮮堆肥樣品與蒸餾水按1∶10（m/V）混合于三角瓶中，于水平搖床上振蕩30 min，靜置10 min，上清經(jīng)濾紙過濾后收集，用便攜式pH/電導(dǎo)率儀測定pH 和EC[16-18]。發(fā)芽指數(shù)（GI）的測定方法參照NY/T3442—2019 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。重金屬含量采用原子吸收法測定[10]。

1.3.2 高通量測序 細(xì)菌和真菌的基因組DNA 參照OMEGA 試劑盒方法進(jìn)行提取。細(xì)菌PCR 所用測序引物為16S V3～V4 通用引物，正向引物：5′-ACTC CTACGGGAGGCAGCA-3′，反向引物：5′-GGACTAC HVGGGTWTCTAAT-3′。真菌PCR 所用引物為ITS V1 引物，正向引物：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAAC AAGG-3′，反向引物：5′-GCTGCGTTCTTCATCGAT GC-3′。PCR 擴(kuò)增條件：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性15 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，26 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min；12 ℃結(jié)束反應(yīng)。采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。高通量測序采用Illumina Miseq 測序平臺進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)分析

測序數(shù)據(jù)經(jīng)DADA 2 方法進(jìn)行去引物，質(zhì)量過濾，去重、去噪，拼接和去嵌合體等，得到特征序列。用QIIME 2 軟件分別在Greengenes 數(shù)據(jù)庫和UNITE數(shù)據(jù)庫對特征序列進(jìn)行物種分類學(xué)注釋，獲得在門、綱、目、科、屬、種6 個(gè)分類水平上的物種豐度情況。采用Microsoft Excel 2007 進(jìn)行基本數(shù)據(jù)整理，用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行方差分析，并采用Duncan 多重比較進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 堆體溫度的變化

溫度是表征畜禽糞便堆肥能否正常進(jìn)行的關(guān)鍵因素之一。在-14～4 ℃的環(huán)境溫度下，2 種堆體均進(jìn)行了8 次翻堆。堆1 建堆后溫度開始上升，第4 天達(dá)到40 ℃以上，第8 天達(dá)到50 ℃以上，經(jīng)過第1 次翻堆后，堆體溫度上升至56.9 ℃，第2 次和第3 次翻堆均在40～50 ℃，在第4 次翻堆后，即第22 天溫度上升至55 ℃以上，到發(fā)酵第60 天堆肥結(jié)束，堆體55 ℃以上溫度持續(xù)時(shí)間為37 d。堆2 在第1 天溫度上升至45 ℃，第2 天達(dá)50 ℃以上，第3 天即上升至55 ℃，第4 天為59.9 ℃，第1 次翻堆后，堆體溫度在40～50 ℃，第2 次翻堆后溫度很快上升至55 ℃以上，到第4 次翻堆后達(dá)到71.2 ℃，除了堆體因翻堆溫度計(jì)記錄溫度有所下降外，堆體在55 ℃以上持續(xù)時(shí)間第1 次為12 d，第2 次為27 d（圖1）。說明2 種堆體在環(huán)境溫度為白天0～19 ℃、夜間-14～1 ℃的條件下完全能夠達(dá)到無害化和穩(wěn)定化的要求。

2.2 不同發(fā)酵階段堆體腐熟度變化

從表2 可以看出，經(jīng)過條垛堆體的晾曬發(fā)酵，堆體含水率下降差異顯著，堆1 和堆2 的含水率在第33 天分別下降至42.12%和41.79%；第60 天后則分別下降至34.00%和39.73%。pH 值呈現(xiàn)顯著性上升趨勢，2 個(gè)堆體在第33 天均達(dá)到最高值，分別為9.07 和8.77；堆制結(jié)束時(shí)，2 個(gè)堆體的pH 值分別為8.70 和8.51，堆體由最初的酸性環(huán)境變成堿性環(huán)境。初始堆體的EC 值均較高，堆1 和堆2 的EC 值分別達(dá)到9.75、9.26 mS/cm；到第33 天時(shí)，2 個(gè)堆體的EC 值顯著下降，分別為6.66、5.78 mS/cm；第60 天分別為7.30、6.06 mS/cm，下降了25.13%和34.56%。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，堆1 和堆2 的有機(jī)質(zhì)含量顯著下降，堆制結(jié)束時(shí)分別下降了21.37%和16.83%。雞糞堆肥初始物料的發(fā)芽指數(shù)很低，堆1 和堆2 分別為4.22%和5.06%；到第21 天2 個(gè)堆體的發(fā)芽指數(shù)均顯著上升，分別達(dá)到44.42%和40.58%；在堆制結(jié)束時(shí)，分別達(dá)到了86.57%和111.91%。

表2 不同堆肥階段堆料腐熟度分析

2.3 不同階段堆料中重金屬含量變化

對堆1 不同發(fā)酵階段的堆料進(jìn)行了重金屬檢測，不同種類重金屬的含量差異較大。由表3 可知，堆體中砷（As）、鉛（Pb）和鉻（Cr）的含量較高，分別為1.22～4.92、3.50～12.08、7.53～23.67 mg/kg，汞（Hg）和鎘（Cd）的含量較低，分別為0.02～0.20、0.09～0.13 mg/kg。在第33 天，與初始物料相比，堆料的Cd 含量無顯著差異，As、Pb 和Cr 含量顯著提高，Hg 含量顯著下降。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，Hg 含量上升，As、Pb 和Cr 含量均下降。熟化后堆肥除Cd 外，其他重金屬含量均顯著提高，As、Hg、Pb 和Cr 含量分別比發(fā)酵結(jié)束時(shí)提高了1.02 倍、4.00 倍、1.52 倍和0.93 倍。

表3 不同發(fā)酵階段堆料重金屬含量變化 mg/kg

2.4 雞糞堆肥中微生物菌群表達(dá)豐度分析

從圖2 可以看出，雞糞好氧堆肥期間相對表達(dá)豐度高于0.01%的真菌門類有6 個(gè)，表達(dá)豐度較高的4 個(gè)門為子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、毛霉菌門（Mucoromycota）和油壺菌門（Olpidiomycota）。子囊菌門在整個(gè)堆肥階段均維持較高的表達(dá)豐度，達(dá)80.5%～95.7%，擔(dān)子菌門、毛霉菌門和油壺菌門的相對表達(dá)豐度分別為0.04%～2.70%、0.03%～2.90%和0～1.90%。球囊菌門（Mortierellomycota）和羅茲菌門（Rozellomycota）僅是在發(fā)酵的初期和末期有較低的表達(dá)。在真菌屬水平上，相對表達(dá)豐度較高的屬為念珠菌屬（Candida）、畢赤酵母屬（Pichia）、鏈格孢菌屬（Alternaria）、曲霉屬（Aspergillus）、Diutina、干酵母屬（Xeromyces）、Sodiomyces。在建堆初期，念珠菌屬、畢赤酵母屬、曲霉屬豐度較高，堆制8 d 后則念珠菌屬豐度上升；堆制21 d 后，則以鏈格孢菌屬豐度較高；33 d 后，畢赤酵母屬、Diutina 和Xeromyces 較高；第60 天則以子囊菌門的鏈格孢菌屬和Sodiomyces 表達(dá)豐度最為豐富，其余菌屬均較初期降低，真菌病原微生物念珠菌屬表達(dá)豐度明顯下降，由第8 天的66.9%下降至5.5%。

由圖3 可知，不同階段雞糞堆肥中，相對表達(dá)豐度較高的細(xì)菌門類為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）。擬桿菌門在第33、60 天中表達(dá)豐度較高。建堆初期，厚壁菌門表達(dá)豐度達(dá)97%，到堆制8 d 后，厚壁菌門為19.4%，放線菌門的豐度顯著升高，達(dá)到78.5%；堆置21 d 后厚壁菌門豐度增加（88.8%），放線菌門減少（0.2%），擬桿菌門和變形菌門在堆肥結(jié)束時(shí)表達(dá)豐度均有增加；在培養(yǎng)第33、60 天后，4 種門類豐度均高于1%。在整個(gè)發(fā)酵過程中，厚壁菌門起初豐度最高，發(fā)酵8 d后降低，發(fā)酵21 d 后上升，在第33、60 天時(shí)均有較高豐度。擬桿菌門則是在堆肥后期有較高豐度。放線菌門在第8 天豐度急劇上升，在后期豐度保持在較高豐度。變形菌門是在前期較低，后期豐度上升。4 種菌門在后期及有機(jī)肥階段均有較高的豐度。在屬水平上，整個(gè)發(fā)酵期相對表達(dá)豐度較高的屬為棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、梭菌屬（Clostridium）、Caldicoprobacter、依格納季氏菌屬（Ignatzschineria）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、薄壁芽孢桿菌屬（Gracilibacillus）、Sporanaerobacter、食堿菌屬（Alcanivorax）、糞產(chǎn)堿菌屬（Alcaligenes）。在建堆初期，以厚壁菌門的梭菌屬和Caldicoprobacter 的豐度較高，堆制8 d 后則以放線菌門的棒狀桿菌屬、厚壁菌門的梭菌屬和芽孢桿菌屬較高；堆制21 d 后，則以變形菌門的依格納季氏菌屬、厚壁菌門的芽孢桿菌屬和Tepidimicrobium 豐度較高；33 d 后，以厚壁菌門的芽孢桿菌屬和薄壁芽孢桿菌屬較高；成品有機(jī)肥則以芽孢桿菌屬和薄壁芽孢桿菌屬、變形菌門的食堿菌屬和糞產(chǎn)堿菌屬較高。

3 結(jié)論與討論

新鮮畜禽糞便中含有一些危害作物生長的物質(zhì)，如尿酸、有機(jī)酸、氨態(tài)氮、蟲卵、病原菌和重金屬等[19]，因此，畜禽糞便必須經(jīng)過堆肥腐熟后才可用作有機(jī)肥，無害化和穩(wěn)定性是雞糞堆肥的主要目標(biāo)。本研究中堆體55 ℃以上高溫持續(xù)時(shí)間均高于15 d，達(dá)到了無害化要求。堆料含水率在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，堆料含水率下降明顯，均小于45%。微生物在雞糞堆肥過程中將蛋白質(zhì)等含氮物質(zhì)降解產(chǎn)生NH4+，引起pH 值的升高，堆體處于一個(gè)堿性環(huán)境。本研究中，2 種堆體的pH 起初均呈酸性，隨著堆制時(shí)間延長，堆體pH 值上升，到堆制60 d 時(shí)，堆體pH 值在8～9[20]，滿足堆肥產(chǎn)品為弱堿性的要求。EC 是評價(jià)堆肥產(chǎn)品的重要指標(biāo)之一[21]。當(dāng)EC 高于4 mS/cm時(shí)，堆肥產(chǎn)品會(huì)對植物生長產(chǎn)生抑制作用。雞糞中含鹽量高，經(jīng)過好氧堆肥，盡管堆體的EC 值分別下降了25.13%和34.56%，但對于田間使用來說，本研究中的EC 值均大于4 mS/cm，仍處于一個(gè)較高的水平。堆肥原料中的EC 對堆料結(jié)果影響較大，雞糞、煙絲、糠醛的粒徑細(xì)小，堆體結(jié)構(gòu)比較致密，導(dǎo)致堆肥產(chǎn)品EC 偏高，這一結(jié)果與張邦喜等[22]的結(jié)果相一致。通過好氧堆肥，堆料的有機(jī)質(zhì)含量呈下降趨勢，第60 天時(shí)有機(jī)質(zhì)含量在60%以上。種子發(fā)芽指數(shù)（GI）也是評價(jià)堆肥腐熟程度的重要指標(biāo)，未腐熟的畜禽糞便施入土壤中，會(huì)對農(nóng)田種子發(fā)芽和作物生長有毒害作用，所以，GI 是有機(jī)肥利用中首要考慮的因素，當(dāng)GI 超過80%時(shí)，認(rèn)為堆肥已經(jīng)腐熟或?qū)χ参餂]有毒性[23-24]。雞糞堆肥初始GI 很低，說明未腐熟過的雞糞用于作物種植有很大的風(fēng)險(xiǎn)。本研究中，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，GI 明顯上升，說明堆體中不利于發(fā)芽的因素逐漸被消除，到堆肥60 d 后，GI 達(dá)到了80%以上，基本趨于穩(wěn)定。重金屬含量是影響有機(jī)肥的品質(zhì)指標(biāo)之一。鄧雯文等[25]研究表明，As、Cd 和Pb 在發(fā)酵過程中存在先升高后下降的趨勢。本研究中不同階段的發(fā)酵物料其各項(xiàng)重金屬含量也存在波動(dòng)，腐熟后堆體重金屬含量升高，這應(yīng)該與好氧堆肥存在濃縮效應(yīng)有關(guān)。YANG 等[26]研究表明，隨之堆肥過程中有機(jī)質(zhì)的降解和物質(zhì)的揮發(fā)，物質(zhì)總量不斷減少，重金屬含量相應(yīng)升高。本研究中堆肥結(jié)束時(shí)，5 種重金屬的含量均低于標(biāo)準(zhǔn)限制濃度，說明該雞場雞糞堆肥不存在重金屬超標(biāo)現(xiàn)象。由以上結(jié)果表明，2 種堆肥均達(dá)到畜禽糞便堆肥技術(shù)規(guī)范（NY/T 3442—2019）[27]要求。

本研究中雞糞好氧堆肥期間相對表達(dá)豐度較高的真菌門類為子囊菌門，這與XIE 等[28]的研究結(jié)果一致。XIE 等[28]研究表明，念珠菌屬、Trichosporon、Kodamaea 和Filabasidium 對人體和動(dòng)物均有潛在的危害，不同堆肥處理的病原菌念珠菌屬相對豐度隨堆肥過程的進(jìn)行而降低。本研究中念珠菌屬在發(fā)酵初期表達(dá)豐度較高，到后3 次翻堆時(shí)，念珠菌屬的表達(dá)大幅下降，由66.9%下降至5.5%。曲霉屬、Malbranchea 和Mycothermus 在堆肥成熟階段表達(dá)豐度較高，它們在高溫好氧堆肥中可以降解纖維素和半纖維素[28]。本研究中，鏈格孢菌屬、曲霉屬在堆肥期間均有較高豐度，應(yīng)該與降解大分子有機(jī)化合物有關(guān)。雞糞堆肥的優(yōu)勢細(xì)菌門為厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和變形菌門，這與ZHONG 等[29]的結(jié)果一致。本研究中成品有機(jī)肥的芽孢桿菌屬和薄壁芽孢桿菌屬、變形菌門的Alcanivorax 和糞產(chǎn)堿菌屬較高。雞糞中的主要細(xì)菌病原菌為大腸桿菌和沙門氏菌，它們分別屬于變形菌門的埃希氏菌屬和沙門氏菌屬，在本研究中未檢測到大腸桿菌和沙門氏菌。從真菌和細(xì)菌表達(dá)豐度的結(jié)果表明，雞糞堆肥減少了部分病原菌的豐度。由于對畜禽糞污病原菌信息掌握不夠，對于與病原菌相關(guān)的微生物種類及其表達(dá)豐度還有待進(jìn)一步分析。