外源H2O2 對NaCl 脅迫下苜蓿幼苗生理特性的影響

付 咪，何林衛(wèi)，李鮮花，李 強

（1.榆林學(xué)院陜西省陜北礦區(qū)生態(tài)修復(fù)重點實驗室，陜西榆林 719000；2.榆林學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，陜西榆林 719000）

自然界中很多環(huán)境因子如鹽、重金屬、干旱等都會影響植物的正常生長發(fā)育，其中，鹽和重金屬是影響最普遍的2 種脅迫因子[1]。鹽脅迫對植物生長發(fā)育不同階段的影響有明顯差異，其中在植物種子萌發(fā)期受脅迫影響較為顯著[2]。植被生長發(fā)育時，如果有鹽脅迫存在，會使?jié)B透脅迫增加而導(dǎo)致水分脅迫，從而造成土壤中其他植物毒素或離子增加[3]。除此以外，鹽脅迫還會降低碳的利用效率，對代謝途徑中的關(guān)鍵因子酶的活性造成抑制作用[4-5]。因此，對于鹽脅迫下如何提高植物的萌發(fā)及生長，揭示其影響機制成為目前植物生理方向研究的熱點[6]。有研究表明，鹽脅迫會抑制苜蓿正常的光合作用及生長發(fā)育[7]。我國鹽漬土面積范圍較廣，鹽脅迫會一定程度威脅到植物細(xì)胞的正常代謝過程[8]，對植物發(fā)芽率、發(fā)芽勢和一些生理生化指標(biāo)有明顯的抑制作用。鹽脅迫對種子萌發(fā)和幼苗生長的影響研究表明，對植物危害較大的以Na 鹽和Ca 鹽為主，其中最常見的為Na 鹽[9]。大量研究表明，植物生長調(diào)節(jié)劑及礦質(zhì)元素在提高植物抗逆性方面具有較大的應(yīng)用潛力[10]。近年來，外源H2O2在提高植物發(fā)芽率、發(fā)芽勢、葉綠素含量等方面的研究也日益增多，利用外源物質(zhì)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗逆性是提高植物抵御不良環(huán)境的有效方法。過氧化氫（H2O2）是生物體內(nèi)的一種活性氧分子，也是生物細(xì)胞應(yīng)答逆境脅迫的重要信號分子，廣泛參與植物的抗性反應(yīng)[11-12]。焦德志等[13]研究認(rèn)為，植物在鹽脅迫下的主要生理響應(yīng)是合成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，提高酶活性及植物抗鹽性。過氧化氫是植物代謝過程中重要的信號分子，對調(diào)節(jié)植物抗逆性具有重要作用[14]。有學(xué)者認(rèn)為，外源H2O2可以改善植物生理特性，對提高植物抗鹽性具有一定的作用[15]。劉建新等[16-17]研究認(rèn)為，外源H2O2顯著提高了燕麥保護酶活性，降低了電導(dǎo)率和MDA 含量，且外源H2O2可通過提高植物滲透物質(zhì)含量以緩解鹽堿脅迫對植物生長的危害?；羝交鄣萚18]研究表明，100 mmol/L NaCl 對苜蓿種子萌發(fā)和幼苗生長均有抑制作用。

本試驗以不同品種的苜蓿種子為研究對象，探究外源H2O2對鹽脅迫下苜蓿幼苗生長及生理特性的影響，旨在為榆林地區(qū)苜蓿優(yōu)質(zhì)高效育種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為飽滿、大小均一且品質(zhì)優(yōu)良的甘農(nóng)三號（GN3）、勞勃（LB）、敖漢（AH）3 種苜蓿種子。

1.2 試驗方法

試驗于2020 年4—9 月在榆林學(xué)院恒溫光照培養(yǎng)箱和生理生化實驗室進(jìn)行。試驗共設(shè)7 個處理，分別為：CK1.不加NaCl 和H2O2營養(yǎng)液，為對照；CK2.100 mmol/L NaCl 溶液處理；T1.100 mmol/L NaCl 和0.05% H2O2；T2.100 mmol/L NaCl 和0.1%H2O2；T3.100 mmol/LNaCl 和0.5%H2O2；T4.100 mmol/L NaCl 和1% H2O2；T5.100 mmol/L NaCl 和2% H2O2。按照試驗設(shè)計，將苜蓿種子置于培養(yǎng)皿內(nèi)，放入恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待種子萌發(fā)長出2 片子葉后，移植到裝有等量干凈沙土的花盆中，每盆移栽10 株，繼續(xù)放置于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。前期對所有盆栽進(jìn)行Hoagland 營養(yǎng)液定期定量噴施[19]，待幼苗長出3 片子葉時，每天用H2O2處理液進(jìn)行葉面噴施（等量20 mL），連續(xù)處理10 d 后停止，每個處理3 個重復(fù)。在苜蓿幼苗生長7 d 后在每個處理的3 個重復(fù)中隨機各取5 株采集葉片帶回實驗室進(jìn)行各項生理指標(biāo)的測定。

1.3 測定項目及方法

采用丙酮法[20]進(jìn)行葉綠素含量測定；采用硫代巴比妥酸法[21]進(jìn)行丙二醛（MDA）含量測定；采用紫外吸收法[22]進(jìn)行過氧化氫酶（CAT）活性測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)試驗結(jié)果的平均值，采用Microsoft Excel 2010 制圖，采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 過氧化氫對苜蓿葉片葉綠素含量的影響

由圖1 可知，與CK1 相比，3 種苜蓿種子在CK2處理下葉綠素含量均降低，LB 降低0.27 mg/g，GN3降低0.54 mg/g，AH 降低0.19 mg/g，說明100 mmol/L NaCl 脅迫下，能顯著降低苜蓿幼苗葉綠素含量。3 個品種苜蓿在T1、T2、T3 處理下葉綠素含量分別高于CK2，且LB 的葉綠素含量在T2 處理最高，為0.92 mg/g，較CK2 增加0.46 mg/g，GN3 和AH 均在T3 處理下葉綠素含量最高，分別為1.03、0.66 mg/g，較CK2 分別顯著增加0.55、0.21 mg/g，說明一定濃度范圍的外源H2O2可提高苜蓿葉片葉綠素含量。對于3 個苜蓿品種來說，T2 和T3 處理對提高苜蓿葉綠素含量顯著優(yōu)于T1 處理。在外源H2O2濃度為0.1%時會顯著提高100 mmol/L NaCl 脅迫下LB 葉綠素含量且葉綠素含量達(dá)到最大，外源H2O2超過該濃度葉綠素含量下降，與其他濃度外源H2O2處理相比，T5 處理葉綠素含量最低，為0.53 mg/g，但較CK2 增加0.12 mg/g。在外源H2O2濃度為0.5%時會顯著提高100 mmol/L NaCl 脅迫下GN3 和AH 的葉綠素含量，對葉綠素含量提高程度達(dá)到最高值，超過該值葉綠素含量呈現(xiàn)下降趨勢，說明外源H2O2超過一定濃度后會降低苜蓿葉綠素含量。

綜上所述，各處理下3 個苜蓿品種葉片中葉綠素含量的變化趨勢，與未經(jīng)鹽脅迫（CK1）下相比，鹽脅迫（CK2）下，AH、GN3、LB 葉片中葉綠素含量均明顯下降，與CK1 相比，分別減少了0.27、0.54、0.19 mg/g，說明鹽脅迫會顯著降低苜蓿葉片葉綠素含量。隨著H2O2濃度的升高，3 個品種苜蓿葉片的葉綠素含量均呈現(xiàn)出先增后減的趨勢，但始終高于CK2 下的葉綠素含量，說明外源H2O2對提高鹽脅迫下苜蓿葉片葉綠素含量效果顯著。

2.2 過氧化氫對鹽脅迫下苜蓿葉片中CAT 活性的影響

由圖2 可知，與CK1 相比，CK2 處理下3 個品種苜蓿葉片中CAT 活性均降低，LB 降低39.0%，GN3 降低22.5%，AH 降低37.6%，說明100 mmol/L NaCl 脅迫下，能顯著降低苜蓿幼苗葉片CAT 活性。

3 個品種苜蓿在T1、T2、T3 處理下CAT 活性分別高于CK2，且LB 和AH 葉片中CAT 活性均在T3處理最高，分別為1.19、1.48 U/（g·min），較CK2 分別顯著增加68.7%和78.3%，GN3 的T2 處理下CAT 活性最高，為1.40 U/（g·min），較CK2 顯著增加27.3%，說明不同濃度外源H2O2對苜蓿CAT 活性影響顯著，一定濃度范圍的外源H2O2可提高苜蓿葉片CAT 活性。

對于3 個苜蓿品種來說，T2 和T3 處理對提高苜蓿CAT 活性顯著優(yōu)于T1 處理，且達(dá)到峰值，當(dāng)外源H2O2濃度超過0.5%時，LB 和AH 葉片中CAT活性均呈現(xiàn)下降趨勢，當(dāng)外源H2O2濃度超過0.1%時，GN3 葉片中CAT 活性呈現(xiàn)下降趨勢且下降幅度最大，說明不同濃度外源H2O2對苜蓿CAT 活性影響顯著性不同，H2O2超過一定濃度，在一定程度上會降低苜蓿CAT活性。T5 處理下LB、GN3、AH 的CAT活性均最低，分別為1.01、1.17、1.13 U/（g·min），較CK2分別增加50.7%、6.4%和36.1%。說明外源H2O2在鹽脅迫下會顯著提高苜蓿葉片中CAT 活性。

綜上所述，與未經(jīng)鹽脅迫（CK1）相比，鹽脅迫（CK2）下，AH、GN3、LB 這3 種苜蓿葉片中CAT 活性均明顯下降，顯著低于CK1，較CK1 分別下降39.1%、22.5%、37.6%；外源H2O2可顯著提高鹽脅迫下苜蓿葉片中CAT 活性，但隨著H2O2濃度的升高，3 個品種苜蓿葉片的CAT 活性均呈現(xiàn)出先增后減的趨勢，但始終高于CK2 下的CAT 活性，說明過高濃度的H2O2反而不利于苜蓿葉片CAT 活性的提升，但外源H2O2在一定程度上可緩解鹽脅迫對苜蓿葉片CAT 活性的影響。

2.3 過氧化氫對鹽脅迫下苜蓿葉片中MDA 含量的影響

由圖3 可知，與未經(jīng)鹽脅迫的CK1 相比，CK2處理下3 個苜蓿品種的葉片MDA 含量均顯著提高，說明在100 mmol/L NaCl 脅迫下，能顯著提高苜蓿幼苗葉片MDA 含量。

AH、GN3、LB 苜蓿葉片MDA 含量均在T1、T2處理下顯著下降，且T2 處理下降幅度最大，較CK2分別下降0.17、0.15、0.17 mmol/g，說明一定濃度外源H2O2可降低鹽脅迫下苜蓿葉片MDA 含量，從而較好地緩解鹽脅迫對苜蓿生長的危害。當(dāng)外源H2O2濃度超過0.1%時，3 個品種苜蓿MDA 含量均呈現(xiàn)上升趨勢，說明過高濃度的H2O2處理反而加重了苜蓿幼苗的鹽脅迫危害。與其他濃度的外源H2O2處理相比，T5 處理下的LB、GN3、AH 葉片MDA 含量均達(dá)到最高，分別為0.62、0.50、0.53 mmol/g，但均低于CK2 處理下苜蓿葉片的MDA 含量，分別較CK2降低了0.07、0.15、0.08 mmol/g，說明100 mmol/LNaCl脅迫下，外源H2O2可有效降低膜過氧化程度，緩解鹽脅迫對苜蓿幼苗生長的危害。

3 結(jié)論與討論

鹽脅迫對植物細(xì)胞內(nèi)葉綠素合成有抑制作用，植物光合作用主要依賴于葉綠素，其含量多少與植物光合作用的強弱直接相關(guān)。本研究表明，當(dāng)H2O2濃度在0.1%～0.5%時，隨著H2O2濃度升高，可明顯提高苜蓿葉片中葉綠素含量，維護光合過程的穩(wěn)定，增強植物的光合作用，這與趙萍萍[23]對小麥（Triticum aestivum）的研究結(jié)果相似。H2O2是細(xì)胞代謝過程中產(chǎn)生的一種廢物，在CAT 作用下H2O2可分解成氧和水。而鹽脅迫使得植物葉片內(nèi)CAT 活性降低，因此，會造成H2O2的積累，從而對植物機體造成傷害。本研究結(jié)果表明，當(dāng)H2O2濃度在0.1%～0.5%時，鹽脅迫下苜蓿葉片內(nèi)CAT 活性隨著H2O2濃度升高而增強，從而有效緩解苜蓿幼苗的鹽脅迫，這與李源[24]對板藍(lán)根（Isatis indigotica Fort）的研究結(jié)果大致相同。在100 mmol/L NaCL 脅迫下，植物細(xì)胞內(nèi)自由基產(chǎn)生和清理的穩(wěn)定受到威脅，自由基過量會使細(xì)胞膜過氧化，MDA 含量增加，所以，葉片MDA 含量是衡量植物細(xì)胞膜脂過氧化的重要指標(biāo)[25]，其含量的高低可以表征細(xì)胞受脅迫嚴(yán)重程度。外源H2O2濃度為0.1%時，可有效降低苜蓿葉片中MDA 含量，從而較好地緩解苜蓿幼苗的鹽脅迫危害，這與徐芬芬等[26]對水稻的研究結(jié)果相似。

綜上所述，100 mmol/L NaCl 脅迫下苜蓿幼苗葉片葉綠素含量和CAT 活性均下降，葉片MDA 含量上升，幼苗生長明顯受到抑制。添加一定濃度外源H2O2可顯著提高100 mmol/L NaCl 脅迫下苜蓿葉片葉綠素含量、CAT 活性，有效降低膜脂過氧化，從而一定程度上緩解了100 mmol/L NaCl 對苜蓿幼苗生長的傷害，維持苜蓿幼苗的生長，提高苜蓿幼苗對鹽脅迫的抗性，但高濃度的H2O2同樣會不利于鹽脅迫下幼苗的生長，且不同品種苜蓿對不同濃度外源H2O2響應(yīng)效果不同，以H2O2濃度不大于0.5%的效果最好。