不同品種綠豆對(duì)硒脅迫的響應(yīng)特性分析

崔長(zhǎng)珍，王 鵬，屈香香，劉 暢，相微微，王建武

（榆林學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，陜西榆林 719000）

我國(guó)72%的縣市屬于低硒或缺硒區(qū)，生活在缺硒地區(qū)的人口有7 億之多，缺硒地區(qū)的人們每天從食物中攝入硒的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于硒需要量的上限，而通過(guò)硒營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化的方式來(lái)補(bǔ)硒是一種方便有效的途徑。綠豆（Vigna radiata）屬豆科草本植物，是人類重要的雜糧作物之一[1]，其適應(yīng)性強(qiáng)，耐貧瘠，固氮養(yǎng)地，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，而且還具有很多種藥理作用[2]。綠豆不僅具有高蛋白、低脂肪的特性，而且具有較高的維生素和礦物質(zhì)含量[3]，雖說(shuō)不是主食，卻是人們經(jīng)常食用的食品，開(kāi)發(fā)富硒綠豆對(duì)于滿足人體的合理補(bǔ)硒具有更高的可行性。目前，市場(chǎng)上開(kāi)發(fā)的綠豆富硒產(chǎn)品，一部分是利用亞硒酸鈉或氨基酸硒水溶制劑對(duì)綠豆進(jìn)行浸泡或者噴淋處理后，使之萌發(fā)成芽苗菜，然后食用[4-7]；還有部分是利用葉面噴施法對(duì)綠豆進(jìn)行補(bǔ)硒，通過(guò)一系列的生理生化反應(yīng)，將無(wú)機(jī)硒吸入綠豆植株體內(nèi)，轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒富集在綠豆籽粒中，然后食用[8]。但針對(duì)不同品種綠豆對(duì)硒的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和富集方面差異研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以12 種綠豆為研究對(duì)象，探究了不同品種綠豆對(duì)硒脅迫響應(yīng)的生理差異，旨在為選育富硒綠豆品種提供一定理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試綠豆種子分別為維綠9 號(hào)、榆綠2 號(hào)、蘇拉2 號(hào)、中綠8 號(hào)、冀綠10 號(hào)、冀綠7 號(hào)、綠聯(lián)I17白綠-11 號(hào)、白綠6 號(hào)、保942-34、中綠3 號(hào)、橫山綠豆、天山大明綠豆2 號(hào)，共12 個(gè)，均由榆林市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院小雜糧研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 亞硒酸鈉營(yíng)養(yǎng)液的配置 用1/10 的營(yíng)養(yǎng)液和固體亞硒酸鈉，參考MEHDAWI 等[9]的試驗(yàn)方法，配制20、30 mg/L共2 種不同濃度的亞硒酸鈉營(yíng)養(yǎng)液。

1.2.2 綠豆幼苗培養(yǎng)及處理 挑選籽粒飽滿、形態(tài)一致、完好無(wú)損的綠豆種子，經(jīng)清洗消毒后，自然風(fēng)干；采用榆林當(dāng)?shù)氐狞S土與蛭石1∶1 的比例配制培養(yǎng)土，然后每個(gè)品種選取18 粒種子，一盆種6 粒種子，3 個(gè)重復(fù)，置于光照培養(yǎng)間培養(yǎng)（溫度為24 ℃，光照強(qiáng)度為8 000 lx，16 h 光照/8 h 黑暗）。隨后每天觀察長(zhǎng)勢(shì)，適時(shí)澆水；待長(zhǎng)到三葉一心時(shí)開(kāi)始用20 mg/L 的亞硒酸鈉溶液進(jìn)行澆灌[10]。處理28 d 后記錄形態(tài)變化，并將地上部分和地下部分洗凈烘干，送到北京萊析檢測(cè)技術(shù)有限公司，利用ICP-MS（ThermoFisher ICAP Q）測(cè)定硒含量。

挑選籽粒飽滿、形態(tài)一致、完好無(wú)損的綠豆種子，經(jīng)清洗消毒后，自然風(fēng)干；然后將種子置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待長(zhǎng)出約1 cm 的根時(shí)，將其移栽進(jìn)行水培，置于光照培養(yǎng)間培養(yǎng)（溫度為24 ℃，光照強(qiáng)度為8 000 lx，16 h 光照/8 h 黑暗）；待長(zhǎng)到三葉一心時(shí)，將營(yíng)養(yǎng)液換為亞硒酸鈉營(yíng)養(yǎng)液，用20、30 mg/L 的亞硒酸鈉營(yíng)養(yǎng)液處理[4]，對(duì)照組為不加硒的營(yíng)養(yǎng)液。處理5 d 后，測(cè)定其葉片的氧化應(yīng)激生理指標(biāo)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 形態(tài)指標(biāo)測(cè)定 在同一時(shí)間、同一濃度的亞硒酸鈉營(yíng)養(yǎng)液處理下，土培28 d 后觀察并記錄不同品種綠豆葉片顏色、莖的顏色、葉片干枯程度變化。

1.3.2 硒的富集轉(zhuǎn)運(yùn)能力測(cè)定 其參考喬斌[11]的方法進(jìn)行。

1.3.3 氧化應(yīng)激生理指標(biāo)測(cè)定 超氧化物歧化酶活性（SOD）的測(cè)定參考王學(xué)奎[12]的方法進(jìn)行；過(guò)氧化物酶（POD）的測(cè)定參考裴帥帥[13]的方法進(jìn)行；過(guò)氧化氫酶（CAT）的測(cè)定參考李柏林等[14]的方法進(jìn)行；丙二醛（MDA）含量測(cè)定參考王曉棟[15]的方法進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 及WPS 2016 軟件進(jìn)行方差分析與作圖；采用單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞硒酸鈉對(duì)綠豆形態(tài)指標(biāo)的影響

表1 不同綠豆品種處理前后形態(tài)指標(biāo)的變化

由表1 可知，不同品種綠豆對(duì)硒的耐受性不同，因而在形態(tài)變化上有明顯差異，相同處理?xiàng)l件下，榆綠2 號(hào)、保942-34 和橫山綠豆的葉片顏色仍為深綠色，與處理前相比基本不變，而其他品種的葉片顏色明顯變黃；綠豆莖的顏色前后并無(wú)明顯變化，只有品種間本來(lái)的莖色差異；冀綠7 號(hào)和綠聯(lián)I17 白綠-11 號(hào)干枯較為明顯，而維綠9 號(hào)、蘇拉2 號(hào)、中綠8 號(hào)、冀綠10 號(hào)、白綠6 號(hào)、保942-34和中綠3 號(hào)表現(xiàn)正常，沒(méi)有干枯，其他的則是整盆干枯，不同品種的干枯程度有所差異。

2.2 不同品種綠豆的富集轉(zhuǎn)運(yùn)能力變化

硒含量測(cè)定結(jié)果表明（表2），不同品種綠豆葉和根中硒含量差異明顯，葉含硒量最低的品種為天山大明綠豆2 號(hào)（84.46 mg/kg），最高的品種為保942-34（317.02 mg/kg）；根含硒量最低的品種為橫山綠豆（1 107.97 mg/kg），最高的品種為冀綠7 號(hào)（2 855.92 mg/kg）。

表2 不同品種綠豆葉和根中硒含量及轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)

不同品種綠豆對(duì)硒的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)由大到小排列為保942-34＞橫山綠豆＞維綠9 號(hào)＞榆綠2 號(hào)＞冀綠7 號(hào)＞中綠3 號(hào)＞白綠6 號(hào)＞蘇拉2 號(hào)＞綠聯(lián)I17 白綠-11 號(hào)＞冀綠10 號(hào)＞中綠8 號(hào)＞天山大明綠豆2 號(hào)（表2）。根據(jù)不同品種綠豆對(duì)硒的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)大小不同，結(jié)合硒脅迫下形態(tài)指標(biāo)變化，初步判斷富集硒能力最強(qiáng)的品種是保942-34，富集硒能力最弱的品種是天山大明綠豆2 號(hào)。篩選出這2 個(gè)品種后，進(jìn)一步比較硒脅迫下，2 個(gè)品種綠豆在氧化應(yīng)激生理方面的差異。

2.3 硒脅迫對(duì)2 個(gè)品種綠豆氧化應(yīng)激生理指標(biāo)的影響

在水培條件下，用20 和30 mg/L 的亞硒酸鈉營(yíng)養(yǎng)液處理保942-34 和天山大明綠豆2 號(hào)2 個(gè)品種綠豆，對(duì)照組為不加硒的營(yíng)養(yǎng)液，處理5 d 后，測(cè)定氧化應(yīng)激生理指標(biāo)。

2.3.1 硒脅迫對(duì)綠豆葉中超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響 超氧化物歧化酶（SOD）是一種清除含氧自由基的酶。從圖1 可以看出，在質(zhì)量濃度為20 mg/L 的亞硒酸鈉處理下，保942-34 的SOD 活性顯著高于天山大明綠豆2 號(hào)（P＜0.05）；而在質(zhì)量濃度為30 mg/L 的亞硒酸鈉處理下，天山大明綠豆2 號(hào)SOD 活性顯著高于保942-34（P＜0.05）。但總體而言，隨著亞硒酸鈉質(zhì)量濃度的增加，保942-34的SOD 活性先上升后下降，而天山大明綠豆2 號(hào)SOD 活性逐漸上升，保942-34 的SOD 活性在質(zhì)量濃度為20 mg/L 的亞硒酸鈉處理下最大，達(dá)到75.693 U/g。

2.3.2 硒脅迫對(duì)綠豆葉中過(guò)氧化物酶（POD）活性的影響 過(guò)氧化物酶（POD）可以催化H2O2氧化分解為H2O、O2，減少H2O2對(duì)細(xì)胞生物功能分子的破壞作用。由圖2 可知，在質(zhì)量濃度為20 mg/L 的亞硒酸鈉處理下，天山大明綠豆2 號(hào)POD 活性顯著高于保942-34（P＜0.05）；而在質(zhì)量濃度為30 mg/L的亞硒酸鈉處理下，保942-34 的POD 活性顯著高于天山大明綠豆2 號(hào)（P＜0.05）。但總體而言，隨著亞硒酸鈉質(zhì)量濃度的增加，保942-34 的POD 活性逐漸上升，而天山大明綠豆2 號(hào)POD 活性先上升后下降，天山大明綠豆2 號(hào)POD 活性在質(zhì)量濃度為20 mg/L 的亞硒酸鈉處理下最大，達(dá)到3.24 U/g。

2.3.3 硒脅迫對(duì)綠豆葉中過(guò)氧化氫酶（CAT）活性的影響 過(guò)氧化氫酶（CAT）屬于活性氧清除劑，可以分解機(jī)體代謝過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧如過(guò)氧化氫、超氧陰離子等。從圖3 可以看出，在質(zhì)量濃度為20、30 mg/L 的亞硒酸鈉處理下，保942-34 的CAT活性均顯著高于天山大明綠豆2 號(hào)（P＜0.05）。但總體而言，隨著亞硒酸鈉質(zhì)量濃度的增加，保942-34 和天山大明綠豆2 號(hào)的CAT 活性均先下降后上升，保942-34 的CAT 活性在未加亞硒酸鈉處理下最大，達(dá)到348 U/g。

2.3.4 硒脅迫對(duì)綠豆葉中丙二醛（MDA）含量的影響 丙二醛（MDA）是植物組織在衰老或逆境條件下，發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化作用的終產(chǎn)物之一，其含量大小可以反映植物遭受逆境傷害的程度。從圖4 可以看出，在20 mg/L 的亞硒酸鈉處理下，天山大明綠豆2 號(hào)的MDA 含量顯著高于保942-34（P＜0.05）；而在30 mg/L 的亞硒酸鈉處理下，保942-34 的MDA含量略高于天山大明綠豆2 號(hào)，但差異不顯著（P＞0.05）?？傮w而言，隨著亞硒酸鈉質(zhì)量濃度的增加，天山大明綠豆2 號(hào)的MDA 含量逐漸下降，而保942-34 含量逐漸上升，天山大明綠豆2 號(hào)的MDA含量在未處理時(shí)含量最高，達(dá)1.32 μmol/g。

3 結(jié)論與討論

葉片膜保護(hù)酶系統(tǒng)主要包括超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶，這3 種酶的活性大小是衡量植物對(duì)逆境抗性強(qiáng)弱的重要指標(biāo)之一[16]。CAT可以消除H2O2，從而減少H2O2的積聚，降低其對(duì)細(xì)胞的損壞作用。POD 與光合作用等有關(guān)，可以在一定情況下使H2O2還原成水，其活性會(huì)隨其他因素而產(chǎn)生相應(yīng)的變化。SOD 是一種金屬酶，有3 種類型[17]，其會(huì)影響植物的抗逆性和衰老，也可以消除有害的自由基，并且在氧化和抗氧化反應(yīng)中有著極為重要的功能[18]。本研究中，這3 種酶的活性在高質(zhì)量濃度亞硒酸鈉處理時(shí)變化趨勢(shì)不同，保942-34葉中SOD 的活性隨亞硒酸鈉質(zhì)量濃度的升高先上升而后降低，而POD 活性隨亞硒酸鈉質(zhì)量濃度的升高而升高，CAT 活性隨亞硒酸鈉質(zhì)量濃度的升高而先下降后上升；天山大明綠豆2 號(hào)葉片中SOD的活性隨亞硒酸鈉質(zhì)量濃度的升高而升高，而POD的活性隨亞硒酸鈉質(zhì)量濃度的升高而先上升后降低，CAT 活性隨亞硒酸鈉質(zhì)量濃度的升高而先下降后上升，CAT 活性二者表現(xiàn)一致。說(shuō)明隨著硒脅迫的加劇，綠豆體內(nèi)的H2O2含量持續(xù)升高，進(jìn)而誘導(dǎo)CAT 活性持續(xù)升高，POD 和SOD 在植物體內(nèi)參與的生理過(guò)程更多樣，不同綠豆品種POD 和SOD 對(duì)硒脅迫的響應(yīng)可能存在差異；此外，保942-34 轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)最高，轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)高會(huì)造成綠豆地上部分硒積累量升高，天山大明綠豆2 號(hào)轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)最低，地上部分硒積累量只有保942-34 的26.66%，這2 個(gè)品種綠豆地上部分硒含量差異可能也會(huì)造成POD 和SOD 活性變化不一致。在30 mg/L 亞硒酸鈉時(shí)，保942-34 的POD 和CAT 的活性均高于天山大明綠豆2 號(hào)，清除超氧陰離子自由基的能力也最強(qiáng)，對(duì)硒的耐受性較好。

丙二醛的含量是衡量植物對(duì)逆境抗性的一項(xiàng)重要生理指標(biāo)，在逆境環(huán)境中植物器官會(huì)發(fā)生膜質(zhì)過(guò)氧化作用，丙二醛便是其終產(chǎn)物之一[19]。保942-34 葉中MDA 的含量隨亞硒酸鈉質(zhì)量濃度的升高而升高，天山大明綠豆2 號(hào)MDA 含量隨亞硒酸鈉質(zhì)量濃度的升高而下降。保942-34 的丙二醛在亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為30 mg/L 時(shí)達(dá)到最大值，而天山大明綠豆2 號(hào)的丙二醛在亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為20 mg/L 時(shí)達(dá)到最大值，2 種綠豆相比，天山大明綠豆2 號(hào)在20 mg/L 亞硒酸鈉質(zhì)量濃度時(shí)的丙二醛含量最高，說(shuō)明此時(shí)膜脂過(guò)氧化作用最為嚴(yán)重，對(duì)硒的耐受性也就較差。雖然沒(méi)有證據(jù)表明Se 是植物必需的微量元素，但低劑量的Se 能促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，顯著增強(qiáng)酶促和非酶促抗氧化系統(tǒng)的活性，并提高植物對(duì)非生物脅迫的抗性。早在1930 年，人們就發(fā)現(xiàn)了Se 超富集植物，主要是豆科的黃芪屬植物以及假含羞草屬植物、十字花科的雞冠花屬植物，但由于這些植物跟模式植物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，對(duì)其富硒的遺傳和分子機(jī)制研究一直沒(méi)有深入進(jìn)行[20]。

本研究通過(guò)對(duì)12 個(gè)綠豆品種對(duì)硒的富集轉(zhuǎn)運(yùn)能力的測(cè)定以及無(wú)機(jī)硒對(duì)其中2 種綠豆品種生理指標(biāo)的測(cè)定，結(jié)果表明，不同綠豆品種對(duì)硒的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)存在明顯差異，供試綠豆品種中保942-34硒的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)最高，且對(duì)硒耐受性最好，本研究可為進(jìn)一步深入研究綠豆對(duì)硒的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制提供參考。已有研究證實(shí)，環(huán)境低硒是引起多種流行病的重要因素[21]，很多作物在硒生態(tài)鏈中可以將無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒，而人和動(dòng)物對(duì)有機(jī)硒的吸收和利用遠(yuǎn)大于無(wú)機(jī)硒。本研究證實(shí)，不同品種綠豆對(duì)硒的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)能力存在明顯差異，研究結(jié)果可為篩選富集硒能力強(qiáng)的綠豆品種提供參考，對(duì)缺硒地區(qū)有效防止硒缺乏癥[22]和富硒作物的推廣和利用具有重要意義，也可為通過(guò)施硒肥種植富硒綠豆提供參考[23]。