不同濃度石墨烯對藜麥幼苗形態(tài)和生理特性的影響

郭緒虎，趙建國，劉建霞，楊 媛，張丁丁

（1.山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西大同 037009；2.山西大同大學(xué)設(shè)施農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研發(fā)中心，山西大同 037009；3.山西大同大學(xué)炭材料研究所，山西大同 037009）

藜麥（Chenopodium quinoa Willd.）屬于藜科1 年生雙子葉植物，其適應(yīng)范圍廣，抗逆性強(qiáng)，耐寒、耐鹽、耐旱，并可在高海拔等不利生長環(huán)境下種植，具有極高的經(jīng)濟(jì)價值[1-3]。藜麥形狀小、圓、平，其顏色有灰色、白色、黑色、黃色和紅色，富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、多糖和不飽和脂肪酸等大量營養(yǎng)素和維生素、礦物質(zhì)等微量營養(yǎng)素，是一種營養(yǎng)全面、比例均衡的食物[4]。此外，藜麥具有多種保健功能，如抗癌、抗氧化、防治高血脂、高血壓、高血糖、減肥、助消化等[5]。

石墨烯是一種由碳原子組成的二維炭納米材料，具有優(yōu)異的光學(xué)、電學(xué)、力學(xué)特性，被廣泛應(yīng)用于材料學(xué)、微納加工、能源、環(huán)境、生物醫(yī)學(xué)和藥物傳遞等領(lǐng)域[6-9]。近年來，隨著石墨烯制備技術(shù)的發(fā)展和生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大，它被應(yīng)用于農(nóng)林業(yè)領(lǐng)域，研究石墨烯對植物生長的影響以及植物的響應(yīng)成為新的研究熱點。喬俊等[10]研究發(fā)現(xiàn)，不同質(zhì)量濃度的氧化石墨烯（200、600 mg/L）對紅豆種子的發(fā)芽具有顯著促進(jìn)作用。氧化石墨烯處理提高了紫花苜蓿種子萌發(fā)指數(shù)，但是抑制了幼苗生長，降低了株高[11]。ZHANG 等[12]研究表明，較低濃度的石墨烯能夠促進(jìn)水稻種子萌發(fā)和根莖生長，但生物量較低。也有研究表明，0.1～1.0 mg/L 氧化石墨烯可促進(jìn)組織培養(yǎng)的蘋果植株的生根率和不定根數(shù)量的增加[13]。胡曉飛等[14]研究表明，隨著石墨烯濃度的增加，樹莓的苗高、根長、根尖數(shù)、根系比表面積均表現(xiàn)為先增加后減小的趨勢，對于樹莓的生長，2 mg/L 石墨烯為最佳質(zhì)量濃度。另外，有研究表明，高濃度（＞25 mg/L）的氧化石墨烯處理顯著抑制了甘藍(lán)型油菜的根長，但增加了莖長和地上部分鮮質(zhì)量，而超過50 mg/L 的氧化石墨烯處理則顯著抑制根的鮮質(zhì)量[15-16]。

綜上所述，石墨烯對植物種子萌發(fā)、幼苗根莖生長以及生物量都產(chǎn)生重要影響（包括積極影響和消極影響），這種影響機(jī)制是復(fù)雜的，依賴于石墨烯的劑量、濃度、暴露時間以及物種差異等。本研究基于不同質(zhì)量濃度石墨烯（0、4、8、12 mg/L）處理，探索石墨烯對藜麥形態(tài)（莖長、根尖形態(tài)、根尖細(xì)胞形態(tài)）以及生理指標(biāo)（地上部分鮮質(zhì)量、葉綠素相對含量、相對電導(dǎo)率）的影響，以期篩選出對藜麥生長發(fā)育具有明顯促進(jìn)作用的石墨烯濃度，以期為將納米炭材料石墨烯應(yīng)用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，改進(jìn)栽培和種植技術(shù)提供新的思路和理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究采用的藜麥種子和石墨烯材料分別由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所和山西大同大學(xué)炭材料研究所提供。在石墨烯制備過程中，引入親水基團(tuán)COOH 和C-OH，使其在水相中具備更好的分散性。原始石墨烯溶液的pH 較小，呈偏酸性[17]。

1.2 試驗設(shè)計

分別配制含有0（CK）、4、8、12 mg/L 石墨烯的MS培養(yǎng)基，將已消毒的藜麥種子分別播種在含有不同質(zhì)量濃度石墨烯的MS 培養(yǎng)基上，每個組培瓶播種6～7 粒種子，每個濃度重復(fù)3 瓶，放置人工智能氣候箱（溫度24 ℃、濕度60%、光照強(qiáng)度250 μmol/（m2·s））培養(yǎng)14 d。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 莖長及鮮質(zhì)量測定 采集生長14 d 的幼苗，用直尺（20 cm）測量莖長，再用剪刀將藜麥幼苗的地上部分從MS 培養(yǎng)基中輕輕剪下，采用分析天平（萬分之一）稱量其鮮質(zhì)量。

1.3.2 葉綠素相對含量測定 采用便捷式葉綠素測定儀（SPAD-502 Pluse）測定生長14 d 幼苗葉片（以SPAD 為計量單位）。由于測定部位對SPAD 值讀數(shù)影響較大，測定時保持基本相同位置（較大的藜麥葉片）并避開葉脈[18]。

1.3.3 相對電導(dǎo)率測定 采用微機(jī)型DDS-22C 電導(dǎo)率儀（杭州陸恒生物科技有限公司）測定藜麥葉片相對電導(dǎo)率，葉片取自生長14 d 的幼苗。利用直徑為0.5 cm 的打孔器收集相同數(shù)目的藜麥葉片，加入25 mL 蒸餾水，在20～25 ℃下放置3 h，測其電導(dǎo)率（C1）；然后煮沸30 min，冷卻至室溫，再測其電導(dǎo)率（C2）。每組重復(fù)3 次試驗，取平均值。

1.3.4 根尖整體形態(tài)觀察 用鑷子從MS 培養(yǎng)基中取出藜麥幼苗，用蒸餾水將藜麥幼苗根尖部分輕輕沖洗干凈，然后用刀片切取1 cm 長的根尖放在載玻片上，蓋上蓋玻片，使用倒置熒光顯微鏡（德國LEICA DMi8）進(jìn)行觀察并收集圖像。

1.3.5 根尖細(xì)胞微觀形態(tài)觀察 采集對照組和經(jīng)石墨烯（8、12 mg/L）處理后的藜麥幼苗根尖。將根尖樣品在2.5%戊二醛中固定2 h，然后在臨界點干燥器中脫水。解剖后，將樣品噴金30 s。參考文獻(xiàn)[20]的方法，采用掃描電子顯微鏡（日本，HITACHI SU8100）觀察和收集圖像信息。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 22.0 和Origin 8.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度石墨烯對藜麥幼苗莖長和地上部分鮮質(zhì)量的影響

由圖1 可知，在石墨烯質(zhì)量濃度為8、12 mg/L 的MS 培養(yǎng)基上生長的藜麥幼苗莖長都顯著高于對照。在石墨烯質(zhì)量濃度為4、8 mg/L 的MS 培養(yǎng)基上生長的藜麥地上部分鮮質(zhì)量與對照間差異不顯著，但石墨烯質(zhì)量濃度為12 mg/L 時，藜麥地上部分鮮質(zhì)量明顯低于對照。

2.2 不同質(zhì)量濃度石墨烯對藜麥葉綠素相對含量的影響

葉綠素含量是表征植物生長狀況的重要指標(biāo)，對植物光合效率、營養(yǎng)狀況等具有重要的指示作用[21]。由圖2 可知，在石墨烯質(zhì)量濃度為4、8、12 mg/L的MS 培養(yǎng)基上生長的藜麥葉片的葉綠素相對含量均顯著高于對照，其中，石墨烯質(zhì)量濃度為4 mg/L時，效果最明顯，葉綠素相對含量約為對照的1.6 倍。

2.3 不同質(zhì)量濃度石墨烯對藜麥相對電導(dǎo)率的影響

相對電導(dǎo)率可以反映植物體內(nèi)生物膜透性變化的情況，是反映植物細(xì)胞膜受脅迫的重要指標(biāo)之一[22-23]。由圖3 可知，在石墨烯質(zhì)量濃度為4、8 mg/L時，藜麥葉片相對電導(dǎo)率無明顯變化，而石墨烯質(zhì)量濃度為12 mg/L 時，其相對電導(dǎo)率顯著高于對照，說明細(xì)胞質(zhì)膜受到損傷，細(xì)胞進(jìn)行正常生理代謝活動的內(nèi)環(huán)境受到威脅。

2.4 不同質(zhì)量濃度石墨烯對藜麥根系形態(tài)的影響

根系作為影響植物生長的重要器官，其主要功能是吸收水分、營養(yǎng)物質(zhì)以及其他的溶質(zhì)溶液，它的分布特征和發(fā)育情況與作物地上部分的生長狀況和作物的生產(chǎn)能力及水平有相當(dāng)密切的關(guān)系。本研究配制含有不同質(zhì)量濃度石墨烯（0、2、4、8、12 mg/L）的MS 培養(yǎng)基，研究石墨烯對藜麥幼苗根系形態(tài)的影響。由圖4 可知，在石墨烯質(zhì)量濃度為4、8 mg/L的MS 培養(yǎng)基上生長的藜麥幼苗根系發(fā)達(dá)，說明4、8 mg/L 的石墨烯能夠促進(jìn)藜麥根系生長和形態(tài)發(fā)育，進(jìn)一步驗證了前期研究的結(jié)果[17]。

2.5 不同質(zhì)量濃度石墨烯對藜麥幼苗根尖形態(tài)的影響

根系中生命活動最活躍的根尖和根毛是吸收水分和無機(jī)鹽的主要部分。為進(jìn)一步說明石墨烯對藜麥幼苗根系生長具有促進(jìn)作用，本研究通過光學(xué)顯微鏡對經(jīng)過不同質(zhì)量濃度石墨烯處理的藜麥幼苗根尖進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)在石墨烯的參與下，藜麥幼苗均出現(xiàn)不同程度根尖膨大、根毛增加的現(xiàn)象，其中，石墨烯質(zhì)量濃度為8 mg/L 時最為明顯（圖5）。

2.6 不同質(zhì)量濃度石墨烯對藜麥根尖細(xì)胞微觀形態(tài)的影響

通過掃描電子顯微鏡觀察藜麥幼苗的根尖細(xì)胞形態(tài)，添加石墨烯的藜麥根尖細(xì)胞形態(tài)發(fā)生不規(guī)則變化，細(xì)胞膨大，并且隨著石墨烯質(zhì)量濃度的增加其變化更加明顯（圖6）。

3 結(jié)論與討論

納米碳材料石墨烯應(yīng)用研究的快速發(fā)展，使其在越來越多的領(lǐng)域中展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用價值和良好的特性。本研究探索了不同質(zhì)量濃度石墨烯對藜麥幼苗形態(tài)特征（莖長、地上部分鮮質(zhì)量、根尖形態(tài)、根尖細(xì)胞形態(tài)）和生理指標(biāo)（葉綠素相對含量、相對電導(dǎo)率）的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在特定濃度下石墨烯對藜麥幼苗莖、根形態(tài)和生理特性產(chǎn)生重要的積極影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，在石墨烯質(zhì)量濃度為8 mg/L 的MS培養(yǎng)基上生長的藜麥幼苗其莖長、葉綠素相對含量、根毛明顯增加，根尖膨大，說明特定濃度的石墨烯能夠促進(jìn)藜麥幼苗根莖的生長。ZHANG 等[12]研究表明，較低濃度的石墨烯處理過的水稻種子萌發(fā)更快，表現(xiàn)出明顯的長莖和長根現(xiàn)象。胡曉飛等[14]通過掃描電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)，添加了石墨烯的樹莓組培苗的不定根根毛更加發(fā)達(dá)。另外，20 mg/L 氧化石墨烯通過ABA 和IAA 途徑促進(jìn)了野生番茄根系生長[24]。上述發(fā)現(xiàn)與本研究結(jié)果具有一定的相似性。其原因可能是由于石墨烯誘導(dǎo)了作物體內(nèi)水通道蛋白基因的表達(dá)，從而促進(jìn)根系對水分和營養(yǎng)元素的吸收，納米炭材料可以吸附營養(yǎng)離子（如NH4+和NO3-），起到緩釋作用[25-26]。氧化石墨烯作為石墨烯重要的衍生物，其表面因含氧基團(tuán)的修飾而較石墨烯具有更強(qiáng)的親水性[27]。因此，可以推測石墨烯的存在提高了基質(zhì)中水和營養(yǎng)物質(zhì)的存儲能力，從而促進(jìn)了植物生長。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，石墨烯質(zhì)量濃度為12mg/L時，藜麥幼苗地上部分鮮質(zhì)量顯著下降，相對電導(dǎo)率顯著升高，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生不規(guī)則變化，說明細(xì)胞質(zhì)膜受到損傷。相關(guān)研究也表明，50 mg/L氧化石墨烯會對甘藍(lán)型油菜根系生長產(chǎn)生抑制作用[15-16]；氧化石墨烯富集在小麥根部，引起根的顯微結(jié)構(gòu)、超微結(jié)構(gòu)變化，誘發(fā)了根部的氧化應(yīng)激[28]。經(jīng)石墨烯處理的卷心菜根系表面積顯著增加，可能是石墨烯過量導(dǎo)致的膨脹。在較高的石墨烯質(zhì)量濃度（1 000 mg/L）下，與對照相比，白菜和紅色菠菜的根毛生長降低[29]，其原因可能與氧化石墨烯濃度有關(guān)。

綜上所述，石墨烯對藜麥幼苗根系生長、部分形態(tài)特征及生理指標(biāo)具有重要的影響，其作用關(guān)系取決于石墨烯劑量或濃度以及物種差異，應(yīng)用特定濃度石墨烯能夠有效地促進(jìn)藜麥根莖生長，增強(qiáng)光合效率。在本試驗中，促進(jìn)藜麥幼苗生長的最適石墨烯質(zhì)量濃度為8 mg/L。本研究為進(jìn)一步探索石墨烯對作物生長的影響提供了重要信息，對藜麥的引種種植具有重要指導(dǎo)意義。