針刺改善原發(fā)性失眠代謝組學(xué)研究

崔瑩雪，敖與天，孫敬青

1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院 北京 100010

2 北京中醫(yī)藥大學(xué) 北京 100029

原發(fā)性失眠是臨床上最常見的睡眠障礙之一。長(zhǎng)期失眠可增加罹患其他疾病的風(fēng)險(xiǎn)，影響人們的生活質(zhì)量和身心健康，造成個(gè)人、社會(huì)的嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。

針刺療法是治療失眠的非藥物療法之一[3]。代謝組學(xué)通過定量定性分析生物體內(nèi)所有的小分子代謝產(chǎn)物，對(duì)生物體多種生理病理刺激表達(dá)產(chǎn)生的內(nèi)源物質(zhì)變化進(jìn)行描述。

本研究以原發(fā)性失眠患者為研究對(duì)象，觀察受試者失眠嚴(yán)重指數(shù)（ISI）及匹茲堡睡眠質(zhì)量指數(shù)（PSQI）在針刺治療前后的變化情況，并通過非靶向代謝組學(xué)技術(shù)，檢測(cè)針刺治療前后受試者的尿液代謝產(chǎn)物的變化。評(píng)價(jià)針刺治療原發(fā)性失眠的療效并探究針刺的潛在作用機(jī)制。

資料與方法

1 病例資料

本研究入組首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院原發(fā)性失眠患者40例（脫落2例）。經(jīng)隨機(jī)信封隨機(jī)分組為針刺組和假針刺組，其中針刺組入組20例，脫落0例，假針刺組入組20例，脫落2例。同時(shí)社會(huì)招募健康受試者20例（無脫落），3組受試者性別構(gòu)成比、年齡構(gòu)成比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（見表1）。

表1 三組受試者一般資料比較

2 納入標(biāo)準(zhǔn)

2.1 滿足下列有關(guān)原發(fā)性失眠的所有診斷標(biāo)準(zhǔn)；參照2016版《中國(guó)失眠障礙診斷和治療指南》及《國(guó)際睡眠障礙分類第3版）》。需同時(shí)滿足以下5項(xiàng)：①主訴為以下一種或多種癥狀：入睡困難；睡眠維持困難；早醒；無法在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間上床睡覺；無法獨(dú)自睡眠（無父母或陪護(hù)者）。②因夜間睡眠困難而出現(xiàn)以下一種或者多種癥狀：疲勞；注意力損害；社交或職業(yè)能力下降；緒易激動(dòng)或易煩躁；日間嗜睡；出現(xiàn)如多動(dòng)、沖動(dòng)或攻擊性等行為問題；驅(qū)動(dòng)力、精力或動(dòng)力缺乏；易犯錯(cuò)或易出事故；對(duì)睡眠感到焦慮。③上述癥狀出現(xiàn)頻次至少每周三次。④上述癥狀無法完全被不合適的睡眠環(huán)境或者不合適的睡眠計(jì)劃所解釋。⑤上述癥狀無法被其他的睡眠障礙更好地解釋。

2.2 年齡18至65周歲；

2.3 自愿參加本項(xiàng)臨床試驗(yàn)。

3 排除標(biāo)準(zhǔn)

①診斷頑固性失眠（使用2種以上作用機(jī)制的藥物治療失眠無效）；②合并嚴(yán)重精神疾病或有自殺傾向；③入組前30天內(nèi)存在急性應(yīng)激生活事件；④孕期、哺乳期婦女；⑤合并如心腦血管疾病、肝腎功能異常等嚴(yán)重全身性疾病或其他導(dǎo)致失眠的繼發(fā)性因素

4 健康受試者

按性別、年齡比例通過招募納入健康受試者。

4.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 體檢后無精神類疾病以及嚴(yán)重全身性疾?。徊环仙鲜鲇嘘P(guān)原發(fā)性失眠的任意一條診斷標(biāo)準(zhǔn)；

4.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 孕期、哺乳期婦女；精神類藥物服用史。

5 脫落標(biāo)準(zhǔn)

①未能按規(guī)定進(jìn)行治療；②依從性差，在研究過程中自行退出者。

6 剔除標(biāo)準(zhǔn)

①研究過程中合并使用針對(duì)原發(fā)性失眠的其他療法者；②研究過程中自行更換治療方案者。

7 臨床干預(yù)方案

7.1 針刺組

7.1.1 取穴 百會(huì)穴、神庭穴、本神穴、四神聰穴及神門穴（雙）、內(nèi)關(guān)穴（雙）、三陰交穴（雙）。

7.1.2 操作方法 患者取平臥位。選取華佗牌30號(hào)針灸針直刺，手法取平補(bǔ)平瀉，以患者局部酸脹感受為度，留針30分鐘。

7.1.3 療程 每周3次，2周為1個(gè)療程。

7.2 假針刺組

7.2.1 取穴 參考《國(guó)內(nèi)外針灸研究中非經(jīng)非穴選取方法評(píng)述》，采用非經(jīng)非穴對(duì)照，選擇針刺組穴位旁開非循經(jīng)線2 cm處針刺。

7.2.2 操作方法 患者平臥位，華佗牌30號(hào)1寸針灸針淺刺，均刺入皮膚1-2mm，不采用任何手法。留針30分鐘。

7.2.3 療程 每周3次，2周為1個(gè)療程。

7.3 健康組 健康組不采取任何干預(yù)手段。

8 觀察指標(biāo)

記錄針刺組與假針刺組受試者于治療第0天、第14天的ISI、PSQI評(píng)分以及研究過程中存在的不良反應(yīng)等；并對(duì)各組受試者留取的尿液樣本中代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析鑒定并對(duì)比。健康受試者留取尿液標(biāo)本1次。尿液標(biāo)本均留取晨起空腹中段尿，-80 ℃ 冰箱儲(chǔ)存。采用LC-MS非靶向代謝組學(xué)法檢測(cè)各組受試者尿液中代謝產(chǎn)物情況。

9 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 21.0軟件統(tǒng)計(jì)分析臨床數(shù)據(jù)，使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示正態(tài)分布計(jì)量資料，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組比較；非正態(tài)分布計(jì)量資料使用中位數(shù)±四分位距表示，采用非參數(shù)檢驗(yàn)比較兩組數(shù)據(jù)；以P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

代謝組學(xué)檢測(cè)數(shù)據(jù)采用Progenesis QI軟件（Waters Corporation，Milford，USA）進(jìn)行預(yù)處理。采用Progenesis QI軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行搜庫鑒定，主要數(shù)據(jù)庫為http：//www.hmdb.ca/；https：//metlin.scripps.edu/等公共數(shù)據(jù)庫及自建數(shù)據(jù)庫。采用T檢驗(yàn)結(jié)合多元分析法OPLS-DA篩選出組間差異代謝物。

結(jié) 果

1 ISI評(píng)分比較

基線期兩組患者ISI評(píng)分無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。治療后針刺組ISI評(píng)分低于假針刺組，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；且針刺組治療后ISI評(píng)分低于治療前，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。假針刺組治療前后ISI評(píng)分無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（見表2）。

表2 各組ISI評(píng)分比較

2 PSQI評(píng)分比較

基線期兩組PSQI各項(xiàng)評(píng)分及總分對(duì)比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。經(jīng)針刺治療2周后，針刺組患者在PSQI總分，及日間功能障礙評(píng)分、睡眠質(zhì)量、睡眠時(shí)間分項(xiàng)評(píng)分均低于假針刺組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

治療后針刺組患者的PSQI總分及入睡時(shí)間、睡眠時(shí)間、睡眠效率、睡眠質(zhì)量、睡眠障礙、日間功能障礙等分項(xiàng)評(píng)分及均低于基線期，其治療前后評(píng)分差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。假針刺組患者治療前后PSQI各項(xiàng)評(píng)分治療前后對(duì)比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（見表3）。

表3 兩組患者PSQI各項(xiàng)評(píng)分比較

3 差異代謝物分析

3.1 差異代謝物篩選 采用代謝集Venn分析，篩選出同時(shí)滿足失眠患者（針刺組+假針刺組）與健康組存在差異的代謝物共27種，考慮這27種代謝物可能與原發(fā)性失眠相關(guān)（見圖1）。在上述27種代謝物中，繼續(xù)篩選針刺治療前后差異性代謝產(chǎn)物一種：依來曲普坦N-氧化物（Eletriptan N-oxide），分子式：C22H26N2O3S，考慮這種代謝物與針刺治療可能相關(guān)。

圖1 代謝物Venn 圖

3.2 通路分析 利用KEGG（京都基因與基因組百科全書）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能通路分析（見圖2）。進(jìn)一步采用美吉生物云平臺(tái)自主研發(fā)的流程進(jìn)行KEGG Pathway富集分析。得到5個(gè)可能與失眠相關(guān)的代謝通路，包括：咖啡因代謝、甘油磷脂代謝、泛酸和輔酶A的生物合成、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、嘌呤代謝（見圖3）。

圖2 KEGG功能通路

圖3 KEGG拓?fù)鋵W(xué)分析

討 論

《素問·寶命全形論》：“凡刺之真，必先治神。”《靈樞·本神》：“凡刺之本，先必本于神。”可見，針灸的調(diào)神作用是治療疾病的基礎(chǔ)。本研究選穴為我院國(guó)家級(jí)名老中醫(yī)周德安教授經(jīng)驗(yàn)方“四神方”，這一針刺方中所包含的神庭、神門、本神、四神聰?shù)妊ㄎ?，是針灸調(diào)神的經(jīng)驗(yàn)穴。頭為諸陽之會(huì)，百會(huì)穴位于頭頂，是百脈朝會(huì)的部位，所以百會(huì)穴能夠起到升陽益氣、鎮(zhèn)靜安神的作用。百會(huì)、神庭均屬于位于督脈上，督脈“入屬于腦”，腦為元神之府，二穴相配伍，常用于治療失眠、躁狂等神志病。周德安教授認(rèn)為失眠當(dāng)從心、肝、脾、腎論治，故選穴加用三陰交穴以健脾、疏肝、益腎，選取心經(jīng)原穴神門及心包經(jīng)絡(luò)穴內(nèi)關(guān)穴相配以清心安神[4-5]。

本研究通過觀察ISI、PSQI量表評(píng)分發(fā)現(xiàn)，針刺調(diào)神方對(duì)于原發(fā)性失眠患者睡眠質(zhì)量、睡眠時(shí)間與日間功能具有改善作用。該研究結(jié)論與既往文獻(xiàn)報(bào)道相似，如研究發(fā)現(xiàn)，針刺三陰交、四神聰穴可改善失眠患者的睡眠質(zhì)量，延長(zhǎng)睡眠時(shí)間、提高睡眠效率[6-7]。

本研究篩選出27種與原發(fā)性失眠相關(guān)的潛在代謝物，主要涉及的代謝通路為咖啡因代謝、甘油磷脂代謝、泛酸和輔酶A的生物合成、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、嘌呤代謝等。同時(shí)篩選出1種可能與針刺治療相關(guān)的代謝物： Eletriptan N-oxide，該物質(zhì)是依來曲普坦的代謝產(chǎn)物，是有效的5-HT受體激動(dòng)劑（包括神經(jīng)元5-HT1D和血管選擇性5-HT1B受體），并可透過血腦屏障[8]。5-HT（5-羥色胺）是一種中樞神經(jīng)遞質(zhì)，主要調(diào)節(jié)睡眠、情緒、記憶等，是多種抗抑郁藥、抗偏頭痛藥物的作用靶點(diǎn)[9]。多項(xiàng)研究表明，針刺對(duì)人體5-HT水平具有調(diào)控作用，包括可能通過調(diào)節(jié)血清5-HT水平從而起到治療抑郁癥[10，11]、偏頭痛[12]、睡眠障礙[13-17]等疾病的作用。另有研究認(rèn)為，針刺可通過調(diào)控大鼠的5-HT受體的表達(dá)、調(diào)控5-HT受體間的平衡從而發(fā)揮改善情緒、促進(jìn)睡眠等作用[18-20]。結(jié)合本研究結(jié)果，推測(cè)針刺療法改善原發(fā)性失眠的作用可能與調(diào)控5-HT代謝相關(guān)。

因本研究為代謝組學(xué)前期探索性研究，故各組納入樣本量及觀察周期相對(duì)不足，后續(xù)研究可進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，延長(zhǎng)治療周期，對(duì)研究加以完善。