甘露糖受體與慢性乙肝患者肝纖維化的關(guān)系研究

李阿利 虞邦映 邵輝 陳華忠 章霞 溫壽向 朱堅(jiān)勝

我國(guó)是全球乙肝感染率最高的國(guó)家之一。據(jù)報(bào)道，2016年我國(guó)慢性乙肝（chronic hepatitis B,CHB）患者約達(dá)3 000萬(wàn)例[1]。肝纖維化是各種病因引起的慢性肝臟損傷后的瘢痕修復(fù)反應(yīng)，是疾病進(jìn)展為肝硬化的必經(jīng)階段[2]，而肝星狀細(xì)胞激活是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的核心步驟[3]。甘露糖受體（mannose receptor,MR）是一種模式識(shí)別受體，在識(shí)別病原體、誘導(dǎo)細(xì)胞因子生成和保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用，具有清除膠原蛋白的功能，與肝纖維化的形成密切相關(guān)[4]。近年來(lái)，MR成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，關(guān)于MR與肝臟疾病的相關(guān)研究越來(lái)越多，但其與CHB患者肝纖維化關(guān)系研究較少。本研究采用免疫組化法和RT-PCR法檢測(cè)MR在CHB肝纖維化不同分期患者肝組織中的表達(dá)，以探討其在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2016年11月至2018年10月在浙江省臺(tái)州醫(yī)院感染科住院且行肝臟穿刺活檢的CHB患者 50例，其中男 28例，女22例；年齡 32～59（42.61±7.25）歲；肝纖維化分期：S0期 15 例，S1～2期 20 例，S3～4期15例。CHB肝纖維化不同分期組患者性別、年齡比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P ＞0.05）；ALT、AST、PLT 比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表1。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡 30～60歲；（2）符合 2015年 CHB 防治指南中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；（3）經(jīng)B超定位引導(dǎo)下肝臟穿刺活檢術(shù)后肝組織病理學(xué)診斷明確為CHB。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并 HAV、HCV、HDV、HEV、HIV 感染；（2） 患有脂肪肝、酒精性肝病、自身免疫性肝病、肝硬化、肝惡性腫瘤、遺傳代謝性肝病等疾??；（3）既往或近期接受過(guò)抗病毒治療；（4）妊娠或哺乳期婦女；（5）患有甲狀腺功能亢進(jìn)癥、糖尿病等代謝疾?。唬?）患有嚴(yán)重的心、肺、腦、腎等重要臟器疾病。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)，所有患者簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 肝纖維化分級(jí)評(píng)估 在超聲定位下，采用16 G穿刺針進(jìn)行肝臟穿刺活檢術(shù)。取組織標(biāo)本長(zhǎng)度＞1 cm，常規(guī)行HE染色，由2位高年資病理科醫(yī)生獨(dú)立閱片進(jìn)行診斷。參照2015年CHB防治指南[5]和1995年國(guó)際認(rèn)可的Scheuer評(píng)分系統(tǒng)[6]對(duì)肝組織進(jìn)行纖維化分期，分為S0～4期。其中S0期為無(wú)纖維化，S1～2期為輕度纖維化，S3～4期為中重度纖維化。

1.2.2 肝組織MR蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法。將肝組織置于60℃恒溫烤箱中預(yù)熱2 h，切片，鋪平，常規(guī)脫蠟至水，梯度乙醇脫水；置于PBS中，沖洗3次，5 min/次；0.3% H2O2、37 ℃恒溫箱中孵育 15 min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS沖洗3次，5 min/次；0.01 M枸櫞酸鈉進(jìn)行抗原熱修復(fù)，高壓15 min，自然冷卻至室溫，PBS沖洗3次，5 min/次；滴加兔抗人 MR抗體（1∶800一抗稀釋液稀釋?zhuān)?℃冰箱內(nèi)孵育過(guò)夜，PBS沖洗3次，5 min/次；滴加兔鼠通用型二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，5 min/次；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)脂封片，在光鏡下觀察并拍照。判讀標(biāo)準(zhǔn)：在光鏡下觀察，細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜上棕黃色顆粒提示MR陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野，每個(gè)視野下計(jì)算100個(gè)細(xì)胞中MR陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比并取平均值。染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)染色為0分，淺黃色染色為1分，棕黃色染色為2分，棕褐色染色為3分；陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：0%為0分，1%～為1分，26%～為2分，51%～為3分，76%～100%為4分；免疫組化評(píng)分為染色強(qiáng)度評(píng)分與陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分的乘積。根據(jù)免疫組化評(píng)分評(píng)估MR蛋白表達(dá)強(qiáng)度：＜2分為（-），2～3分為（+），4～6 分為（++），＞6分為（+++）。

1.2.3 肝組織 MR、NF-κB、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor,TGF-β1）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（αsmooth muscle actin,α-SMA）mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR法。采用Trizol法提取肝組織總RNA，按照兩步法RT-PCR試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行cDNA逆轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，觀察擴(kuò)增條帶。引物序列見(jiàn)表2。采用2-ΔΔCt法計(jì)算肝組織 MR、NF-κB、TGF-β1、α-SMA mRNA 相對(duì)表達(dá)量，所有樣本均重復(fù)3個(gè)孔，取平均值。

表2 MR、α-SMA、NF-κB、TGF-β1及內(nèi)參GAPDH引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)；等級(jí)資料組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，兩兩比較采用Nemenyi檢驗(yàn)。計(jì)量資料雙變量之間的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CHB肝纖維化不同分期組患者M(jìn)R蛋白表達(dá)比較 MR在CHB肝纖維化不同分期組肝組織上均有表達(dá)，主要表達(dá)于肝血竇內(nèi)巨噬細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)上，在肝臟內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)中也有部分表達(dá)，染色清晰，免疫組化結(jié)果見(jiàn)圖1（插頁(yè)）。隨著肝纖維化程度的加重，MR表達(dá)逐漸增強(qiáng)（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 CHB肝纖維化不同分期組MR蛋白表達(dá)強(qiáng)度比較（例）

2.2 CHB肝纖維化不同分期組肝組織MR、NF-κB、TGF-β1、α-SMA mRNA表達(dá)比較 CHB肝纖維化不同分期組肝組織 MR、NF-κB、TGF-β1、α-SMA mRNA表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=32.50、24.35、96.42、54.37，均 P＜0.05）；與 S0組比較，S1～2組、S3～4組肝組織MR、NF-κB、TGF-β1、α-SMA mRNA 表達(dá)均明顯增加（均 P＜0.05）；與 S1～2組比較，S3～4組肝組織 MR、NF-κB、TGF-β1、α-SMA 表達(dá)均明顯增加（均 P＜0.05），見(jiàn)圖 2。2.3 CHB患者肝組織MR mRNA表達(dá)與NF-κB、TGF-β1、α-SMA mRNA表達(dá)的相關(guān)性 CHB患者肝組織MR mRNA 表達(dá)與 NF-κB、TGF-β1、α-SMA mRNA 表達(dá)均呈正相關(guān)（r=0.653、0.811、0.785，均 P＜0.05），見(jiàn)圖 3。

圖2 CHB肝纖維化不同分期組肝組織MR、NF-κB、TGF-β1、α-SMA mRNA表達(dá)比較（CHB為慢性乙肝；MR為甘露糖受體；TGF-β1為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；α-SMA為α-平滑肌肌動(dòng)蛋白；*P＜0.05）

圖3 CHB患者肝組織MR mRNA表達(dá)與NF-κB、TGF-β1、α-SMA mRNA表達(dá)相關(guān)性的散點(diǎn)圖（CHB為慢性乙肝；MR為甘露糖受體；TGF-β1為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；α-SMA為α-平滑肌肌動(dòng)蛋白）

3 討論

慢性HBV感染是全球公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。據(jù)WHO報(bào)道，全球HBV感染率約為3.5%[7]。據(jù)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心統(tǒng)計(jì)，自1992年全面實(shí)行乙肝疫苗接種后，雖然母嬰垂直傳播率和嬰幼兒時(shí)期HBV感染率明顯降低，但是我國(guó)HBV攜帶者的比例仍較高[8]。

肝纖維化是CHB發(fā)展至肝硬化、終末期肝病甚至肝細(xì)胞癌的重要階段[9-10]。肝星狀細(xì)胞的活化是導(dǎo)致肝纖維化發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4]。TGF-β1是導(dǎo)致肝纖維化的關(guān)鍵因子，能激活肝星狀細(xì)胞并使之發(fā)生表型改變，從而表達(dá)大量α-SMA，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積與生成，最終形成肝纖維化[11-12]。另外，NF-κB具有轉(zhuǎn)錄激活功能，參與肝星狀細(xì)胞的活化調(diào)節(jié)，對(duì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展起著重要作用[13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝組織NF-κB、TGF-β1、α-SMA mRNA表達(dá)隨著肝纖維化程度增加而升高，進(jìn)一步證實(shí) TGF-β1、α-SMA、NF-κB 與肝纖維化嚴(yán)重程度密切相關(guān)。

MR是一種Ca2+依賴(lài)的1型跨膜蛋白受體，主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞以及未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面，在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和維持糖蛋白穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用[14]。MR結(jié)構(gòu)中的FNⅡ成分可結(jié)合Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型膠原蛋白，具有清除膠原蛋白的功能，與肝纖維化發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5]。近年來(lái)，MR與肝臟疾病的研究也取得了一些進(jìn)展。Ren等[15]研究發(fā)現(xiàn)，MR在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于正常癌旁組織中的表達(dá)，且在肝硬化、TNM分期差、Child Pugh級(jí)別高的肝癌患者中表達(dá)更強(qiáng)；此外，肝癌組織中MR高表達(dá)者總生存率和無(wú)病生存率明顯降低。本研究采用免疫組化法檢測(cè)肝組織MR蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MR主要表達(dá)在巨噬細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜上，肝內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞上也有分布；在S0期患者中有少量MR表達(dá)，在S1～4期患者中MR蛋白表達(dá)隨著肝纖維化程度的增加而增強(qiáng)。同時(shí)本研究還采用RT-PCR法進(jìn)一步檢測(cè)了肝組織中MR mRNA表達(dá)，與免疫組化結(jié)果一致。

NF-κB在巨噬細(xì)胞中的激活后，可以在某些病理?xiàng)l件下將巨噬細(xì)胞驅(qū)動(dòng)至M1或M2極化，并在疾病進(jìn)展或消退中發(fā)揮重要作用[16]。Yeh等[17]研究發(fā)現(xiàn)三氧化礦物聚集體能通過(guò) Axl、Akt、IKKa/b、IkBa 和 p65 的磷酸化激活A(yù)xl/Akt/NF-κB信號(hào)通路，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2表型極化，上調(diào) IL-10、TGF-β1、MR 表達(dá)，其中 MR表達(dá)呈時(shí)間依賴(lài)性增加；而AXL/Akt/NF-κB抑制劑可抑制M2相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)，使MR表達(dá)減少。NF-κB是M2巨噬細(xì)胞表型的關(guān)鍵調(diào)控因子，MR通常被認(rèn)為是M2巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)志物，筆者推測(cè)MR與NF-κB可能共同參與疾病的發(fā)生、發(fā)展。本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示，MR mRNA 表達(dá)與 NF-κB、TGF-β1、α-SMA mRNA表達(dá)呈高度正相關(guān)，提示MR可能通過(guò)NF-κB通路參與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，隨著肝纖維化程度的增加，CHB患者肝組織 MR 表達(dá)逐漸上調(diào)，且與 NF-κB、TGF-β1、α-SMA表達(dá)均呈正相關(guān)。筆者推測(cè)MR可能通過(guò)NF-κB通路參與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展，但其調(diào)控作用及具體機(jī)制有待后續(xù)細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)作進(jìn)一步證實(shí)。