SIP合胞體在小鼠結(jié)腸中的分布規(guī)律及功能研究

王建峰 陸士蛟 劉俊 王彭 王倩倩 陳杰

消化道運(yùn)動(dòng)受外來神經(jīng)和內(nèi)在神經(jīng)（腸神經(jīng)）的調(diào)控。在生理?xiàng)l件下，腸神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nervous system,ENS）對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)起主要調(diào)節(jié)作用。ENS支配平滑肌運(yùn)動(dòng)不像骨骼肌那樣形成神經(jīng)肌-接頭的突觸聯(lián)系，而是神經(jīng)末梢在平滑肌層內(nèi)形成無數(shù)的曲張?bào)w（內(nèi)含神經(jīng)遞質(zhì)被的囊泡），當(dāng)神經(jīng)沖動(dòng)到來的時(shí)候，曲張?bào)w內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)被釋放出來并擴(kuò)散到平滑肌發(fā)揮作用。近年來研究表明，曲張?bào)w與胃腸道平滑肌細(xì)胞之間有2種間質(zhì)細(xì)胞，即肌間Caja間質(zhì)細(xì)胞（interstitial cell of Cajal,ICC）和血小板衍生生長(zhǎng)因子受體α（platelet-derived growth factor receptor alpha,PDGFRα）陽(yáng)性細(xì)胞[1-4]。平滑肌細(xì)胞與這2種間質(zhì)細(xì)胞形成縫隙連接，組成平滑肌、ICC和PDGFRα陽(yáng)性細(xì)胞合胞體，即SIP合胞體[1]。神經(jīng)遞質(zhì)從曲張?bào)w釋放出來后，絕大部分通過肌間ICC和PDGFRα陽(yáng)性細(xì)胞調(diào)控平滑肌收縮，只有極少量神經(jīng)遞質(zhì)直接擴(kuò)散到平滑肌起作用。結(jié)腸運(yùn)動(dòng)需要ENS和SIP合胞體的共同協(xié)調(diào)配合。ENS由興奮性神經(jīng)元和抑制性神經(jīng)元組成運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，包括一氧化氮合酶（NOS）和嘌呤神經(jīng)元，參與調(diào)節(jié)結(jié)腸運(yùn)動(dòng)[5-6]。Mane等[7]報(bào)道一氧化氮負(fù)責(zé)平滑肌的持續(xù)放松，而嘌呤神經(jīng)元負(fù)責(zé)短暫的放松，這可能在結(jié)腸傳輸中起主要作用。此外，結(jié)腸移行性復(fù)合運(yùn)動(dòng)（colonic migrating motor complexes,CMMC）為結(jié)腸傳輸?shù)闹饕问?，需要滿足2個(gè)條件：（1）膽堿能運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的激活和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)（主要是一氧化氮、嘌呤）的釋放，進(jìn)而作用于SIP合胞體調(diào)節(jié)結(jié)腸傳輸，其中興奮性乙酰膽堿神經(jīng)元與抑制性的一氧化氮能神經(jīng)元主要作用于ICC[1]，進(jìn)一步激活或抑制ICC上的鈣激活氯通道蛋白1（anoctamin 1,ANO1）產(chǎn)生起搏電流，并通過縫隙連接對(duì)平滑肌進(jìn)行興奮性調(diào)節(jié)[8]。另外，ENS中的嘌呤能神經(jīng)元通過腺嘌呤核苷三磷酸等嘌呤能遞質(zhì)激活PDGFRα陽(yáng)性細(xì)胞上的鈣激活鉀通道（small conductance Ca2+-activated K+channel,SK3）對(duì)平滑肌產(chǎn)生抑制性調(diào)節(jié)作用[9]。雖然目前有一些關(guān)于ICC和PDGFRα陽(yáng)性細(xì)胞在胃腸道中的定位、細(xì)胞形態(tài)及相關(guān)功能等方面的研究報(bào)道，但多數(shù)集中在小腸和胃，而對(duì)于結(jié)腸中SIP合胞體的研究較少[10]。因此，本研究擬采用多種實(shí)驗(yàn)方法，主要探討小鼠結(jié)腸近遠(yuǎn)端中這2種間質(zhì)細(xì)胞及離子通道的分布，以及其誘導(dǎo)平滑肌舒縮的傳導(dǎo)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用無特定病原體的C57BL/6J小鼠15只，10～12周齡，雌雄不拘，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供；飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物編號(hào)：A2016047）。

1.2 試劑與儀器 RIPA蛋白裂解液（規(guī)格：100 ml，批號(hào)：p1082）、ECL 蛋白顯色試劑盒（規(guī)格：50 ml，批號(hào)：p0013）均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ANO1抗體（規(guī)格：100 μl，批號(hào)：ab191040）、SK3 抗體（規(guī)格：100 μl，批號(hào)：ab28631）均購(gòu)自英國(guó) Abcam 公司；c-Kit抗體（規(guī)格：20 μl，批號(hào)：3074）、PDGFRα 抗體（規(guī)格：20 μl，批號(hào)：3174）、辣根過氧化物酶標(biāo)記抗兔二抗（規(guī)格：100 μl，批號(hào)：7074）、辣根過氧化物酶標(biāo)記抗鼠二抗（規(guī)格：100 μl，批號(hào)：7076） 均購(gòu)自美國(guó) CST 公司；GAPDH 抗體（規(guī)格：100 μg，批號(hào)：GB11002）購(gòu)自谷歌生物科技有限公司；NOS抑制劑L-NAME（規(guī)格：1 ml，批號(hào)：M00381）購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；ANO1通道阻斷劑 NPPB（規(guī)格：10 mg，批號(hào)：S81879）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；SK3激動(dòng)劑CyPPA（規(guī)格：10 mg，批號(hào)：ab73029）購(gòu)自英國(guó) Abcam 公司；SK3 阻斷劑 apamin（規(guī)格：1 mg，批號(hào)：CP60151）購(gòu)自美國(guó)ChemeGen公司。肌肉張力換能器（型號(hào)：JZJ01，量程30 g）及多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)（型號(hào)：RM-6240C）購(gòu)自成都儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 平滑肌組織制備 異氟烷麻醉后頸椎脫臼處死小鼠，迅速取出結(jié)腸，放入預(yù)先通95% O2+5% CO2混合氣的4℃Krebs平衡溶液中。在解剖顯微鏡下，用眼科剪沿腸系膜方向?qū)⒛c系膜和脂肪組織清理干凈，并沿著腸系膜剪開整個(gè)腸管，腸黏膜向上展開固定；用手術(shù)鑷撕去結(jié)腸黏膜和黏膜下層，保留完整的平滑肌肌層。

1.3.2 c-Kit、ANO1、PDGFRα、SK3 蛋白表達(dá)檢測(cè) （1）采用免疫組化染色法。將甲醛溶液浸泡的小鼠遠(yuǎn)近端結(jié)腸平滑肌組織進(jìn)行包埋，常規(guī)石蠟切片，脫蠟后清水清洗，然后置于100℃檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液（pH 6.0）中20 min進(jìn)行抗原修復(fù)。自然冷卻后浸入3%過氧化氫溶液25 min，PBS充分洗滌。3% BSA封閉2 h后滴加一抗覆蓋組織，切片平放于濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。PBS洗3次，5 min/次，二抗室溫孵育50 min；PBS充分洗滌后擦干，上顯色劑，在顯微鏡下觀察，達(dá)到信號(hào)強(qiáng)度后終止顯色，蘇木精襯染、脫水、透明、封片。（2）采用Western blot法。取小鼠遠(yuǎn)近端結(jié)腸平滑肌組織，加入預(yù)冷的含苯甲基磺酰氟的RIPA蛋白裂解液，轉(zhuǎn)入勻漿儀中研磨（60 s/次，共3次）。4℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上清液，即狹窄段/擴(kuò)張段組織的總蛋白。加入Loading buffer，置于100℃5 min變性。經(jīng)5%濃縮膠和8%分離膠聚丙烯酰胺凝膠電泳后（每孔的上樣量為20 μg總蛋白）轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，3% FBS封閉1 h后進(jìn)行免疫抗體反應(yīng)。使用ECL蛋白顯色試劑盒發(fā)光顯色，并利用Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)曝光。

1.3.3 CMMC檢測(cè) 采用電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)。取小鼠全結(jié)腸，待結(jié)腸規(guī)律的蠕動(dòng)波出現(xiàn)后，分別加入NOS抑制劑L-NAME（100 μM）、ANO1 通道阻斷劑 NPPB（5 μM）、SK3激動(dòng)劑CyPPA（300nM）、SK3阻斷劑apamin（300nM），檢測(cè)給藥前后CMCC。將結(jié)腸放入預(yù)先通混合氣的4℃Krebs平衡溶液中。在解剖顯微鏡下，用眼科剪沿腸系膜方向小心地將腸系膜和脂肪組織清理干凈，輕柔拉直結(jié)腸并用小細(xì)針固定結(jié)腸兩端。使用1 ml注射器連接軟膠管吸取Krebs溶液，將腸道內(nèi)容物打散、沖出，反復(fù)操作，直至糞便全部排出。中空的小鐵球（用于模擬糞便顆粒）插入微細(xì)玻璃管，并將玻璃管與小球由近端向遠(yuǎn)端插入結(jié)腸中。Krebs平衡溶液灌流，恒溫箱將灌流槽的溫度控制在36～37℃，同時(shí)不停輸送混合氣。結(jié)腸連同玻璃管放入灌流槽中穩(wěn)定30 min左右。2根5/0絲線一端通過生物膠分別粘在近端和遠(yuǎn)端結(jié)腸的腸壁上，一端連接肌肉張力換能器。約30 min后旋轉(zhuǎn)肌肉張力換能器旋鈕，給予0.3 g張力。打開多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)，記錄AUC（即時(shí)間和收縮幅度的積分，表示整體收縮強(qiáng)度），計(jì)算加藥前后500 s波形的AUC變化率。

1.3.4 平滑肌自發(fā)性收縮檢測(cè) 采用電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)。將平滑肌肌層沿著環(huán)形肌的方向剪成2 mm×4 mm大小的肌條，用4-0絲線系住兩端，并打大小合適的空心結(jié)，實(shí)驗(yàn)過程中盡量避免對(duì)結(jié)腸組織進(jìn)行不必要的鉗夾與牽拉。分別加入 NOS 抑制劑 L-NAME（100 μM）、ANO1 通道阻斷劑 NPPB（5 μM）、SK3 激動(dòng)劑 CyPPA（300 nM）、SK3阻斷劑apamin（300 nM），檢測(cè)給藥前后平滑肌自發(fā)性收縮。將結(jié)腸平滑肌肌條一端垂直且無張力懸浮固定于盛有10 ml 37℃Krebs平衡溶液的單腔器官浴槽中并連續(xù)通混合氣，另一端用絲線固定于肌肉張力換能器（連接多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)）上。肌條在單腔器官浴槽內(nèi)每隔20 min更新Krebs平衡溶液，平衡30 min后給予初始張力0.3 g，待肌條出現(xiàn)自發(fā)性收縮且平穩(wěn)后，加入通道激動(dòng)劑或阻斷劑，觀察15 min并記錄AUC，計(jì)算加藥前后500 s波形的AUC變化率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Origin數(shù)據(jù)分析軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠近遠(yuǎn)端結(jié)腸平滑肌組織中c-Kit、ANO1蛋白表達(dá)比較 小鼠近端結(jié)腸平滑肌組織中c-Kit、ANO1蛋白表達(dá)分別為 3.24±0.45、1.73±0.35，均明顯高于遠(yuǎn)端結(jié)腸的 1.79±0.26、1.34±0.15，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖 1（插頁(yè)）。

2.2 L-NAME、NPPB對(duì)小鼠近遠(yuǎn)端CMCC和平滑肌自發(fā)性收縮的影響 L-NAME給藥后，結(jié)腸蠕動(dòng)明顯增加，平滑肌自發(fā)性收縮增強(qiáng)；近端CMCC增加至給藥前的（158.7±6.5）%，平滑肌自發(fā)性收縮增強(qiáng)至（137.9±3.9）%；遠(yuǎn)端CMCC 增加至（114.6±7.6）%，平滑肌自發(fā)性收縮增強(qiáng)至（119.5±4.1）%，見圖2a-d。NPPB 阻斷 ANO1通道后，近遠(yuǎn)端CMMC明顯被抑制，近端CMCC降低至給藥前的（46.2±1.8）%，平滑肌自發(fā)性收縮降低至（48.9±6.7）%；遠(yuǎn)端 CMCC 降低至（84.2±2.9）%，平滑肌自發(fā)性收縮降低至（66.5±3.9）%，見圖 2e-h。

圖2 L-NAME、NPPB對(duì)小鼠近遠(yuǎn)端CMCC和平滑肌自發(fā)性收縮的影響（a-d：L-NAME給藥前后；e-h：NPPB給藥前后；與加藥前比較，*P＜0.05；加藥后近遠(yuǎn)端比較，△P＜0.05；CMCC為結(jié)腸移行性復(fù)合運(yùn)動(dòng)）

2.3 小鼠近遠(yuǎn)端結(jié)腸平滑肌組織中PDGFRα、SK3蛋白表達(dá)比較 小鼠近端結(jié)腸平滑肌組織中PDGFRα、SK3 蛋白表達(dá)分別為 0.68±0.09、0.35±0.08，均明顯低于遠(yuǎn)端結(jié)腸的 1.28±0.93、1.50±0.25，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05），見圖 3（插頁(yè)）。

2.4 CyPPA、apamin對(duì)小鼠近遠(yuǎn)端CMCC和平滑肌自發(fā)性收縮的影響 CyPPA給藥后，小鼠近遠(yuǎn)端CMMC被明顯抑制；近端CMCC降低至給藥前的（91.9±2.7）%，平滑肌自發(fā)性收縮降低至（55.2±5.7）%；遠(yuǎn)端CMCC降低至（79.7±2.2）%，平滑肌自發(fā)性收縮降低至（33.3±3.2）%，見圖4a-d。apamin阻斷SK3后，近遠(yuǎn)端CMMC均明顯增強(qiáng)，近端CMCC增強(qiáng)至給藥前的（106.2±7.7）%，平滑肌自發(fā)性收縮增強(qiáng)至（123.9±5.9）%；遠(yuǎn)端CMCC增強(qiáng)至（110.7±3.6）%，平滑肌自發(fā)性收縮增強(qiáng)至（147.5±6.8）%，見圖4e-h。

圖4 CyPPA、apamin對(duì)小鼠近遠(yuǎn)端CMCC和平滑肌自發(fā)性收縮的影響（a-d：CyPPA給藥前后；e-h：apamin給藥前后；與加藥前比較，*P＜0.05；加藥后近遠(yuǎn)端比較，△P＜0.05；CMCC為結(jié)腸移行性復(fù)合運(yùn)動(dòng)）

3 討論

20世紀(jì)70年代末基于電生理學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的觀察，ICC最初被認(rèn)為是起搏細(xì)胞[10-14]。在過去幾年里，ICC的起搏器功能和ENS網(wǎng)絡(luò)被認(rèn)為是結(jié)腸運(yùn)輸中的獨(dú)立系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸中的起搏器網(wǎng)絡(luò)由肌間神經(jīng)叢ICC和肌間ICC組成，且該網(wǎng)絡(luò)通過肌間ICC中的膽堿能KV7.5通道抑制激活[15]。ICC的起搏器功能和ENS網(wǎng)絡(luò)的協(xié)同作用在結(jié)腸傳輸過程中被證實(shí)。有關(guān)ICC順序運(yùn)作的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制認(rèn)為，ICC不僅是消化道平滑肌自律性運(yùn)動(dòng)的起搏細(xì)胞，同時(shí)還介導(dǎo)神經(jīng)信號(hào)的傳遞。ICC胞內(nèi)IP3介導(dǎo)的ANO1通道產(chǎn)生自發(fā)的瞬間內(nèi)向電流，引起ICC自發(fā)的瞬間去極化，進(jìn)而引起胞膜上電壓依賴性鈣通道的開放，使胞外Ca2+內(nèi)流，產(chǎn)生慢波[16]。2012年Koh等[17]首先在消化道平滑肌興奮性的研究中提出SIP合胞體（平滑肌/ICC/PDGFRα陽(yáng)性細(xì)胞）的概念。隨后關(guān)于PDGFRα陽(yáng)性細(xì)胞在平滑肌功能中的作用成為研究熱點(diǎn)。研究表明，在SIP合胞體中，PDGFRα陽(yáng)性細(xì)胞起抑制性作用，嘌呤能抑制性神經(jīng)遞質(zhì)作用于PDGFRα陽(yáng)性細(xì)胞上的P2Y1受體[3，18]，同樣激活PLC/IP3信號(hào)通路，激活SK3產(chǎn)生自發(fā)的瞬時(shí)外向電流，鉀離子外流引起PDGFRα陽(yáng)性細(xì)胞超極化，進(jìn)而通過PDGFRα陽(yáng)性細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞之間的縫隙連接引起平滑肌細(xì)胞超極化[19-20]。因此認(rèn)為胃腸道平滑肌的節(jié)律性收縮是外來神經(jīng)、腸內(nèi)神經(jīng)叢與SIP合胞體共同協(xié)調(diào)作用的結(jié)果[9]。事實(shí)上，結(jié)腸具有多種運(yùn)動(dòng)模式，如CMMC、節(jié)段性活動(dòng)、蠕動(dòng)、張力性抑制等[8，21]。根據(jù)文獻(xiàn)可知，小鼠結(jié)腸推進(jìn)糞粒的速度與CMMC的傳導(dǎo)速度相同，這表明CMMC是糞便推進(jìn)的主要?jiǎng)恿π问絒22]。但無論傳播形式如何，都有必要產(chǎn)生壓力梯度，以確保糞便從結(jié)腸近端推進(jìn)至遠(yuǎn)端。因此，為了進(jìn)一步了解結(jié)腸傳輸動(dòng)力的形成機(jī)制，筆者利用小鼠結(jié)腸標(biāo)本研究SIP合胞體在結(jié)腸近遠(yuǎn)端的分布，并從功能上研究其內(nèi)在傳導(dǎo)機(jī)制。

本研究首先利用免疫組化染色、Western blot法檢測(cè)SIP合胞體在結(jié)腸近遠(yuǎn)端的分布及特異性蛋白表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在小鼠近端結(jié)腸ICC分布多于遠(yuǎn)端結(jié)腸，其中小鼠結(jié)腸平滑肌組織中c-Kit、ANO1蛋白在近端結(jié)腸的表達(dá)高于遠(yuǎn)端結(jié)腸；PDGFRα陽(yáng)性細(xì)胞在小鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸分布多于近端結(jié)腸，其中小鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸平滑肌組織PDGFRα、SK3蛋白表達(dá)明顯高于近端結(jié)腸。進(jìn)一步作與CMMC實(shí)驗(yàn)和平滑肌肌條收縮實(shí)驗(yàn)，將正常小鼠整段結(jié)腸、平滑肌肌條放入水浴槽孵育一段時(shí)間，待出現(xiàn)并保持規(guī)律的蠕動(dòng)波、收縮波后，加入L-NAME阻斷一氧化氮的合成，記錄到近端結(jié)腸CMMC和平滑肌自發(fā)性收縮的頻率較遠(yuǎn)端結(jié)腸明顯增強(qiáng)；加入ANO1通道阻斷劑NPPB后，近端結(jié)腸CMMC和平滑肌自發(fā)性收縮的藥物抑制作用較遠(yuǎn)端結(jié)腸更強(qiáng)；加入SK3激動(dòng)劑CyPPA后，結(jié)腸平滑肌自發(fā)性收縮明顯減弱，CMMC受到明顯抑制，其中遠(yuǎn)端結(jié)腸的CMMC和肌條收縮對(duì)SK3激動(dòng)劑CyPPA更加敏感；加入SK3阻斷劑apamin后，結(jié)腸平滑肌自發(fā)性收縮和CMMC明顯增強(qiáng)，同樣遠(yuǎn)端結(jié)腸對(duì)apamin的作用更加敏感。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，從小鼠近端結(jié)腸到遠(yuǎn)端結(jié)腸，PDGFRα陽(yáng)性細(xì)胞呈遞增性分布，在生理?xiàng)l件下ENS中的一氧化氮能抑制性神經(jīng)通過一氧化氮作用于ICC，使CMMC頻率保持合理的范圍，維持正常的結(jié)腸傳輸功能。同時(shí)，筆者推測(cè)在ENS中，抑制性神經(jīng)元在結(jié)腸自發(fā)性收縮中起主導(dǎo)作用。

綜上所述，筆者推測(cè)在小鼠結(jié)腸SIP合胞體中，2種間質(zhì)細(xì)胞ICC和PDGFRα陽(yáng)性細(xì)胞呈規(guī)律性分布，即結(jié)腸近端到遠(yuǎn)端ICC分布呈遞減性分布，而PDGFRα陽(yáng)性細(xì)胞分布呈遞增性分布，ICC和PDGFRα陽(yáng)性細(xì)胞在結(jié)腸近遠(yuǎn)端的分布梯度與結(jié)腸近遠(yuǎn)端動(dòng)力模式一致，使得結(jié)腸收縮時(shí)能形成結(jié)腸傳輸動(dòng)力的有效梯度，即近端傳輸動(dòng)力最強(qiáng)而遠(yuǎn)端最弱，從而保證糞便從近端結(jié)腸向遠(yuǎn)端結(jié)腸順利排出。SIP合胞體中2種間質(zhì)細(xì)胞的分布及其在結(jié)腸動(dòng)力形成中的初步機(jī)制研究結(jié)果，可能為胃腸動(dòng)力障礙性疾病的診治提供新的思路和新的治療靶點(diǎn)。