耐高溫靈芝菌株的選育*

劉月芹，羅麗媛，劉歡瑞，賀曉龍

（延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 延安 716000）

靈芝（Ganoderma lucidum Karst）是一種主要分布于我國(guó)東部和南部的腐生真菌，具有較高的營(yíng)養(yǎng)、保健和醫(yī)療價(jià)值[1]。靈芝富含糖類（還原糖和多糖）、三萜類、黃酮類、多肽及生物堿等多種活性成分[2]，具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、補(bǔ)氣安神、止咳平喘、延年益壽的功效，被廣泛應(yīng)用于人類各種疾病的預(yù)防和治療中[3-6]。

根據(jù)食用菌對(duì)溫度的要求，可分為低溫型（18℃～21℃），中溫型 （22℃～28℃） 和高溫型（28℃～32℃） 3種類型[7]。靈芝屬高溫型菌類，菌絲體最適生長(zhǎng)溫度為25℃～30℃[7]。然而，近年我國(guó)中南部的大部分省市的夏季溫度普遍在35℃～38℃，人工培養(yǎng)靈芝控溫成本較高且污染較大，導(dǎo)致目前市場(chǎng)上靈芝產(chǎn)品的生產(chǎn)成本高，若能選育出耐高溫的靈芝菌種并投入生產(chǎn)，則可使靈芝這一寶貴資源得到更高效的利用，使靈芝產(chǎn)品的市場(chǎng)前景更加廣闊。

微生物菌種的選育方法包括誘變育種、雜交育種、原生質(zhì)體融合技術(shù)、基因工程育種等[8-12]。在這些菌種選育的方法中，原生質(zhì)體紫外誘變育種是目前實(shí)驗(yàn)室以及生產(chǎn)單位中最常用的菌種選育方法[13-16]，同時(shí)食用菌原生質(zhì)體制備與再生技術(shù)已經(jīng)相對(duì)成熟，為本試驗(yàn)順利開展奠定了良好的基礎(chǔ)[17-18]。

利用原生質(zhì)體紫外誘變的方法，對(duì)誘變后的靈芝菌株進(jìn)行培養(yǎng)。通過(guò)考察靈芝菌絲體生長(zhǎng)狀態(tài)和生長(zhǎng)速度，經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩選育出能在37℃高溫下生長(zhǎng)良好的誘變菌株，對(duì)實(shí)現(xiàn)靈芝的高溫栽培、高溫發(fā)酵生產(chǎn)天然產(chǎn)物和其他耐高溫菌株的選育提供了一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 菌株

靈芝菌株（Ganoderma lucidum CGMCC 5.616），購(gòu)買于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（菌株的最適培養(yǎng)溫度為28℃），保存于4℃冰箱PDA斜面培養(yǎng)基。

甘露醇、溶壁酶，上海生工生物工程有限公司；葡萄糖、酵母浸粉、麥芽糖，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備

VS-1300U超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；DW-86L388超低溫冰箱，青島海爾特種電器有限公司；BPG-9156A恒溫干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DHP-9902恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV-1200紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；ZQZY-BG組合式光照振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；5424高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)艾本德股份公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

PDA液體培養(yǎng)基：土豆（去皮）200 g，在水中煮至土豆將熟，加入葡萄糖20 g，再加水至總體積1 000 mL，pH自然。

PDA固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基配方中加入瓊脂20 g，加水至總體積1 000 mL，pH自然。

由式(4)和(5)計(jì)算MPRM電路的動(dòng)態(tài)功耗和靜態(tài)功耗，需計(jì)算邏輯門gk的信號(hào)概率Pr(gk)和Pk,v.為兼顧信號(hào)概率計(jì)算的時(shí)間效率以及準(zhǔn)確性，在計(jì)算信號(hào)概率時(shí)，對(duì)MPRM電路中不存在相關(guān)性的信號(hào)采用簡(jiǎn)單信號(hào)概率計(jì)算法，對(duì)存在相關(guān)性的信號(hào)則采用概率表達(dá)式法.

麥芽糖酵母膏葡萄糖（maltose yeast extract glucose，MYG） 再生培養(yǎng)基：麥芽糖10 g、葡萄糖4 g、酵母浸粉5 g，溶于0.6 mol·L-1甘露醇溶液中，至總體積1 000 mL，pH為7.2。

MYG固體培養(yǎng)基：MYG液體再生培養(yǎng)基中加入瓊脂20 g，溶于0.6 mol·L-1甘露醇溶液中，至總體積1 000 mL，pH為7.4。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化及液體培養(yǎng)

取保存于4℃冰箱的靈芝菌株，在無(wú)菌環(huán)境下接種于試管斜面PDA培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d～10 d，至菌絲密集生長(zhǎng)即活化完成。

取活化后的靈芝菌種試管，在無(wú)菌環(huán)境下將約5 mm2大小的菌種塊，接種于盛有45 mL PDA液體培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，28℃下靜止培養(yǎng)1 d后于260 r·min-1震動(dòng)培養(yǎng)2 h后，將轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)為180 r·min-1，溫度不變，繼續(xù)培養(yǎng)5 d后備用。

1.2.2 原生質(zhì)體制備與再生

用滅過(guò)菌的4層紗布過(guò)濾培養(yǎng)好的菌絲，無(wú)菌水洗滌2次～3次，用無(wú)菌吸水紙吸干菌絲水分，將其置于酶液中（0.24 g溶壁酶溶解于12 mL的0.6 mol·L-1甘露醇溶液中，經(jīng)0.22 μm細(xì)菌過(guò)濾膜過(guò)濾除菌），輕微震蕩，置于32℃、80 r·min-1的搖床中震蕩酶解3 h。用砂芯漏斗過(guò)濾除去酶解液中殘留的菌絲，收集濾液，使用高速冷凍離心機(jī)在4℃、4 000 r·min-1條件下離心10 min，棄上清液，沉淀用0.6 mol·L-1甘露醇溶液洗滌2次，在顯微鏡下觀察去壁成功后，得到純化的原生質(zhì)體[17]。使用血球計(jì)數(shù)板對(duì)純化的原生質(zhì)體進(jìn)行計(jì)數(shù)，稀釋濃度約為1×106個(gè)/mL，吸取100 μL涂布于MYG固體再生培養(yǎng)基中黑暗培養(yǎng)12 d后，統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體的再生率[14]。

1.2.3 原生質(zhì)體紫外誘變

在再生率滿足試驗(yàn)要求的情況下（>0.5%）[18]，按上述方法制備原生質(zhì)體，分別取3 mL稀釋的原生質(zhì)體懸液置于無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每3個(gè)培養(yǎng)皿一組，在黑暗條件下，用功率為10 W的紫外燈距離20 cm分別照射 0、10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s、70 s。取100 μL誘變后的原生質(zhì)體用涂布棒涂布于MYG再生培養(yǎng)基中，黑暗中培養(yǎng)7 d～14 d后，在顯微鏡下觀察再生菌落是否為白色的圓點(diǎn)狀并記錄，統(tǒng)計(jì)不同照射時(shí)間下的靈芝原生質(zhì)體致死率[13，19]。5次重復(fù)試驗(yàn)后，取平均值繪制致死曲線。

1.2.4 初篩標(biāo)準(zhǔn)的確立

確立初步篩選的標(biāo)準(zhǔn)：將出發(fā)菌株（G.lucidum CGMCC 5.616母種）接種于PDA固體培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)3 d后用筆劃出靈芝菌絲的生長(zhǎng)范圍，后置于高溫（49℃、50℃、51℃、52℃、53℃） 培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)2 h，每個(gè)溫度下設(shè)5個(gè)平行，共25個(gè)培養(yǎng)皿。將熱激后的培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到28℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察菌絲在熱激處理后菌絲恢復(fù)生長(zhǎng)的情況，確定出發(fā)菌株的對(duì)高溫的臨界溫度，并將該溫度下熱激2 h是否能恢復(fù)生長(zhǎng)作為耐高溫誘變菌株的初篩標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5 耐高溫誘變菌株篩選

對(duì)經(jīng)紫外誘變后出發(fā)菌株的再生菌株用接種鋤截取5 mm2大小帶有白色圓點(diǎn)狀的菌絲塊進(jìn)行分離純化，然后隨機(jī)挑取35個(gè)誘變菌株和出發(fā)菌株分別接種于平板培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)5 d后，分別在初篩確立的臨界溫度培養(yǎng)箱中熱激2 h后，同時(shí)重新置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)，黑暗條件下培養(yǎng)13 d后開始觀察，每3天觀察1次，篩選比出發(fā)菌株恢復(fù)生長(zhǎng)快，且與出發(fā)菌株對(duì)峙培養(yǎng)出現(xiàn)拮抗反應(yīng)的誘變菌株即為耐高溫誘變菌株[14]。

1.2.6 誘變菌株生長(zhǎng)速度試驗(yàn)

將出發(fā)菌株與挑選出的35個(gè)誘變菌株分別接種于PDA斜面試管中，每個(gè)菌株接種6支試管，28℃恒溫培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)出后劃線開始觀察，每個(gè)菌株分別抽取劃線后的6支試管中的3支試管繼續(xù)在28℃培養(yǎng)5 d，劃線測(cè)量菌絲生長(zhǎng)長(zhǎng)度，計(jì)算菌株在28℃時(shí)的生長(zhǎng)速度，即恒溫生長(zhǎng)速度；將另外3支試管置于37℃（根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康囊x育出能在35℃～38℃高溫下生長(zhǎng)良好的耐高溫菌株而自行設(shè)置的溫度）培養(yǎng)5 d，劃線測(cè)量菌絲長(zhǎng)度，計(jì)算菌株在高溫下的生長(zhǎng)速度，即高溫生長(zhǎng)速度；再將高溫下生長(zhǎng)的菌株重新置于28℃下培養(yǎng)5 d，劃線測(cè)量其生長(zhǎng)長(zhǎng)度，計(jì)算生長(zhǎng)速度，即恢復(fù)生長(zhǎng)速度。菌絲生長(zhǎng)速率（V，mm·d-1）的計(jì)算公式為：

式中：S為菌絲長(zhǎng)度（mm）；D為菌絲生長(zhǎng)天數(shù)（d）。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.5進(jìn)行方差分析（P<0.05顯著性差異；P<0.01極顯著性差異）。

2 結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)體的制備與再生

本試驗(yàn)原生質(zhì)體的獲得是在溶壁酶濃度為2%，酶解溫度為32℃，酶解時(shí)間3 h的條件下制備，在此條件下，制得的原生質(zhì)體數(shù)量可達(dá)到1.36×106個(gè)/mL，原生質(zhì)體的再生率為1.28%，原生質(zhì)體的數(shù)量和質(zhì)量能夠滿足本試驗(yàn)所需。

2.2 紫外誘變時(shí)間的確定

用紫外線燈將出發(fā)菌株的原生質(zhì)體懸液進(jìn)行不同時(shí)間梯度 （0、10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s、70 s）的照射處理，根據(jù)原生質(zhì)體的再生情況制作紫外誘變效應(yīng)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 紫外誘變效應(yīng)曲線Fig.1 The effect curve of UV mutagenesis

由圖1可以看出，菌株在0～30 s致死率升高較快，照射時(shí)間為60 s后致死率達(dá)到95%。在進(jìn)行紫外誘變的過(guò)程中，一般認(rèn)為致死率70%左右時(shí)，菌株突變的效果最好[14]。因此，為了獲得較高的正突變率，選擇誘變時(shí)間為30 s的誘變菌株進(jìn)行試驗(yàn)。

2.3 初步篩選標(biāo)準(zhǔn)的確立

以出發(fā)菌株為試驗(yàn)材料進(jìn)行耐熱性試驗(yàn)，結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)52℃高溫刺激2 h后，出發(fā)菌株的菌絲無(wú)法恢復(fù)生長(zhǎng)；經(jīng)過(guò)51℃高溫刺激后，出發(fā)菌株的菌絲萎縮明顯，13 d后恢復(fù)生長(zhǎng)，菌絲生長(zhǎng)稀疏，速度緩慢。由此確定出發(fā)菌株的恢復(fù)生長(zhǎng)的臨界溫度為51℃。將51℃熱激2 h后恢復(fù)生長(zhǎng)所篩選出的菌株為耐高溫誘變菌株。

2.4 耐高溫菌株的獲得

高溫會(huì)導(dǎo)致菌絲生長(zhǎng)緩慢，甚至停止生長(zhǎng)或死亡[20]。通過(guò)對(duì)誘變菌株進(jìn)行51℃熱激2 h耐高溫復(fù)篩試驗(yàn)后，最終獲得耐高溫誘變菌株10株，根據(jù)初篩標(biāo)準(zhǔn)確立時(shí)的試驗(yàn)結(jié)果，從第13天開始測(cè)量菌絲生長(zhǎng)長(zhǎng)度和觀察菌絲長(zhǎng)勢(shì)。其菌絲恢復(fù)生長(zhǎng)情況見(jiàn)表1。

由表1可知，經(jīng)過(guò)誘變后，60%菌株的生長(zhǎng)情況比出發(fā)菌株好，40%誘變菌株的菌絲生長(zhǎng)速度低于出發(fā)菌株。其中生長(zhǎng)較好的10株耐高溫菌株為Y1、Y3、Y4、Y8、Y11、Y17、Y20、Y28、Y30 和Y35。Y1菌株在修復(fù)生長(zhǎng)的第13天、第16天和第19天，其生長(zhǎng)速度比出發(fā)菌種分別提高了33.56%、32.91%和31.77%，差異顯著（P<0.05）。Y30菌株第19天的生長(zhǎng)速度與出發(fā)菌種相比差異不顯著，但第13天、第16天的生長(zhǎng)速度比出發(fā)菌株分別提高了41.09%，30.74%且差異顯著（P<0.05）。從結(jié)果可以看出，通過(guò)原生質(zhì)體紫外誘變的方法可有效篩選出耐高溫靈芝誘變菌株。

表1 高溫?zé)峒ず缶z修復(fù)生長(zhǎng)情況Tab.1 The mycelial recovery growth after high temperature heat shock

2.5 誘變菌株菌絲生長(zhǎng)速度

為進(jìn)一步驗(yàn)證初篩的10株耐高溫誘變菌株的耐溫情況，將各誘變菌株在28℃、37℃及經(jīng)歷37℃高溫脅迫后重新置于28℃下的生長(zhǎng)速度分別記為恒溫生長(zhǎng)速度、高溫生長(zhǎng)速度和恢復(fù)生長(zhǎng)速度，其統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 誘變菌株菌絲生長(zhǎng)速度試驗(yàn)Tab.2 The test of mycelium growth rate of mutagenic strains

如表2所示，28℃恒溫生長(zhǎng)條件下，出發(fā)菌株和誘變菌株的生長(zhǎng)速度并無(wú)差異。但37℃高溫下，誘變菌株的生長(zhǎng)速度均高于出發(fā)菌株。尤其菌株Y1和Y30，其生長(zhǎng)速度比出發(fā)菌株分別提高了64.02%、60.83%，差異顯著（P<0.05）。28℃下菌株Y1、Y30、Y8和Y35的修復(fù)生長(zhǎng)速度比出發(fā)菌株分別提高了42.72%、38.26%、38.02%和34.74%，且差異顯著（P<0.05）。其他誘變菌株的恢復(fù)生長(zhǎng)速度雖然與出發(fā)菌株相比并無(wú)差異，但均高于出發(fā)菌株。這表示高溫對(duì)靈芝菌絲的生長(zhǎng)速度有明顯的抑制作用，但耐高溫誘變菌株確實(shí)有較強(qiáng)且穩(wěn)定的耐高溫能力。

3 討論與結(jié)論

利用耐高溫菌株可以實(shí)現(xiàn)菌株的高溫發(fā)酵，該方式可以減少污染，縮短生產(chǎn)周期，提高次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，節(jié)能降耗，大幅度降低菌種生產(chǎn)成本。目前，大型真菌的大部分研究均為利用紫外誘變的方法以獲得目的菌株[21-22]。通過(guò)紫外誘變選育耐高溫菌株是一種簡(jiǎn)便可行的方法，紫外誘變?cè)|(zhì)體成功的關(guān)鍵是紫外照射條件的選擇，由于紫外照射下原生質(zhì)體突變的方向不確定，試驗(yàn)中需要對(duì)耐高溫菌株進(jìn)行篩選。為了獲得更有使用價(jià)值和利于生產(chǎn)的菌株，采用紫外照射致死率在70%～80%時(shí)的照射條件，在本試驗(yàn)中經(jīng)過(guò)多次反復(fù)處理，選擇了照射時(shí)間30 s，致死率為72%的照射條件。在食用菌誘變菌株的篩選中，由于育種目的不同，誘變菌株的篩選方法也不盡相同。如以提高產(chǎn)物為目的篩選菌株，主要依靠產(chǎn)物的物理和化學(xué)性質(zhì)，如通過(guò)觀察瓊脂培養(yǎng)基上的抑菌圈、透明圈及水解圈等；以對(duì)環(huán)境高耐受性為目的篩選菌株，可以利用相應(yīng)的選擇培養(yǎng)基[14，23-24]。本試驗(yàn)通過(guò)建立耐高溫菌株51℃下熱激2 h的初篩標(biāo)準(zhǔn)，共獲得耐高溫靈芝菌株10株，并通過(guò)進(jìn)一步的高溫試驗(yàn)，驗(yàn)證了這10株耐高溫菌株在37℃下有較好的生長(zhǎng)活性，其中菌株Y1和Y30的耐高溫性能尤為顯著。試驗(yàn)篩選出的耐高溫靈芝誘變菌株不僅為靈芝的基礎(chǔ)研究及其他耐高溫菌株的選育提供了一定的參考價(jià)值，還為實(shí)現(xiàn)靈芝的高溫栽培、高溫發(fā)酵生產(chǎn)天然產(chǎn)物提供了技術(shù)支持和理論依據(jù)。