EPO對(duì)大鼠肺缺血再灌注損傷時(shí)FKN及MCP-1表達(dá)的影響

高菡 李建強(qiáng) 張莉娟 趙卉

肺缺血再灌注損傷是指缺血基礎(chǔ)上恢復(fù)血流灌注后，肺組織細(xì)胞損傷加重的病理狀態(tài)。常見于肺栓塞溶栓和介入治療、肺移植及體外循環(huán)后。隨著肺溶栓、介入治療、肺移植等多項(xiàng)技術(shù)的深入開展，如何阻斷缺血再灌注對(duì)肺的損傷成為臨床醫(yī)生們關(guān)注的焦點(diǎn)。

Epo是一種調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成的糖蛋白類激素，主要由腎臟近曲小管附近的間質(zhì)細(xì)胞合成和分泌，其基本生理功能是刺激骨髓紅細(xì)胞的生成和釋放。目前臨床上主要用Epo治療腎性貧血以及腫瘤等各種慢性疾患所伴發(fā)的貧血。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Epo還具有抗氧化、抗凋亡、促血管生成、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等作用，EPO受體在全身多個(gè)器官，如心、腦、腎、小腸、肺均有表達(dá)[1]，目前已有研究證實(shí)，EPO對(duì)心、腦、腎、肝臟等器官[2-5]的缺血再灌注有保護(hù)作用。但有關(guān)肺缺血再灌注損傷保護(hù)作用方面的報(bào)道較少。本研究旨在探討EPO在肺缺血再灌注中是否亦有保護(hù)作用以及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠72只（山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供），體重200～300g。

1.2 主要試劑及儀器 重組人促紅細(xì)胞生成素（rhEPO北京四環(huán)生物工程制品廠），戊巴比妥鈉注射液（上海劑三廠）、fractalkine PV免疫組化試劑盒（北京中衫金橋公司），MCP-1 ELISA試劑盒（美國(guó)R＆D進(jìn)口分裝公司）、動(dòng)物呼吸機(jī)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康雄性Wistar大鼠72只隨機(jī)分為三組，每組24只。假手術(shù)組（A組）：只開胸游離右肺門，無(wú)其他特殊處理。缺血再灌注組（B組）：開胸游離右肺門后，夾閉肺門阻斷45 min，分別再灌注60min、120min。EPO干預(yù)組（C組）：綜合參考Haiwei Wu[6-7]等給藥方法，于術(shù)前2h腹腔注射rhEPO（5000U/kg）。余處理同B組。

1.4 動(dòng)物模型的建立 健康Wistar大鼠，3％戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射麻醉后，尾靜脈注射肝素（100U/kg）。仰臥位固定，氣管切開后插管，接動(dòng)物呼吸機(jī)行機(jī)械通氣（吸入室內(nèi)空氣，呼吸頻率60次/min，潮氣量單側(cè)肺通氣8～10mL/kg，雙側(cè)肺通氣15～20mL/kg，吸呼比為1∶2），然后經(jīng)胸骨右緣第3～5肋間開胸，離斷右肺下韌帶，游離右肺門，下穿手術(shù)線，于呼氣末結(jié)扎右肺門（右主支氣管，右肺動(dòng)、靜脈），夾閉45min后開放60min及120min，制成在體肺缺血再灌注模型。

1.5 標(biāo)本采集及檢測(cè)方法 各組分別于缺血45min、再灌注60min、120min 3個(gè)時(shí)點(diǎn)采集標(biāo)本。

1.5.1 免疫組化法測(cè)肺組織fractalkine 采用免疫組織化學(xué)染色（PV）法檢測(cè)大鼠肺組織fractalkine蛋白的表達(dá)。應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，結(jié)果以平均光密度值（OD）表示。

1.5.2 ELASA法檢測(cè)血漿中MCP-1的含量 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)樣品吸光度值計(jì)算出對(duì)應(yīng)濃度。

1.5.3 病理檢查

1.5.3.1 肉眼觀察 肺臟顏色、有無(wú)出血點(diǎn)、彈性等。

1.5.3.2 光鏡下病理變化 取右肺中葉約1cm×1cm×1cm大小組織塊，用10％甲醛固定，予以常規(guī)石蠟包埋、切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。

1.5.4 肺組織W/D 取1g右肺組織用分析天平稱重為濕質(zhì)量（W），置于70℃電熱恒溫干燥箱中烤48h后稱重為干質(zhì)量（D），二者之比即為W/D。

表1 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)FKN、MCP-1的表達(dá)及W/D值的變化±s）

表1 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)FKN、MCP-1的表達(dá)及W/D值的變化±s）

注：與A組相比，aP＜0.05；與B組相比，bP＜0.05

FKN（OD值） MCP-1（ng/L） W/D A組 缺血45min 0.175±0.013 24.95±4.61 4.46±0.32缺血再灌1h 0.184±0.013 25.00±4.14 4.51±0.40缺血再灌2h 0.195±0.008 26.35±4.18 4.69±0.51 B組 缺血45min 0.237±0.014a 38.66±5.35a 4.83±0.64缺血再灌1h 0.294±0.022a 41.26±7.09a 5.67±0.46a缺血再灌2h 0.392±0.025a 60.62±10.33a 6.37±0.32a C組 缺血45min 0.226±0.024a 37.35±8.29a 4.61±0.35缺血再灌1h 0.241±0.025ab 40.75±10.74a 5.47±0.31a缺血再灌2h 0.283±0.031ab 51.09±10.85ab 5.92±0.40ab

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行多組資料的方差分析，各時(shí)點(diǎn)組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理檢查

2.1.1 肉眼見 A組肺組織呈淡粉色，光滑有彈性，無(wú)出血點(diǎn)。B組可見多處出血點(diǎn)，彈性差，色暗紅，再灌2h時(shí)點(diǎn)標(biāo)本可見片狀出血。C組可見散在出血點(diǎn)，較B組減少，彈性較差，色暗紅。

2.1.2 光鏡下見 A組肺泡腔完整，肺泡間隔均勻一致，無(wú)明顯充血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。B組肺間質(zhì)毛細(xì)血管充血，肺泡間隔明顯增厚，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔內(nèi)可見血細(xì)胞滲出及滲液積聚，且損傷程度隨再灌注時(shí)間增長(zhǎng)而加重。C組肺泡壁略厚，間質(zhì)毛細(xì)血管充血程度降低，肺泡間隔炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及肺泡腔出血、滲出程度于相同時(shí)間點(diǎn)與B組比較均明顯減輕。

2.2 肺組織FKN（fractalkine）的表達(dá)變化 FKN陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜著色成棕黃色。B組肺組織表達(dá)高水平fractalkine蛋白，主要分布在肺泡上皮細(xì)胞、小支氣管上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。對(duì)肺組織中FKN表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量，用平均光密度值（OD）表示。A組表達(dá)弱，B組表達(dá)明顯增強(qiáng)，C組較B組表達(dá)減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），B組和A組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 血漿中MCP-1含量 與A組比較，B組各時(shí)相點(diǎn)含量明顯增加（P＜0.05），C組經(jīng)EPO干預(yù)后MCP-1含量與B組比較在再灌2h時(shí)點(diǎn)明顯下降（P＜0.05）。見表1。

2.4 肺組織W/D A組大鼠肺組織W/D比值隨時(shí)間延長(zhǎng)變化不顯著，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；再灌注后，B組肺組織W/D比值隨再灌時(shí)間延長(zhǎng)呈進(jìn)行性升高；C組經(jīng)EPO干預(yù)后肺組織W/D比值較B組明顯降低，但仍高于假手術(shù)組。

3 討論

肺缺血再灌注損傷（LIRI）主要有如下幾種機(jī)制：①氧自由基的釋放及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)；②細(xì)胞內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)；③炎性細(xì)胞大量浸潤(rùn)及炎性介質(zhì)的釋放引起的過度的炎癥反應(yīng)；④細(xì)胞凋亡。以上幾種因素互為因果、相互促進(jìn)，最終使得肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損、血管通透性增加、滲出增多、肺泡間隔增厚，最終導(dǎo)致肺臟氣體交換等功能受損，引發(fā)呼吸衰竭及肺水腫等。

EPO目前在臨床上應(yīng)用于各種原因?qū)е碌呢氀?。但EPO受體在組織中分布的廣泛性，提示EPO的作用可能并非僅局限于造血系統(tǒng)。國(guó)內(nèi)外已有研究發(fā)現(xiàn)EPO可以通過上調(diào)bcl-xl基因、抑制細(xì)胞色素C的釋放、增加SOD活性抗氧化作用，以及上調(diào)Na-KATP酶等多條途徑在減少重要器官諸如心、腦、腎、肝等缺血再灌注損傷時(shí)起著舉足輕重的保護(hù)作用。EPO受體在肺臟亦有表達(dá)，說明EPO對(duì)肺臟可能亦有相關(guān)作用。有研究表明，EPO可以抑制NF-κB活化來保護(hù)高氧所致的肺損傷[8]，同時(shí)可以保護(hù)脂多糖引起的肺損傷[9]。

大量的研究已表明炎性細(xì)胞在肺組織內(nèi)的聚集與活化是肺缺血再灌注損傷發(fā)生的重要機(jī)制。炎性細(xì)胞活化后可釋放大量炎性介質(zhì)，它們與上述引起肺缺血再灌注的幾種基本機(jī)制相互作用、相互促進(jìn)，最終引起炎性因子瀑布式釋放，導(dǎo)致缺血再灌注損傷。炎性細(xì)胞在肺組織內(nèi)的募集是多步驟的過程，有很多因素參與其過程，其中包括炎性趨化因子。它可以協(xié)助炎性細(xì)胞的黏附與遷徙，促進(jìn)炎性細(xì)胞在肺泡間隔的浸潤(rùn)。因此，作為炎性通路上始動(dòng)因子的炎性趨化因子的含量變化可以預(yù)示并反映缺血再灌注損傷的嚴(yán)重程度。本實(shí)驗(yàn)旨在通過測(cè)定炎性趨化因子不同家族的兩個(gè)代表FKN、MCP-1在各組各時(shí)點(diǎn)的變化情況，探討EPO對(duì)肺缺血再灌注的作用及可能存在的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)中所用試劑rHuEPO是用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的含有與天然分離的EPO完全相同氨基酸序列的糖蛋白，具有與天然EPO相同的生物學(xué)活性。

FKN（Fractalkine）和MCP-1分別是趨化因子CX3C家族及CC家族的成員。FKN廣泛表達(dá)在大鼠的心、腦、肺、腎、骨骼肌和睪丸組織中[10]。它可以參與淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞的募集和它們與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附并導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷等過程[11]。MCP-1主要功能是趨化和激活單核巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，使各種炎性細(xì)胞尤其是單核細(xì)胞向病變部位聚集[12]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，①肉眼所見術(shù)后取下的肺大體標(biāo)本隨著再灌時(shí)間的延長(zhǎng)，損傷加重（肺的彈性降低，出血點(diǎn)增加甚至融合成呈片狀）。給予rhEPO干預(yù)后，損傷程度有所下降，光鏡下所見亦印證了該結(jié)論。②B組與A組各時(shí)間點(diǎn)縱向比較，F(xiàn)KN及MCP-1的表達(dá)均明顯升高，且B組隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)KN及MCP-1均呈升高趨勢(shì)。③C組FKN、MCP-1表達(dá)水平較B組均有所降低。④C組與B組比較，反應(yīng)肺微血管損傷及水腫程度的肺W/D亦下降。

上述結(jié)果說明，rhEPO可減緩肺缺血再灌注損傷。FKN、MCP-1均參與了大鼠肺缺血再灌注損傷的過程，給予rhEPO干預(yù)后可顯著降低二者的表達(dá)?？梢酝茰y(cè)：EPO產(chǎn)生保護(hù)作用可能是通過減少炎性趨化因子如FKN及MCP-1的表達(dá)，從而抑制炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、減少炎性因子的釋放來實(shí)現(xiàn)的。

本實(shí)驗(yàn)從炎性通路這一角度探討了EPO對(duì)肺缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)作用的機(jī)制，為拓寬EPO在臨床上的應(yīng)用提供了潛在的可能性，但其遠(yuǎn)期作用及臨床具體應(yīng)用仍需進(jìn)一步研究。

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