牡丹生殖生物學的研究進展

張鎮(zhèn)梁，邢福武，侯小改，王發(fā)國，喬 琦*

（1.河南科技大學農學院/牡丹學院，河南洛陽471023；2.中國科學院華南植物園，廣東廣州510650）

牡丹（Paeonia suffruticasaAndrews.）是芍藥科（Paeoniaeeae）芍藥屬（Paeonia）牡丹組（Sect.Mou?tonDC）植物，為多年生灌木［1-3］。該組分為兩個亞組：革質花盤亞組（Subsetc.Vaginatea）和肉質花盤亞組（Subsetc Delavayanae Stern），共9 個種。其中，革質花盤亞組包括矮牡丹（Paeonia jishanensis）、卵葉牡丹（Paeonia qiui）、楊山牡丹（Paeonia ostii）、紫斑牡丹（Paeonia rockii）、四川牡丹（Paeonia decomposi?ta）5 個種；肉質花盤亞組包括4 個種，即紫牡丹（Paeonia delavayi）、黃牡丹（Paeonia lutea）、狹葉牡丹（Paeonia potaninii）、大黃花牡丹（Paeonia lud?lowii）［4-5］。牡丹因花大色艷、品冠群芳，故有“花中之王”、“國色天香”的美譽［7-8］，具有觀賞、藥用和食用價值［6-8］。

目前對于牡丹的研究，主要集中在野生種分類、栽培品種分類、遺傳多樣性以及文旅等方面，而對其生殖生物學方向的研究尚未全面報道［9］。因此對牡丹花部特征、開花物候、傳粉、花粉活力、結實特性、種子休眠與萌發(fā)等生殖生物學特性進行了歸納，以期為相關研究工作提供理論依據和有利的參考。

1 牡丹的地理分布

牡丹原產中國，其適應性強，可耐干旱。牡丹最大最集中的栽培區(qū)是菏澤、洛陽、北京、臨夏、彭州、銅陵縣等。通過中原花農冬季赴粵、閩、浙、深圳、海南進行牡丹催花，促使了牡丹在以上幾個地區(qū)生殖發(fā)育，使牡丹種植遍布到中國各省市自治區(qū)［10］。事實上，經過2 000 多年的生產實踐，我國栽培牡丹的多樣性不僅更加豐富，而且對環(huán)境的適應能力也增強，基本形成了以我國中原、西北、江南及西南地區(qū)為主的幾個品種群［11-12］（表1）。

表1 牡丹四大栽培品種群Table 1 Four major cultivars of peony

2 牡丹開花生物學研究

牡丹開花生物學包括花芽分化、花部構成、配子體的發(fā)生和發(fā)育、開花物候等過程［13-14］。

2.1 牡丹開花物候及花部特征

開花物候是牡丹生殖生物學研究的重要環(huán)節(jié)之一，包括開花的起始時間、開花高峰期和末花期，它對牡丹結實成功具有重要影響［15］。對比全國各地牡丹的花期表征，我們可以看出，通常花期時間差異較大，如河南省洛陽市最長為17 d，同一地區(qū)不同品種的開花物候也有較大的差別，因而有早、中、晚花的區(qū)分。

花部特征：單花生于枝梢，直徑10～17 cm；莖長4～6 cm；綠色，苞片長圓形，數量5枚；綠色萼片，5 枚，匙形或卵圓形，頂端急尖；花冠放射狀，花基部盤繞卷曲；花瓣5 枚，或重瓣，粉紅色、紅紫色、粉紅色至白色，倒卵形，長5～8 cm，寬4.2～6 cm，先端呈不規(guī)則波浪形；花藥扭曲縮短，長圓形，長4 mm；花絲從開花到凋謝均纖細，紫紅色和粉紅色，上部為白色，長約1.3 cm；花盤革質，杯狀，紫紅色、黃色、綠色，先端有數個尖齒或裂片，完全包圍心皮，心皮成熟后干燥，2～6 枚，無毛，有光澤，顏色隨柱頭變化而變化。自然花期為3月中旬～6月上旬，單花的花期約 3～10 d，群體的花期在 20～30 d［16-17］，并且每年只開花一次。

2.2 牡丹花芽分化

花芽分化是開花過程中非常重要的一步，直接影響著開花的數量和質量。牡丹作為中國的傳統名花，其花芽分化不僅對其自然花期觀賞價值有著重要影響，也是進行花期調控的重要依據［18］。牡丹的花芽分化通常在6 月初開始，在9 月下旬至10 月中旬結束，雌蕊和雄蕊的瓣化主要發(fā)生在11月至下年年初，其分化進程依照萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊（心皮）的順序進行［19-20］。但是，花芽分化過程發(fā)生的時間因植株的條件和品種不同而不同。國內對牡丹花芽分化的研究主要集中在分化類型和分化進程上［21］。賀丹等［22］采用石蠟切片技術和觀察測量方法對牡丹栽培品種——鳳丹進行了觀察，根據切片顯示，牡丹花芽為混合芽，大致分為早期花芽分化、苞片初生分化、萼片初生分化、花瓣初生分化、雄蕊初生分化和雌蕊初生分化六個時期。楊正申等［23］選取27個牡丹品種研究花芽分化，發(fā)現分化可分為幼葉分化完成、花被分化和雌蕊分化三個時期，并以此將牡丹分為‘趙粉型’、‘櫻落寶珠型’和‘洛陽紅型’?；ㄑ糠只俣瓤臁⑼瓿蓵r間早的牡丹品種更容易用于栽培試驗。來自中原地區(qū)的中國牡丹品種，其花芽分化開始時間在日本比中國稍晚，可作為節(jié)日花材推廣。

3 牡丹傳粉生物學研究

花粉是種子植物的雄配子體，在生殖過程中起著重要的作用［24］?；ǚ蹆Υ娉１挥脕硌娱L親本不開花授粉的植物的壽命。在授粉前一般都進行萌發(fā)率的測定，確定花粉是否具備受精能力。測定花粉萌發(fā)率的主要方法有三種：離體萌發(fā)、活體萌發(fā)和用氧化還原染料的非萌發(fā)分析測定法［25］?；ǚ勖劝l(fā)率的測定對于雜交育種工作具有重要的意義，這樣可以減少工作浪費，提高生殖效率。

3.1 花粉活力研究

花粉活力的高低直接影響生殖的效率和成功率，是人工授粉、輻射誘變和花粉培養(yǎng)的必要條件，在使用花粉前應進行測定［26］。目前，花粉活力的測定一般用染色鑒定法和離體萌發(fā)測定法。

3.1.1 花粉活力測定方法

3.1.1.1 染色鑒定法

染色有三種染色方法：醋酸洋紅、碘-碘化鉀（I2-KI）、2，3，5-三苯基氯化四氮唑法（2，3，5-triphe?nylte-trazolium chloride，TTC），TTC 是測定花粉的活力和壽命最常用的方法。具體方法是：將同一朵花不同時間和同一植株的不同花朵在同一時間散出的花粉撒在載玻片上，滴加含有0.5%TTC 的蔗糖溶液，迅速蓋上蓋玻片，放在平板上，內有濕濾紙，將平板置于37℃黑暗中2 h。對蓋玻片中心觀察到的所有花粉中紅色花粉的比例的3～5 個視野進行計數［27］。TTC 法的優(yōu)點是檢測速度較快，但在測定過程中出現過渡色，顏色鑒別有困難，測定結果往往偏高。

3.1.1.2 離體萌發(fā)測定法

離體萌發(fā)測定法對所有貯藏花粉或新鮮花粉都適宜，并能測出相對萌發(fā)率，花粉萌發(fā)率直接關系到植物生殖能力及價值［28］。離體萌發(fā)測定法需要特定的培養(yǎng)基來培養(yǎng)花粉，常用的培養(yǎng)基有液體和固體兩種，其中液體培養(yǎng)分離法最為方便。在恒定的培養(yǎng)條件和溫度控制下，可以通過離體培養(yǎng)時的發(fā)芽率來測定花粉的成活率，這種方法的優(yōu)點是簡單、快速、合理，完全可以定量［29］。但花粉發(fā)芽條件如養(yǎng)分、溫度和培養(yǎng)時間以及礦物質元素等對離體萌發(fā)法測定花粉成活率有很大影響［30］。

3.1.2 花粉培養(yǎng)條件

蔗糖是大多數植物花粉培養(yǎng)物的重要成分，因為它能為花粉發(fā)芽和花粉管生長提供營養(yǎng)，還能維持外界環(huán)境中恒定的滲透壓，不同品種的牡丹對蔗糖濃度有不同的需求［31-32］。黃牡丹［33］（Paeonia dela?vayiFranch.）花粉萌發(fā)所需蔗糖濃度為80～140 g/L。矮牡丹［34］花粉萌發(fā)所需蔗糖濃度為80 g/L。蓋偉玲［35］研究了魯荷紅牡丹（Paeonia suffruticosacv.Luhehong）、楊山牡丹（Paeoniaostii.）、卵葉牡丹（P.qi?ui）、紫斑牡丹（P.rokki）4 個牡丹品種的花粉萌發(fā)情況，發(fā)現當蔗糖濃度增加時，4 個牡丹品種的花粉表現出先上升后下降的趨勢，當蔗糖濃度為100 g/L時，四種牡丹萌發(fā)率最高。

硼酸是牡丹花粉萌發(fā)的必要條件，它對花器官的形態(tài)結構、花粉發(fā)芽、花粉管的生長和受精有很大的影響，缺硼會導致開花不受精。硼酸作用于質膜上的Ca2+通道，使Ca2+進入細胞，增加細胞內游離Ca2+的濃度，啟動花粉萌發(fā)［36］。牡丹所需要的硼酸質量濃度一般在30～80 mg/L。鈣是雌蕊中花粉管生長的必要條件，也是通過化合反應促進花粉管的生長。鈣是花粉萌發(fā)和花粉管生長最重要的信號，在花粉萌發(fā)過程中，鈣可以代替群體效應。離體花粉的培養(yǎng)基中必須有Ca2+，并且鈣的濃度一定要適當，當鈣濃度較低或培養(yǎng)基中沒有鈣時，花粉管末端可能會膨脹斷裂，當鈣濃度較高時，花粉管停止生長［37］。牡丹花粉萌發(fā)所需Ca2+質量濃度為20 mg/L 時與蔗糖、硼酸兩兩組合后對萌發(fā)率有非常顯著的影響。

3.2 花粉胚株比（Pollen-Ovule Ratio，P/O）

花粉-胚珠比率（P/O）是用每朵花的估計花粉量數除以每朵花的胚珠數來確定的。Cruden 通過研究認為P/O值可以指示植物的繁育系統，因為P/O值反映的是大量花粉都能到達柱頭所形成最高結實率，P/O 值越低，花粉傳遞越有效［38］。平均花粉量通常采用在光學顯微鏡下用血球計數器來計算［39］。胚珠數是統計植株結實率的重要指標之一，常用的方法是直接觀察法，即用解剖刀和鑷子等打開子房，在解剖鏡下觀察胚珠個數。

3.3 柱頭可授期

柱頭可授期是花朵成熟的重要時期，也是人工授粉的重要參考指標［40］。柱頭可授性通過聯苯胺-過氧化氫法測定，即在牡丹開花期旺盛時，每天中午采開花后不同天數的花朵，將其柱頭浸入含有聯苯胺-過氧化氫反應液凹面載片中（1%聯苯胺：3%過氧化氫：水=4：11：22）的凹陷處，如果柱頭可育，則柱頭周圍的反應液為藍色，并出現大量氣泡［41］。根據李奎等［42］研究發(fā)現，滇牡丹開花后第一天至第三天的授粉率超過70%以上，但授粉率在開花后四天急劇下降，柱頭變黑變硬后失去了產生花粉的能力。楊勇等［43］對四川牡丹的柱頭進行了可授性測定，發(fā)現四川牡丹柱頭可授性持續(xù)了9 d，在開花的第5～8 d最強。

3.4 訪花昆蟲

蟲媒植物利用花蜜、花粉、顏色和氣味等花卉特性的綜合作用，吸引開花昆蟲到其花上傳粉，不同植物的花吸引不同類型的昆蟲，有時形成特定的傳粉關系［44］。以昆蟲為媒介的植物必須依靠傳粉昆蟲來完成卵受精過程，這種植物的開花生物學對昆蟲的活動規(guī)律和花粉傳遞有重要作用，同時昆蟲的行為對植物的成功繁殖起著至關重要的作用［45］。

牡丹是典型的蟲媒植物，主要的傳粉昆蟲是蜂類、甲蟲類和蠅類。雖然許多昆蟲都能為農作物授粉，如雙翅目的蠅類、鱗翅目的蝶類和鱗翅目的蝶類等［46］。但膜翅目昆蟲以其獨特的形態(tài)結構和生物學特性，是最主要的傳粉昆蟲［47］。羅毅波等［48］連續(xù)兩年對山西省三個矮牡丹居群進行了實地觀察，發(fā)現共有5 種蜂和4 種甲蟲參與矮牡丹的傳粉。通過電鏡觀察和人工控制昆蟲傳粉試驗證明蜂類，特別是地蜂類是矮牡丹的主要傳粉者，而甲蟲只是不穩(wěn)定的傳粉者。

表2 已發(fā)表的常見牡丹傳粉昆蟲Table 2 Common pollinators of Peony published in journals

3.5 繁育系統檢測

繁育系統的檢測是傳粉生物學中不可缺少的一部分，一般是采用套袋和人工授粉等方式［49］。李奎等［50］人研究滇牡丹的繁育系統，發(fā)現滇牡丹是異花授粉植物。為了提高滇牡丹結實率，可以在特殊天氣條件下使用人工授粉，也可在花期人工放蜂，增加訪花者數量來提高傳粉力度。種子的結實主要取決于傳粉昆蟲的活動，通過異花傳粉攜帶的異質基因可以進一步增強后代的變異性和適應性。羅毅波等人對矮牡丹的試驗結果表明，居群間人工雜交和自然授粉的結實情況在“永濟Ⅰ”居群中基本相似，但在“稷山Ⅱ”居群中，則居群間人工雜交的結實情況遠好于自然授粉的結果。在居群間人工雜交情況下“永濟Ⅰ”和“稷山Ⅱ”居群的結實情況則基本一致［48］。所以，研究者們認為‘矮牡丹’的結實情況存在一定預知情況，在這個預知情況的范圍內，隨著傳粉過程的改變，結實情況會有所好轉。

4 牡丹種子生物學特性

種子是植物的主要生殖器官，是種群延續(xù)的重要紐帶，也是長期保存種質資源的理想材料［51］。種子特征包括形態(tài)和生理兩個方面，其中，種子微形態(tài)不易受環(huán)境影響，具有一定的穩(wěn)定性［52-53］。

4.1 牡丹種子的形態(tài)結構和結實特性

牡丹的果實為蓇葖果，呈紡錘形、橢圓形、瓶形等；有光滑或細密的絨毛。2～8 枚離生，由單心皮構成，子房1室，內含種子多粒，黑色或黑褐色，呈圓形、長圓形或尖圓形。不同品種的種子大小、色澤等也不同［54］。牡丹種子由種皮、胚、胚乳三部分構成［55］，由于牡丹結實率較高，種子在果實中分布不均勻，相鄰種之間相互擠壓，形成不規(guī)則的種子形狀。牡丹種子的胚一般為匙形，發(fā)育不完全，因此需要在種子成熟后進一步發(fā)育［56］。種胚僅占新鮮成熟種子的一小部分，其余大部分為胚乳［57］。

牡丹的蓇葖果五角，每個果角結籽7～13 粒，表皮初為綠色且多毛，成熟時變?yōu)樾伏S色，種籽為黃綠色，成熟時果角干枯，種籽為黑褐色，千粒重約400 g，但種籽僅有部分可育性［58］。

4.2 牡丹種子休眠及萌發(fā)特性

牡丹繁殖可分為種子繁殖和無性繁殖兩種［59］。種子繁殖系數大，可以在短期內獲得大量苗木，但實生苗變異大，不易保持母本的優(yōu)良性狀。因此種子繁殖常用于藥用牡丹、新品種的選育。種子萌發(fā)則是種子繁殖的關鍵環(huán)節(jié)，種子萌發(fā)成苗的質量和周期直接影響牡丹種苗的產量和效益。因此，關于牡丹種子的休眠和萌發(fā)的相關研究引起了人們廣泛關注［60］。牡丹種子的休眠特性包括胚根（下胚軸）和胚芽（上胚軸）的休眠，其中上胚軸的休眠更為明顯［61］。種子萌發(fā)過程呈現出階段性變化，需要相應的溫度變化過程，不過不同種類之間，不同種類的種子萌發(fā)階段所需的溫度和時期的長短不一［62］。

4.2.1 種子休眠原因

種皮受損是影響植物種子休眠的因素之一，但是否是造成種子休眠的主要原因，各植物的情況不同。牡丹種子種皮較硬，木質化程度高，嚴重影響了種子的吸水速度和種子的透氣性，不利于種子萌發(fā)［63］。

牡丹種子中存在的發(fā)芽抑制物質是導致種子休眠的重要原因。宋會興［64］在四川牡丹種子提取出了抑制萌發(fā)的物質，能夠抑制油菜種子萌發(fā)，這是四川牡丹種子休眠的重要原因。郭麗萍等［65］發(fā)現鳳丹和紫斑牡丹的種子種皮和胚乳中存在較強的抑制物質，能夠抑制白菜種子萌發(fā)和自身種子的萌發(fā)。

牡丹果實成熟后，種子胚芽發(fā)育不完全，并處于一定程度的生理休眠狀態(tài)，必須在一定條件下完成形態(tài)及生理后熟才能萌發(fā)，種胚形態(tài)及生理發(fā)育不成熟也是導致牡丹種子休眠的重要因素［66］。

4.2.2 種子休眠的破除

目前對牡丹種子休眠解除方法的研究主要從溫度、外源激素、種皮結構等方面入手。關于溫度，主要研究了層積積溫和低溫春化兩種最有效的溫度。溫度對牡丹種子的萌發(fā)及胚伸長起著明顯的作用，不同的牡丹品種對層積的溫度要求不同。馬宏等［67］對大花黃牡丹種子休眠解除研究表明溫度對大花黃牡丹種子萌發(fā)有顯著影響，在溫度低于10℃和高于25℃時生長的種子不發(fā)芽，解除種子休眠的最佳溫度為15～20℃。根據鄭相穆等［68］人對‘鳳丹’種子的觀察，‘鳳丹’種子需要經歷25℃暖溫長根階段和5℃低溫春化長芽階段。

植物激素對牡丹種子萌發(fā)的主要影響是赤霉素（Gibberellin A3，GA3）的使用，種子生根后，低溫和GA3處理均能有效地解除上胚軸休眠，促進芽的形成。外源激素可以通過改變內源激素的含量而調節(jié)種子休眠與萌發(fā)。范丙友等［69］研究發(fā)現用200 mg/LGA3處理已生根鳳丹種子，能有效打破鳳丹種子的上胚軸休眠，從而使其發(fā)芽率達90.1%。婁方芳等［70］用 200 mg/LGA3溶液浸泡 24 h 處理過的已生根種子，放置在15℃條件下，不僅發(fā)芽時間縮短，而且發(fā)芽率也明顯提高。

根據劉敏淑、王蓮英等［8］人所述，種皮的透水和透氣性是影響種子萌發(fā)的重要因素，并提出在濃硫酸中浸泡2～3 min，或在95%的酒精中浸泡30 min，均可軟化種皮并促進萌發(fā)。然而，景新明等［71］人認為，使用化學或物理方法來處理牡丹種皮，對種子休眠的打破效果并不顯著，反而會引起霉菌侵染。郭麗萍等［72］研究中發(fā)現鳳丹種皮對種子的吸水率有一定的影響，而當吸水率達到吸水飽和時則沒有影響。種皮的通透性不是牡丹休眠的主要原因，但是木質化的種皮可能會對種子萌發(fā)造成一定的機械阻力。

4.3 牡丹種子的采收及貯藏

牡丹種子從8月初到9月中旬成熟，而5年生以上的牡丹種子相對飽滿，發(fā)芽率高。種子的成熟有早有晚，應分階段和分批收獲，如果采收時間過早，種子將不成熟，如果采收時間過晚，則種皮將變黑發(fā)硬不易出苗［73］。當果實的角呈蟹黃色時，將果實摘下并放在屋內涼爽潮濕的地面上，讓果殼中的種子成熟。每天翻動1次，以防止底部變熱，并且防止外部干燥和硬化。種子從果殼中黃綠色變?yōu)楹稚僮優(yōu)楹谏?0～15 d后，大多數果皮逐漸破裂并釋放出種子。此時，不需將果皮與種子分離，并保存在其原始位置以備后用，嚴禁將它曝曬在陽光底下使種皮變硬，等到種植前1 d再將種子揀出［74］。

將晾干的種子放在干凈的河沙上，以1：3 的比例混合，將溫度控制在1～10℃，濕度控制在60%左右（用手將河沙捏成團，松開不散，手掌濕潤，但不見水滴時的濕度），貯藏4 個月。在貯藏期間，應翻動2～3次，同時注意通風和保濕［75］。

5 總結與展望

牡丹是典型的蟲媒植物，為了提高牡丹結實率，我們可以在牡丹花期通過人工釋放蜂增加訪花者數量來提高傳粉力度或相應地降低居群內其他植物的郁閉度，并在一定的天氣條件下（如陰天或雨天）采用人工授粉，為后代環(huán)境變化的適應性創(chuàng)造條件，促進牡丹活株的形成。種子是植物的主要生殖器官，牡丹的品種培育通常采用種子繁殖，而種子萌發(fā)是種子繁殖的關鍵。大多數牡丹都有上胚軸形態(tài)生理休眠的特性［63］，種胚分化但未完全發(fā)育，在胚根突破種皮之前，種胚必須達到一定的長度。因此，牡丹種子的萌發(fā)需經歷暖層積打破種胚的形態(tài)休眠和胚根的生理休眠。GA3和低溫處理均可有效打破牡丹種子的上胚軸休眠，可以促進牡丹種子的發(fā)芽，縮短牡丹實生苗的成苗時間，進而提高牡丹的結實率［76］。

隨著時代的進步，對牡丹觀賞性狀及適應能力均提出了更高的要求。這就需要不斷地培育新優(yōu)品種以滿足人們日益增長的需求。近年來，由于缺乏對牡丹資源的保護和非本地區(qū)的盲目移植，以及開花和種子結實率低，導致牡丹品種急劇下降。為此研究牡丹的開花物候、花粉活力、繁育系統特征、種子的休眠與萌發(fā)特性尤為重要。對牡丹生殖生物學的詳細研究不僅為牡丹優(yōu)質高產的栽培提供了理論依據，也為牡丹優(yōu)質高產品種的培育提供了參考。