從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析三七-馬齒莧藥對(duì)配伍治療潰瘍性結(jié)腸炎的效用機(jī)制研究

陳思羽，唐 昂，張 濤，黃李冰雪，劉 暢

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530000)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)作為消化科的疑難病，其發(fā)病率最近10年呈上升趨勢(shì)，尤其是在中國的發(fā)病率增高最為明顯，因UC病因未明，臨床尚缺乏難以根治的手段而降低患者的生活質(zhì)量，增加醫(yī)療負(fù)擔(dān)[1-3]。中醫(yī)學(xué)雖無UC的病名，但是根據(jù)其癥狀將其歸屬于“休息痢”“久痢”范疇，其基本病機(jī)以脾胃虛弱為本、濕熱瘀毒為標(biāo)而貫穿疾病始終，治療上當(dāng)遵守“發(fā)時(shí)治標(biāo)，平時(shí)治本”的基本原則，可以健脾清熱活血為基本大法進(jìn)行治療，健脾清熱活血方是基于全國名老中醫(yī)勞紹賢教授驗(yàn)方潰結(jié)靈、謝建群教授驗(yàn)方清腸栓等基礎(chǔ)上加減而成，該方具有健脾利濕、清熱解毒、活血定痛的功效。無論臨床研究或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均證實(shí)健脾清熱活血方可能通過誘導(dǎo)炎癥緩解，修復(fù)腸道黏膜，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞修復(fù)，發(fā)揮防治 UC的效用[4-5]。其中三七和馬齒莧是健脾清熱活血方中的主要藥物配對(duì)，具有清熱利濕、化瘀止痛的功效；現(xiàn)代藥理學(xué)研究也表明三七和馬齒莧具有止血活血雙向調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化的作用，并參與各種免疫調(diào)節(jié)[6]。由此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從分子水平分析三七-馬齒莧的有效化學(xué)成分，預(yù)測(cè)其作用靶點(diǎn)及相關(guān)信號(hào)通路，探究三七-馬齒莧配伍治療UC的分子作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1UC相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 在Gene Expression Omnibus(GEO)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)中挖掘mRNA高通量RNA測(cè)序和微陣列圖譜，收集UC患者的差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)。mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)采用log2算法進(jìn)行歸一化和變換，用Fold change(FC)法檢測(cè)UC組和正常組mRNAs的差異表達(dá)。如果|logFC|>1且adj.PValue< 0.05，則將mRNA標(biāo)記為差異表達(dá)基因。同時(shí)利用R語言繪制差異表達(dá)基因熱圖和火山圖。

1.2三七-馬齒莧有效化合物及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的篩選利用TCMSP平臺(tái)(中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)，http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索三七、馬齒莧的主要化學(xué)成分，以ADME性質(zhì)[7]：口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(Drug-likeness，DL)≥0.18為依據(jù)篩選可能入血的有效成分，并進(jìn)行整理；并通過DrugBank數(shù)據(jù)庫篩選出化合物對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，進(jìn)行整理并刪除重復(fù)項(xiàng)。

1.3“化合物-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)及PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建利用Perl語言獲得UC差異表達(dá)基因與三七-馬齒莧對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)基因的交集靶點(diǎn)。將三七-馬齒莧有效化合物與其對(duì)應(yīng)交集靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件(http://www.cytoscape.org/)構(gòu)建“化合物-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖并進(jìn)行拓?fù)浞治觥Ｍ瑫r(shí)將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)進(jìn)行分析得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)Degree值和Betweenness Centrality篩選核心作用靶點(diǎn)。

1.4基因本體論及KEGG通路分析 利用R軟件包“clusterProfiler”“org.Hs.eg.db”“enrichplot”和“ggplot2”對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO)功能分析，包括生物過程(Biological Process,BP)、分子功能(Molecular Function,MF)和細(xì)胞成分(Cellular Component,CC)分析；同時(shí)進(jìn)行基因組百科全書(KEGG)通路富集分析，得到三七-馬齒莧作用于UC的主要通路，并通過R語言對(duì)富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.5交集靶點(diǎn)-KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將得到三七-馬齒莧作用于UC的主要通路與對(duì)應(yīng)交集靶點(diǎn)文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“交集靶點(diǎn)-KEGG”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖并進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1UC差異表達(dá)基因的確定 從GEO數(shù)據(jù)庫下載符合要求的GSE38713數(shù)據(jù)集，并利用R軟件包“l(fā)imma”對(duì)其進(jìn)行分析。GSE38713數(shù)據(jù)集包含13個(gè)正常樣本和30個(gè)UC患者樣本。根據(jù)FC分析(篩選條件|logFC|>1且adj.PValue< 0.05)得到568個(gè)差異表達(dá)基因，其中305個(gè)表達(dá)上調(diào)，263個(gè)表達(dá)下調(diào)，見圖1；分別取前20個(gè)基因進(jìn)行熱圖繪制，見圖2。

圖1 潰瘍性結(jié)腸炎GSE38713差異表達(dá)基因火山圖

圖2 潰瘍性結(jié)腸炎GSE38713差異表達(dá)基因FC分析熱圖

2.2三七-馬齒莧的有效化合物收集及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)在TCMSP平臺(tái)以三七、馬齒莧為關(guān)鍵詞，共搜索到173個(gè)相關(guān)化合物。根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)和代謝(ADME)特性對(duì)化合物進(jìn)行篩選，以O(shè)B≥30%及DL≥0.18為篩選條件，篩得三七化合物8個(gè)、馬齒莧化合物10個(gè)共18個(gè)化合物，去重后共得到16個(gè)有效化合物，見表1。應(yīng)用DrugBank數(shù)據(jù)庫收集并篩選這16個(gè)有效化合物對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，整理全部靶點(diǎn)并刪除重復(fù)項(xiàng)。

表1 三七-馬齒莧16個(gè)有效化合物信息表

2.3“化合物-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建及拓?fù)浞治?應(yīng)用Perl語言分析獲得UC差異表達(dá)基因與三七-馬齒莧對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)基因的交集靶點(diǎn)共64個(gè)，與交集靶點(diǎn)相互作用的有效化合物14個(gè)。將這14個(gè)有效化合物與交集靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“化合物-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，見圖3。該網(wǎng)絡(luò)圖由78個(gè)節(jié)點(diǎn)(14個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)和64個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn))和121條邊組成，其中三角形代表靶點(diǎn)、橢圓形代表化合物，且紅色橢圓形化合物節(jié)點(diǎn)表示三七與馬齒莧共同化合物。圖中三七-馬齒莧多個(gè)化合物對(duì)應(yīng)相同靶點(diǎn)、多個(gè)靶點(diǎn)同時(shí)也對(duì)應(yīng)相同化合物，由此可見三七-馬齒莧配伍多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。接著，利用Cytoscape中的Network Analysis插件進(jìn)一步進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的Degree和Betweenness Centrality大小篩選出該網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵化合物(槲皮素、花生四烯酸、豆甾醇、山奈酚、木犀草素)及核心靶點(diǎn)(PTGS1、NCOA2、JUN、ALOX5、RXRA、IL1B、PPARG、MMP1、CHRM3)，認(rèn)為這些化合物及靶點(diǎn)在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中起到核心作用。

圖3 三七-馬齒莧有效化合物-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4三七-馬齒莧配伍治療UC作用靶點(diǎn)的PPI分析 將64個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，設(shè)置置信度大于0.150，得到圖4A。接著設(shè)置置信度大于0.400，提取圖4A網(wǎng)絡(luò)中關(guān)聯(lián)系數(shù)更緊密的網(wǎng)絡(luò)，得到圖4B。為了更深層次的提取圖4A網(wǎng)絡(luò)圖中的核心網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步設(shè)置置信度大于0.900，并剔除孤立的靶點(diǎn)蛋白，最終獲得核心蛋白互作信息圖4C。并導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析得到三七-馬齒莧配伍治療UC的核心靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(見圖4D)。圖4D網(wǎng)絡(luò)由42個(gè)節(jié)點(diǎn)和53邊組成，經(jīng)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析可知，節(jié)點(diǎn)平均Degree為2.523 8，大于平均Degree的節(jié)點(diǎn)有21個(gè)；節(jié)點(diǎn)平均Betweenness Centrality為0.104 9，大于平均Betweenness Centrality的節(jié)點(diǎn)有21個(gè)。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的Degree和Betweenness Centrality篩選出靠前的核心作用靶點(diǎn)，包括JUN、IL1B、RXRA、MMP9、IRF1、CTSD、STAT1、PPARG、NCOA2、CDK1等，認(rèn)為這些核心作用靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中起到關(guān)鍵性作用。

圖4 三七-馬齒莧治療潰瘍性結(jié)腸炎交集靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析

2.5GO功能富集分析及KEGG通路分析 利用R軟件包“clusterProfiler”“org.Hs.eg.db”“enrichplot”和“ggplot2”對(duì)交集靶點(diǎn)對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路分析。根據(jù)PValue.adjust<0.05分別確定了前20個(gè)GO條目，分別列出生物過程、分子功能、細(xì)胞成分對(duì)應(yīng)的條目，見圖5。其中，生物過程中在體液水平調(diào)節(jié)、對(duì)細(xì)菌源分子反應(yīng)、膠原代謝過程、機(jī)械刺激反應(yīng)、脂多糖反應(yīng)、白細(xì)胞遷移、傷口愈合調(diào)控、氧化應(yīng)激反應(yīng)等相關(guān)性最大；細(xì)胞成分中在含膠原蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)、纖維狀膠原蛋白三聯(lián)體、膜筏、膠原三聚體復(fù)合物、核染色體部分、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、灶性粘連、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物等靶點(diǎn)富集相對(duì)集中；分子功能中與肽酶調(diào)節(jié)活性、蛋白酶結(jié)合、蛋白質(zhì)異二聚活性、血小板衍生生長因子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性、直接配體調(diào)節(jié)的序列特異性DNA結(jié)合、類固醇激素受體活性、生長因子結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ近端啟動(dòng)子序列特異性DNA結(jié)合等相關(guān)性最大。通過KEGG通路富集分析三七-馬齒莧配伍治療UC作用靶點(diǎn)的通路分布，見圖6。KEGG富集最為顯著的20條通路主要包括：AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、TNF signaling pathway、Fluid shear stress and atherosclerosis、IL-17 signaling pathway、Amoebiasis、Pertussis、Malaria、Complement and coagulation cascades、Relaxin signaling pathway、Rheumatoid arthritis、NF-kB signaling pathway、Proteoglycans in cancer、Toll-like receptor signaling pathway等，涉及腫瘤、代謝、免疫、炎癥等多方面信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

A為生物過程；B為分子功能；C為細(xì)胞成分

圖6 三七-馬齒莧治療潰瘍性結(jié)腸炎交集靶點(diǎn)KEGG通路分析

2.6三七-馬齒莧配伍治療UC作用靶點(diǎn)與KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)分析 將得到的三七-馬齒莧配伍治療UC涉及的主要通路與對(duì)應(yīng)交集靶點(diǎn)文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“交集靶點(diǎn)-KEGG”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖(見圖7)。該網(wǎng)絡(luò)由57個(gè)節(jié)點(diǎn)(37個(gè)交集靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)和20個(gè)通路節(jié)點(diǎn))和131條邊組成，其中三角形代表通路、橢圓形代表交集靶點(diǎn)，且節(jié)點(diǎn)形狀越大表示在該網(wǎng)絡(luò)中所占權(quán)重越大。由圖可知，IL1B、JUN、MMP9基因和AGE-RAGE信號(hào)通路(hsa04933)、TNF信號(hào)通路(hsa04668)、癌癥中的蛋白多糖通路(hsa05205)、IL-17信號(hào)通路(hsa04657)在該網(wǎng)絡(luò)中起到核心調(diào)控作用。

圖7 三七-馬齒莧治療潰瘍性結(jié)腸炎交集靶點(diǎn)-KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

3 討 論

中醫(yī)藥在治療包括UC在內(nèi)的多種復(fù)雜疾病方面具有療效高、治療成本低、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，在中國已有幾千年的歷史[8]。本研究根據(jù)ADME性質(zhì)進(jìn)行初步篩選，得到16個(gè)有效生物活性成分，然后預(yù)測(cè)了這16個(gè)有效生物活性化合物的64個(gè)交集靶點(diǎn)。進(jìn)一步GO功能富集分析表明，這些靶點(diǎn)與炎癥和免疫相關(guān)的生物學(xué)過程密切相關(guān)，并建立了化合物-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)、PPI網(wǎng)絡(luò)、靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)和功能模塊網(wǎng)絡(luò)。這些網(wǎng)絡(luò)均提示，三七-馬齒莧配伍治療UC的機(jī)制可能通過多分子、多途徑協(xié)同相加作用，發(fā)揮免疫和炎癥效應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。

本研究篩選出的16個(gè)有效化學(xué)成分大多數(shù)具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。例如：槲皮素可以抑制脂多糖誘導(dǎo)的白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和IL-8的產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗炎作用[9]。相關(guān)研究表明，花生四烯酸是一種多不飽和脂肪酸，通過其衍生的二十烷基類化合物代表細(xì)胞膜中脂質(zhì)含量的主要成分，被認(rèn)為是多種疾病炎癥反應(yīng)和發(fā)病機(jī)制中不可或缺的介質(zhì)[10]。有關(guān)山萘酚的研究顯示，其可顯著降低脂多糖誘導(dǎo)的TNF-α、IL-1β、IL-6、細(xì)胞間黏附分子-1和血管細(xì)胞黏附分子-1的過度產(chǎn)生[11]。此外，豆甾醇和木犀草素都具有顯著的抗炎活性[12-13]。

接著利用64個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的Degree和Betweenness Centrality篩選出10個(gè)Degree大于平均數(shù)的靶點(diǎn)，包括JUN、IL1B、RXRA、MMP9、PPARG、IRF1、CTSD、STAT1、NCOA2、CDK1。其中，IL1B可通過促進(jìn)T細(xì)胞的活化和增殖來誘導(dǎo)T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性炎癥，并能同時(shí)促進(jìn)其他炎性細(xì)胞因子的表達(dá)及中性粒細(xì)胞浸潤[14]。另外，在JNK途徑中JUN可被TNF-α激活，從而在腸炎的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[15]。PPARG也被證實(shí)能夠下調(diào)促炎細(xì)胞因子如IL-4、IL-5和IL-6的產(chǎn)生。Vetuschi等[16]報(bào)道，PPARG還可以干擾促纖維化分子的生成，如血小板衍生生長因子、IL-1和轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)。這些結(jié)果均提示三七-馬齒莧配伍可能通過調(diào)節(jié)抗炎作用和免疫系統(tǒng)來發(fā)揮防治UC的作用。

隨后，本研究對(duì)64個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果表明64個(gè)目標(biāo)可以進(jìn)一步映射到29條通路。進(jìn)一步的交集靶點(diǎn)與KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)分析提示，三七-馬齒莧配伍治療UC的機(jī)制與“IL-17信號(hào)通路”和“TNF信號(hào)通路”密切相關(guān)，且這兩條通路均參與免疫和炎癥反應(yīng)。IL-17信號(hào)通路作為腸炎發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵介質(zhì)受到廣泛關(guān)注。IL-17是一種強(qiáng)有力的炎癥性白細(xì)胞介素，能激活其他促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。IL-17主要由輔助性T細(xì)胞(Th17細(xì)胞)和其他來源產(chǎn)生，包括自然殺傷細(xì)胞、肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞[17]。據(jù)報(bào)道顯示，炎性腸病患者外周血單核細(xì)胞IL-17水平與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[18]。TNF信號(hào)通路通過對(duì)腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞毒作用改變腸屏障功能，并通過CD14+巨噬細(xì)胞共同刺激和激活固有層T淋巴細(xì)胞(CD14+細(xì)胞膜結(jié)合的TNF與固有層T細(xì)胞上的TNFR2相互作用)來調(diào)節(jié)腸道炎癥[19]。目前，TNF-α抑制劑是治療UC的有效抗炎生物制劑[20]。綜上，三七-馬齒莧配伍可能通過靶向這些抗炎和免疫調(diào)節(jié)途徑來抑制UC的進(jìn)展。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。