嵌有非天然氨基酸蛋白質(zhì)的生物合成及其純化鑒定

馬韓軻， 李閏婷， 張麗萌， 張 函， 裴若蘭， 陳肖皖， 陳龍欣

（1.鄭州師范學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450044； 2.鄭州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450044）

蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)中不可或缺的基本組成部分，它具有催化、運(yùn)輸、調(diào)節(jié)、免疫以及構(gòu)成生物體等多種功能. 絕大多數(shù)蛋白質(zhì)是由二十種天然氨基酸構(gòu)成，為了進(jìn)一步拓展蛋白質(zhì)的功能，研究人員開始逐漸將視角轉(zhuǎn)到可控和易操作的天然氨基酸側(cè)鏈衍生物——非天然氨基酸（Unnatural amino acids，UAAs）上［1］. 非天然氨基酸特異性強(qiáng)、對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)擾動(dòng)小、靈敏度高、使用靈活，通過非天然氨基酸對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾，可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的新功能，對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能的理論研究與應(yīng)用帶來了新的契機(jī)［2］. 為了在肽鏈或蛋白質(zhì)中引入攜帶獨(dú)特官能團(tuán)的非天然氨基酸，人們不斷探索多樣的化學(xué)合成方法，但由于蛋白質(zhì)分子量過大，化學(xué)合成往往并不容易，而基于密碼子擴(kuò)展技術(shù)［3］，可以通過簡(jiǎn)單的生物合成，在蛋白質(zhì)中定點(diǎn)引入非天然氨基酸，這無疑為蛋白質(zhì)的生物化學(xué)研究和蛋白質(zhì)操縱提供了全新的技術(shù)手段［4］. 該技術(shù)最初由Scripps研究所的Peter G.Schultz教授團(tuán)隊(duì)建立并推廣［3，5-6］. 它的出現(xiàn)打破了自然界中生物體內(nèi)二十種常見氨基酸的編碼限制，使得在蛋白中擴(kuò)展了更多功能基團(tuán)［7-8］.

目前，基于密碼子擴(kuò)展技術(shù)，利用非天然氨基酸作為重要工具在活細(xì)胞中對(duì)蛋白進(jìn)行了標(biāo)記和研究，比如通過“點(diǎn)擊”化學(xué)修飾可以高效地進(jìn)行蛋白標(biāo)記［9］，通過顯色基團(tuán)可以進(jìn)行光譜分析［10］，通過熒光基團(tuán)可以優(yōu)化超高顯微觀測(cè)［11］等. 近期，利用基因密碼子擴(kuò)展技術(shù)制備復(fù)制缺陷型流感病毒，有望在新型疫苗領(lǐng)域有所突破［12］，甚至在不需要外源供給復(fù)雜的非天然氨基酸的情況下，通過大腸桿菌中半胱氨酸的生物合成途徑“劫持”半胱氨酸合成酶，便可以實(shí)現(xiàn)幾十種新型非天然氨基酸嵌合到重組蛋白中［13］. pBpa（p-苯甲酰-L-苯丙氨酸）是一種在苯丙氨酸側(cè)鏈連接有光敏感基團(tuán)的非天然氨基酸［14-16］，最近，通過光敏型非天然氨基酸pBpa插入蛋白質(zhì)的功能表位，更是拓展了抗體藥物篩選領(lǐng)域［17］.

在本研究中，我們基于基因密碼子擴(kuò)展技術(shù)，將非天然氨基酸pBpa通過生物合成的方式，插入到白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）蛋白質(zhì)的預(yù)設(shè)位點(diǎn)中，能夠較為容易地獲得大量的具有特定功能的非天然氨基酸嵌合體蛋白質(zhì).

1 材料與方法

1.1 材料

pET28a原核表達(dá)載體質(zhì)粒、pEVOL-pBpaRS 質(zhì)粒由鄭州師范學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；非天然氨基酸pBpa購(gòu)自J&K Scientific，貨號(hào)204322（CAS104504-45-2）；大腸桿菌BL21（DE3）和DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞以及質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；DNA Maker購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)Marker購(gòu)自Thermo Fisher Scientific；IPTG、阿拉伯糖購(gòu)自AMERSCO公司；膠回收試劑盒購(gòu)自ZOMANBIO公司.

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)工程菌的構(gòu)建 在編碼的IL-1β第5個(gè)氨基酸精氨酸的質(zhì)粒編碼位點(diǎn)CGG突變?yōu)殓昝艽a子堿基TAG（在本研究中TAG 編碼pBpa），將IL-1β突變基因進(jìn)行人工合成（蘇州金唯智生物科技有限公司），合成后的基因連接到pET28a載體中，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有卡那霉素（50 μg/mL）的2×YT固體培養(yǎng)基（16 g/L胰蛋白胨，10 g/L酵母浸粉，5 g/L氯化鈉，15 g/L瓊脂）的平皿中，37 ℃過夜倒置培養(yǎng)，挑取多個(gè)單克隆測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序正確的克隆質(zhì)粒命名為pET28a-IL-1β-R5TAG，小量提取質(zhì)粒備用.

將pEVOL-pBpaRS 載體［18］（含有編碼正交的RNA 合成酶和tRNA 正交對(duì)的元件，能將非天然氨基酸pBpa 氨?；\(yùn)載于tRNA 上［19-20］），以及產(chǎn)生R5 位點(diǎn)突變的IL-1β質(zhì)粒pET28a-IL-1β-R5TAG 共同轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有卡那霉素（50 μg/mL）和氯霉素（15 μg/mL）雙抗性的2×YT 固體培養(yǎng)基平皿上，37 ℃過夜倒置培養(yǎng)，單克隆便為能夠生物合成嵌合有非天然氨基酸pBpa突變體蛋白質(zhì)的工程表達(dá)菌株.

1.2.2 非天然氨基酸嵌合蛋白的表達(dá) 用含有卡那霉素和氯霉素雙抗性的2×YT液體培養(yǎng)基（不含瓊脂）復(fù)壯工程表達(dá)菌株，將其培養(yǎng)至菌的吸光度OD600約為0.6后，加入0.22 μm除菌的質(zhì)量體積比為0.2%的阿拉伯糖、1 mM pBpa以及0.5 mM IPTG，37 ℃250 r/min振蕩培養(yǎng)5 h形成嵌合蛋白的可溶性表達(dá)，5000×g離心收集菌體沉淀，而后沉淀懸溶于PBS緩沖液中，冰上超聲破碎（超聲5 s停7 s）20 min，10 000×g離心收集超聲破碎后的上清溶液，上清便含有R5pBpa的嵌合蛋白. 同時(shí)，表達(dá)時(shí)設(shè)置不加入非天然氨基酸pBpa的培養(yǎng)物作為陰性對(duì)照. 最后，SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)鑒定嵌合蛋白的表達(dá).

1.2.3 非天然氨基酸嵌合蛋白的純化 將超聲破碎的上清分多次加入Ni-NTA 純化介質(zhì)柱中（金斯瑞生物

科技有限公司L00250-C），20倍柱體積的洗滌緩沖液（含有20 mM咪唑的PBS溶液）洗滌純化介質(zhì)柱，最后用250 mM的洗脫緩沖液（含有250 mM咪唑的PBS溶液）洗脫純化介質(zhì)柱中的嵌合蛋白R(shí)5pBpa. 為了進(jìn)一步純化嵌合蛋白，將其通過AKTA蛋白純化儀的Superdex75 Increase 10/300 GL分子篩按照1 min/mL的流速進(jìn)行精細(xì)純化，收集8～15 mL上的主峰流出液，SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)鑒定純化質(zhì)量.

1.2.4 非天然氨基酸嵌合蛋白的質(zhì)譜鑒定 在安捷倫6530 電噴霧四極飛行時(shí)間質(zhì)譜儀前端串聯(lián)安捷倫1290 高效液相色譜儀，將10 μL 1 μg/μL 的精細(xì)純化的嵌合蛋白通過高效液相色譜儀裝載到反相柱（300SB-C8，2.1 mm×50 mm，3.5 μm顆粒）上，然后在流速為0.2 mL/min 的梯度相上洗脫分離后，進(jìn)入電噴霧電離在線引入ESI-Q-TOF質(zhì)譜［17］. 最后收集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過安捷倫公司的MassHunter BioConfirm軟件按照其工作流程進(jìn)行分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 嵌合蛋白的表達(dá)

工程菌具有兩種抗性，說明雙質(zhì)粒工程菌成功構(gòu)建. 表達(dá)R5pBpa嵌合蛋白的工程菌經(jīng)IPTG及阿拉伯糖的共同誘導(dǎo)，在有和無非天然氨基酸pBpa兩種情況下，表達(dá)5 h 后，通過SDS-PAGE 實(shí)驗(yàn)對(duì)全菌體進(jìn)行檢測(cè)，如圖1 所示，在加入pBpa 的樣品中，15～25 kDa 處有明顯條帶，而未加入pBpa 樣品中沒有發(fā)現(xiàn)明顯條帶，符合嵌合蛋白約19 kDa的理論分子量. 因此，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的雙質(zhì)粒工程菌在非天然氨基酸存在的條件下，能夠表達(dá)R5pBpa嵌合蛋白.

圖1 全菌體的SDS-PAGE結(jié)果及其R5pBpa嵌合蛋白的模擬圖Fig.1 SDS-PAGE results of whole cell and the pattern of chimeric protein R5pBpa

2.2 嵌合蛋白的純化

含有His標(biāo)簽的IL-1β的R5pBpa嵌合蛋白通過Ni-NTA 純化介質(zhì)初步純化后，獲得一定純度的R5pBpa，如圖2 中的1 泳道，工程菌表達(dá)R5pBpa 的產(chǎn)量約為30 mg/L. 為了進(jìn)一步提高純度，用于后期的精密實(shí)驗(yàn)，根據(jù)蛋白的大小利用分子篩進(jìn)行了精細(xì)純化，收集峰中的蛋白溶液，如圖2 所示，蛋白的主峰出現(xiàn)在出峰體積為12.5～15 mL 處，符合分子量約為19 kDa 的出峰時(shí)間，將主峰收集的5 管蛋白溶液依次SDS-PAGE上樣，如圖2的2～6泳道. 主峰中獲得了相當(dāng)高純度的非天然氨基酸pBpa嵌合IL-1β蛋白R(shí)5pBpa.

圖2 分子篩精細(xì)純化峰圖及其對(duì)應(yīng)的SDS-PAGE結(jié)果Fig.2 Purification peak diagram of molecular sieve and its corresponding SDS-PAGE results

2.3 嵌合蛋白精準(zhǔn)分子量的質(zhì)譜鑒定

為了進(jìn)一步確認(rèn)非天然氨基酸pBpa確實(shí)插入到了IL-1β蛋白中，我們對(duì)純化的嵌合蛋白進(jìn)行了精準(zhǔn)分子量ESI-Q-TOF質(zhì)譜鑒定. 相比野生型IL-1β而言，突變體R5pBpa 中的pBpa 非天然氨基酸殘基取代了野生型蛋白的第5 位精氨酸殘基，使得嵌合蛋白分子量比野生型蛋白分子量更大一些. pBpa 取代精氨酸R后兩者相對(duì)分子質(zhì)量之差為95.1 Da，因此在野生型IL-1β分子量（18 809.45 Da）的基礎(chǔ)上加上兩者之差即為R5pBpa的理論分子量，Expected mass=18 904.55 Da，如圖3 所示，實(shí)際測(cè)得的主峰中突變體R5pBpa 分子量為Observed mass=18 905.76 Da，符合理論分子量的數(shù)值，表明通過本實(shí)驗(yàn)可以獲得較為純凈的pBpa嵌合蛋白.

圖3 ESI-Q-TOF質(zhì)譜精準(zhǔn)分子量鑒定結(jié)果Fig.3 Accurate molecular weight identification by ESI-Q-TOF mass spectrometry

3 結(jié)語(yǔ)

目前，越來越多領(lǐng)域都出現(xiàn)了非天然氨基酸的身影，非天然氨基酸由于其特殊性可根據(jù)人們的需求被賦予特定的功能，從而為診斷、疾病的治療等多個(gè)領(lǐng)域提供嶄新思路［21］. 在本研究中，我們只需要將兩個(gè)質(zhì)粒（一個(gè)質(zhì)粒為提供識(shí)別非天然氨基酸pBpa的氨酰-tRNA合成酶/tRNA正交對(duì)的pEVOL-pBpaRS質(zhì)粒，另外一個(gè)質(zhì)粒為在含有編碼目標(biāo)蛋白的基因的特定任意位點(diǎn)上設(shè)置琥珀密碼子供非天然氨基酸的插入）轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)中，便可以簡(jiǎn)單而高效地表達(dá)插入有特定基團(tuán)的非天然氨基酸到蛋白質(zhì)中，在中性條件下，通過常規(guī)的蛋白質(zhì)純化便可以獲得大量純度極高的具有生物活性的蛋白質(zhì). 另外，在研究其他感興趣的蛋白質(zhì)時(shí)，我們也可很容易地改變質(zhì)粒編碼的基因和位點(diǎn)，來實(shí)現(xiàn)pBpa對(duì)其他功能蛋白的嵌入，更進(jìn)一步的，作為研究或應(yīng)用的工具，我們甚至可以較為容易地在pEVOL骨架質(zhì)粒上突變氨酰-tRNA合成酶/tRNA正交對(duì)，實(shí)現(xiàn)其他非天然氨基酸的嵌入.