貴州某廢棄煤礦酸性廢水處理系統(tǒng)中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及功能分析

王 能， 張瑞雪,2*， 吳 攀,2， 張世鴻， 張亞輝

1.貴州大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550025 2.喀斯特地質(zhì)資源與環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550025

煤炭資源開(kāi)采產(chǎn)生的大量煤矸石和圍巖等暴露在空氣和水中，經(jīng)過(guò)復(fù)雜的化學(xué)與生物氧化過(guò)程，極易形成低pH、高硫酸鹽以及Fe、Mn等重金屬的酸性礦山廢水[1]. 酸性礦山廢水任意排放會(huì)對(duì)周?chē)h(huán)境和生態(tài)系統(tǒng)造成長(zhǎng)期損害，其含有的有害金屬離子可在動(dòng)植物體內(nèi)富集，進(jìn)而通過(guò)食物鏈威脅人體健康[2-3].

酸性礦山廢水是一個(gè)全球性環(huán)境污染問(wèn)題[4]. 貴州煤炭資源豐富，且煤中含硫較高，酸性煤礦排水對(duì)區(qū)域水環(huán)境的污染問(wèn)題日益突出[5-6]. 筆者所在課題組根據(jù)貴州廢棄煤礦分布特征和廢水排放特點(diǎn)，因地制宜地開(kāi)發(fā)了系列以碳酸鹽巖為主要反應(yīng)介質(zhì)被動(dòng)處理煤礦酸性廢水的技術(shù)方法，并在多地開(kāi)展工程示范及應(yīng)用，且處理效果顯著[7-8]. 碳酸鹽巖作為煤礦酸性廢水治理的反應(yīng)介質(zhì)，不僅對(duì)廢水中pH提升及Fe去除有很好效果[9]，同時(shí)反應(yīng)體系中形成的鐵氧化物沉積物對(duì)廢水中其他金屬離子有很好的吸附共沉淀作用[10]. 當(dāng)前對(duì)碳酸鹽巖作為反應(yīng)介質(zhì)處理酸性煤礦廢水主要關(guān)注于反應(yīng)過(guò)程中的物理化學(xué)作用[8-12]，而在酸性礦山廢水環(huán)境(水、沉積物和生物膜等[13])中還存在豐富的嗜酸性鐵、硫氧化以及異養(yǎng)的細(xì)菌和古菌[14]，此類(lèi)微生物存在會(huì)對(duì)沉積物-水界面的各種污染物去除和遷移轉(zhuǎn)化等發(fā)揮重要作用[15]. 如在酸性礦山廢水環(huán)境中生存的嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌(A.ferrooxidans)能有效促進(jìn)酸性硫酸鹽體系中Fe2+向Fe3+轉(zhuǎn)化，同時(shí)Fe3+水解生成施氏礦物、黃鐵礬等次生礦物，而此類(lèi)礦物的生物相容性好，且能與金屬元素發(fā)生吸附或者共沉淀作用[16-17].

近年來(lái)，利用16S rRNA高通量測(cè)序和基因組學(xué)方法對(duì)酸性礦山廢水環(huán)境中微生物群落的不斷研究促進(jìn)了人們對(duì)酸性環(huán)境中微生物多樣性、群落功能和進(jìn)化的深入了解[18]. 該研究以貴州某廢棄煤礦酸性廢水處理系統(tǒng)(碳酸鹽巖為主要反應(yīng)介質(zhì))為例，采用高通量測(cè)序MiSeq技術(shù)，分析反應(yīng)系統(tǒng)中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的沿程變化特征，并根據(jù)細(xì)菌群落組成分析其主要功能作用，以期為酸性礦山廢水的生物強(qiáng)化處理技術(shù)與理念方法提供基礎(chǔ)理論支撐.

1 材料與方法

1.1 處理系統(tǒng)概況及樣品采集

貴州某廢棄煤礦酸性廢水處理系統(tǒng)于2017年8月建成運(yùn)行，反應(yīng)系統(tǒng)中填充的碳酸鹽巖為較純的方解石. 處理系統(tǒng)共設(shè)有6組平行，每組由多級(jí)復(fù)氧反應(yīng)池和垂直流人工濕地構(gòu)成，其中多級(jí)復(fù)氧反應(yīng)池分5級(jí)，第1級(jí)為可滲透反應(yīng)墻，其余4級(jí)分別由反應(yīng)池和沉淀池組成；沉淀池中添加立體彈性填料，人工濕地中種植梭魚(yú)草、黃菖蒲和金絲草等植物，工藝流程見(jiàn)圖1. 該處理系統(tǒng)總占地面積 2 160 m2，設(shè)計(jì)處理能力500 m3/d(枯水期約300 m3/d，豐水期約500 m3/d)，進(jìn)水水力負(fù)荷0.32～0.52 m3/(m2·d). 由于該處理系統(tǒng)進(jìn)水自廢棄煤礦硐口地下涌水，其特征污染指標(biāo)主要為pH以及Fe、Mn和其他重金屬，且運(yùn)行前期對(duì)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，進(jìn)水COD (10 mg/L)、TN (0.2 mg/L)和TP (0.1 mg/L)等污染物濃度較低，故該研究并未對(duì)其去除效果及機(jī)理進(jìn)行探討. 系統(tǒng)處理后出水中Fe、Mn濃度可達(dá)《生活飲用水水源水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(CJ 3020—1993)的一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[8].

圖1 貴州某廢棄煤礦酸性廢水處理系統(tǒng)工藝流程Fig.1 Process flow of acid wastewater treatment system of an abandoned coal mine in Guizhou Province

樣品采集于2019年10月，共采集8個(gè)樣品測(cè)定細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，即進(jìn)水沉積物(JSc)、進(jìn)水水(JSs)、反應(yīng)池沉積物(Fc)、反應(yīng)池懸浮物(Fx)、沉淀池1沉積物(C1c)和沉淀池4沉積物(C4c)、濕地沉積物(Sc)和濕地植物根際土壤(St). 反應(yīng)池與沉淀池的沉積物采自彈性填料，濕地系統(tǒng)主要以碳酸鹽巖為反應(yīng)介質(zhì)，在碳酸鹽巖層上添加土壤種植植物，植物根際土壤中混有大量鐵絮體沉積物，采樣點(diǎn)布設(shè)見(jiàn)圖1.

1.2 樣品分析

利用便攜式水質(zhì)參數(shù)儀現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定溫度(T)、pH、DO濃度和ORP等，用于測(cè)定Fe2+的樣品現(xiàn)場(chǎng)用0.45 μm濾膜過(guò)濾，添加緩沖溶液和鄰菲啰啉顯色劑現(xiàn)場(chǎng)顯色. 用于其他理化指標(biāo)測(cè)定的樣品均過(guò)濾到聚乙烯瓶中，測(cè)定金屬的樣品加適量硝酸酸化(pH<2). 用0.22 μm (Millipore, 美國(guó))無(wú)菌微孔濾膜過(guò)濾進(jìn)水水樣，用以收集水樣微生物，將濾膜置于無(wú)菌離心管于干冰盒中低溫(約-20 ℃)保存. 沉積物放入滅菌的自封袋中均勻混合后過(guò)濾掉水，取一定量的沉積物置于無(wú)菌離心管中置于冰盒中. 將樣品帶回實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱，用于16S rRNA擴(kuò)增測(cè)序分析. 取部分沉積物樣品帶回實(shí)驗(yàn)室冷凍干燥后消解測(cè)定金屬含量. Fe和Mn含量用原子吸收測(cè)定(TAS-990, 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，SO42-含量用離子色譜儀(ICS-1100, 美國(guó)Dionex公司)測(cè)定，F(xiàn)e2+含量用鄰菲啰啉分光光度法測(cè)定，Cu、Pb、Zn、As和Cr含量用電感耦合等離子質(zhì)譜儀測(cè)定(ICP-MS, 美國(guó)賽默飛公司).

1.3 DNA提取、PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序

根據(jù)FastDNA? Spin Kit for Soil(MP Biomedicals, 美國(guó))說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總DNA抽提，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量，使用NanoDrop2000(Thermo Fisher,美國(guó))測(cè)定DNA濃度和純度.

使用338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)對(duì)16r RNA基因V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，27個(gè)循環(huán)；然后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min；最后4 ℃ 進(jìn)行保存. PCR(ABI GeneAmp? 9700型PCR儀，美國(guó))反應(yīng)體系：5×TransStart FastPfu 緩沖液4 μL；2.5 mmol/L dNTPs 2 μL；上游引物(5 μmol/L)0.8 μL；下游引物(5 μmol/L)0.8 μL；TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL；模板DNA 10 ng；補(bǔ)足至20 μL. 每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù). 將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, 美國(guó))進(jìn)行回收產(chǎn)物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用QuantusTMFluorometer(Promega, 美國(guó))對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)定量. 使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit進(jìn)行建庫(kù)，利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司).

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Trimmomatic軟件對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控，使用FLASH軟件進(jìn)行拼接，過(guò)濾reads尾部質(zhì)量值20以下的堿基. 設(shè)置50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開(kāi)始截去后端堿基，過(guò)濾質(zhì)控后50 bp以下的reads，去除含N堿基的reads. 使用UPARSE軟件(version 7.1)，根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類(lèi)并剔除嵌合體，利用RDP classifier對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類(lèi)注釋?zhuān)葘?duì)SiIva132/sbacteria數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置比對(duì)閾值為70%. 所有的統(tǒng)計(jì)分析都使用R包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及數(shù)據(jù)可視化，基于樣品最小序列數(shù)抽平后計(jì)算α-多樣性指數(shù)和距離矩陣. 用Canoco 5.0軟件對(duì)細(xì)菌群落物種信息進(jìn)行冗余分析(RDA)，并結(jié)合Pearson相關(guān)系數(shù)評(píng)價(jià)細(xì)菌群落與環(huán)境因子之間的關(guān)系.

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)系統(tǒng)水質(zhì)特征

反應(yīng)系統(tǒng)中各樣品理化參數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1，系統(tǒng)進(jìn)水為弱酸性煤礦廢水(pH為5.85)，廢水中典型污染物Fe(51.36 mg/L)經(jīng)系統(tǒng)處理后去除率接近100%，同時(shí)對(duì)低濃度Mn、As、Pb、Cu和Cr等金屬也有明顯的去除效果. 經(jīng)多級(jí)復(fù)氧反應(yīng)池和人工濕地系統(tǒng)處理后廢水的pH、DO濃度和Eh沿程升高，EC沿程降低. 系統(tǒng)中生成的大量鐵絮體沉積物能富集多種金屬元素，如Fe、Mn、As、Cd和Pb等，其中Fe含量最高，在反應(yīng)池沉積物(Fc)中最高可達(dá)26.74%.

表1 反應(yīng)系統(tǒng)中樣品理化參數(shù)

2.2 反應(yīng)系統(tǒng)中細(xì)菌群落Alpha多樣性分析

通過(guò)Miseq PE300高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)8個(gè)樣品測(cè)序，優(yōu)化序列信息后獲得有效序列數(shù) 472 422 條，有效堿基數(shù)目 195 031 650 bp，序列平均長(zhǎng)度412.84 bp，共獲得 8 917 個(gè)OTUs. 對(duì)原始數(shù)據(jù)質(zhì)控優(yōu)化后，樣品平均序列數(shù)、OTU數(shù)、覆蓋度(Coverage)、細(xì)菌群落豐富度指數(shù)(Chao指數(shù)和ACE指數(shù))和多樣性指數(shù)(Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù))見(jiàn)表2. 樣品間OTU數(shù)存在差異，JSs樣品中OTU數(shù)最高(1 561 個(gè))，F(xiàn)x樣品中OTU數(shù)最低(384個(gè)). 8個(gè)樣品Coverage均在98%以上，表明該研究的測(cè)試深度足夠. 樣品間豐富度指數(shù)(Chao指數(shù)和ACE指數(shù))和多樣性指數(shù)(Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù))存在差異，JSs樣品中細(xì)菌群落豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)高于JSc樣品，F(xiàn)c樣品中細(xì)菌群落豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)高于Fx樣品，沉積物樣品JSc、Fc多樣性指數(shù)低于C1c、C4c、Sc樣品，由此可見(jiàn)反應(yīng)系統(tǒng)沉積物樣品中細(xì)菌群落多樣性隨系統(tǒng)處理進(jìn)程增加.

表2 細(xì)菌群落Alpha多樣性分析結(jié)果

2.3 反應(yīng)系統(tǒng)中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征

8個(gè)樣品共注釋了24個(gè)門(mén)、234個(gè)屬，將門(mén)水平豐度小于0.01%的細(xì)菌群落合并為其他(others)(見(jiàn)圖2). 由圖2可見(jiàn)，反應(yīng)系統(tǒng)中變形菌門(mén)(Proteobacteria)和綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)為主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén). 變形菌門(mén)在JSs、C1c、C4c、Sc和St樣品中的豐度最高，為37.64%～69.18%；在JSc、Fc和Fx樣品中的豐度次之，為6%～32.84%. 綠彎菌門(mén)在Fc樣品中的豐度最高，為47.07%；在C1c、C4c、Sc和St樣品中的豐度次之，為22.37%～33.87%；在JSc、JSs、Fx樣品中的豐度較低，分別為11.62%、2.12%、1.91%. 藍(lán)細(xì)菌門(mén)(Cyanobacteria)在Fx樣品中的豐度最高，為90.95%；在JSc和Fc樣品中的豐度次之，分別為53.00%和17.29%；在沉淀池和濕地樣品中的豐度較小，為0.27%～9.87%. 硝化螺旋菌門(mén)(Nitrospirae)在Sc和St樣品中的豐度較高，分別為12.98%和12.06%；在進(jìn)水沉積物、反應(yīng)池和沉淀池樣品中的豐度很低，小于0.41%. 在反應(yīng)池、沉淀池和濕地樣品中還有豐度較低(<10%)的擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria)和酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)等.

圖2 反應(yīng)系統(tǒng)中細(xì)菌群落在門(mén)水平上的豐度Fig.2 The abundance of bacterial communities in the reaction system at the phylum level

屬水平上細(xì)菌群落的組成如圖3所示. 由圖3可見(jiàn)，屬水平上反應(yīng)系統(tǒng)中細(xì)菌群落組成在系統(tǒng)前端(反應(yīng)池和進(jìn)水溝渠)與后端(沉淀池和濕地)有顯著差異，高豐度細(xì)菌類(lèi)群主要?dú)w于變形菌門(mén). 披毛菌屬(Gallionella)、Sideroxydans和地桿菌屬(Geobacter)在Fx樣品中的豐度(0.20%～0.88%)較低，處理系統(tǒng)前端樣品(JSs、JSc、Fc)的豐度明顯高于后端樣品(C1c、C4c、Sc、St)，且在沉積物樣品(JSc、Fc、C1c、C4c、Sc)中豐度隨流程不斷降低. 其中披毛菌屬、Sideroxydans和地桿菌屬在反應(yīng)系統(tǒng)前端分別為3.78%～46.24%、4.51%～13.14%和6%～9.81%，后端分別為0～0.53%、0～0.94%和0.23%～3.01%. 紅育菌屬(Rhodoferax)在多級(jí)復(fù)氧反應(yīng)池樣品中的豐度(1.73%～24.91%)高于濕地系統(tǒng)(0～0.32%). 土微菌屬(Pedomicrobium)在沉淀池和濕地系統(tǒng)樣品中的豐度(2.23%～9.89%)明顯高于進(jìn)水和反應(yīng)池樣品(豐度接近0)，硝化螺旋菌屬(Nitrospira)在濕地系統(tǒng)樣品中的豐度(14.29%～15.20%)較高，在進(jìn)水和多級(jí)復(fù)氧反應(yīng)池樣品中的豐度(<0.5%)較低.

圖3 屬水平上反應(yīng)系統(tǒng)中細(xì)菌群落相對(duì)豐度熱圖Fig.3 Heat map of the relative abundance of bacterial communities in the reaction system at the genus level

2.4 反應(yīng)系統(tǒng)中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異及其與金屬元素之間的關(guān)系

Beta多樣性分析主要通過(guò)計(jì)算各樣品中的OUT豐度信息，評(píng)估各樣品間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異. 基于Abund-Jaccard相似和Bray-Curtis相異距離矩陣的主成分分析(PcoA)結(jié)果表明，不考慮細(xì)菌群落組成豐度時(shí)〔見(jiàn)圖4(a)〕，樣本群落結(jié)構(gòu)間存在差異；當(dāng)考慮群落組成豐度時(shí)〔見(jiàn)圖4(b)〕，沉淀池和濕地的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯減小，說(shuō)明沉淀池和濕地中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異受豐度的影響.

圖4 基于Abund-Jaccard相似和Bray-Curtis相異距離矩陣的主成分分析Fig.4 Principal component analysis based on Abund-Jaccard similarity and Bray-Curtis dissimilarity distance matrix

注：Proteobc表示Proteobacteria (變形菌門(mén))；Actinobc表示Actinobacteria(放線(xiàn)菌門(mén))；Acidobac表示Acidobacteria(酸桿菌門(mén))；Bacteroi表示Bacteroidetes(擬桿菌門(mén))；Cyanobac表示Cyanobacteria(藍(lán)細(xì)菌門(mén))；Chorofl表示Chlorofexi(綠彎菌門(mén))；Nitrospr表示Nitrospirae(硝化螺旋菌門(mén))；Fe表示Fe含量；Cr表示Cr含量；Cu表示Cu含量；As表示As含量；Pb表示Pb含量；Ni表示Ni含量. 圖5 門(mén)水平細(xì)菌群落與金屬元素含量的RDA分析Fig.5 RDA analysis of bacterial communities and metal elements at phylum level

利用Canoco 5.0 軟件對(duì)門(mén)水平上反應(yīng)系統(tǒng)中細(xì)菌群落豐度與金屬元素進(jìn)行冗余分析(RDA)，結(jié)果如圖5所示. 箭頭長(zhǎng)度表示理化參數(shù)對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響強(qiáng)度，箭頭越長(zhǎng)說(shuō)明相關(guān)性越大，箭頭連線(xiàn)之間為銳角表示呈正相關(guān)，為鈍角表示呈負(fù)相關(guān). 反應(yīng)系統(tǒng)中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受金屬元素Fe、Ni、As和Pb的影響較大，變形菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)和酸桿菌門(mén)等與Fe和Ni含量均呈正相關(guān)，與As和Pb含量均呈負(fù)相關(guān)，其中與Fe含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與Pb含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；藍(lán)細(xì)菌門(mén)與Fe和Ni含量均呈負(fù)相關(guān)，與As和Pb含量均呈正相關(guān)，其中與Fe含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與Pb含量呈顯著正相關(guān)(P<0.01)(見(jiàn)表3).

表3 細(xì)菌群落與金屬元素間Pearson相關(guān)系數(shù)

3 討論

3.1 煤礦廢水處理系統(tǒng)中細(xì)菌群落組成分析

處理系統(tǒng)對(duì)酸性煤礦廢水具有很好的處理效果，碳酸鹽巖能有效提高酸性煤礦廢水pH，而pH升高有利于Fe3+水解沉淀. 通過(guò)多級(jí)復(fù)氧使DO濃度從進(jìn)水時(shí)的1.7 mg/L升至出水時(shí)的7.1 mg/L，DO濃度升高有利于Fe2+的氧化，因此該反應(yīng)系統(tǒng)對(duì)Fe2+及TFe(總鐵)均有很好的去除效果. 反應(yīng)系統(tǒng)中添加立體彈性填料能有效地將鐵絮體沉積物附著在其表面[8]. 隨著系統(tǒng)中酸性廢水pH和DO濃度的升高，以及金屬離子被去除、EC降低和Eh升高，沉積物(JSc、Fc、C1c、C4c、Sc)樣品中細(xì)菌α-多樣性指數(shù)增加，如Shannon-Wiener指數(shù)從2.82增至5.31. 因此，酸性煤礦廢水中細(xì)菌豐度和多樣性受pH、DO濃度和金屬元素含量等影響[3,19].

反應(yīng)系統(tǒng)中變形菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)、硝化螺旋菌門(mén)和藍(lán)細(xì)菌門(mén)等為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，其中變形菌門(mén)和綠彎菌門(mén)為主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén). 這些細(xì)菌群落在礦山水環(huán)境中多有報(bào)道[20-21]，其中變形菌門(mén)在酸性礦山廢水中為豐富物種[21-22]，且表現(xiàn)出很強(qiáng)的適應(yīng)性，同時(shí)也是鐵硫循環(huán)細(xì)菌的主要細(xì)菌群落[23-24]. 綠彎菌門(mén)在沉積物和濕地土壤中的豐度較高，但在進(jìn)水水樣和反應(yīng)池懸浮物中的豐度較低，其在沉積物中很常見(jiàn)，參與沉積物碳循環(huán)[25]. 擬桿菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)和硝化螺旋菌門(mén)在處理系統(tǒng)后端的豐度高于前端，其中擬桿菌門(mén)在酸性礦山排水中不常見(jiàn)，在環(huán)境酸度低的情況下偶有報(bào)道[14]；酸桿菌門(mén)是一類(lèi)化能異養(yǎng)嗜酸菌，在酸性生態(tài)系統(tǒng)中可降解植物殘?bào)w多聚物、參與鐵循環(huán)[20,26]. 藍(lán)細(xì)菌門(mén)在立體彈性填料和懸浮物樣品中為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，其中在反應(yīng)池懸浮物樣品中占90.95%. 藍(lán)細(xì)菌對(duì)金屬離子具有一定耐性，大多數(shù)藍(lán)細(xì)菌可以通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞外物質(zhì)(如多糖)來(lái)吸附金屬離子[3]，同時(shí)藍(lán)細(xì)菌光合作用產(chǎn)生的氧氣可以增強(qiáng)酸性廢水環(huán)境中的氧化反應(yīng).

酸性礦山廢水環(huán)境中金屬離子對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響，當(dāng)金屬離子濃度超出細(xì)菌耐性值時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成發(fā)生嚴(yán)重變化[20,22,27]，如在低濃度As脅迫下會(huì)刺激對(duì)As敏感的微生物生長(zhǎng)繁殖，但高濃度As會(huì)對(duì)微生物有明顯的抑制作用，從而導(dǎo)致某些微生物死亡和多樣性降低[28]. 在該反應(yīng)系統(tǒng)鐵絮體沉積物樣品(JSc、Fc、Fx、C1c、C4c、Sc)中門(mén)水平上細(xì)菌群落豐度主要受金屬元素Fe、As、Ni和Pb含量的影響較大.

3.2 煤礦廢水處理系統(tǒng)中細(xì)菌群落功能分析

由于該處理系統(tǒng)的進(jìn)水呈弱酸性，F(xiàn)e2+濃度相對(duì)較低(42.85 mg/L)，不適宜典型嗜酸性鐵氧細(xì)菌(Acidithiobacillus)生存[25]，但是在系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)了適宜于低酸度環(huán)境的鐵氧化細(xì)菌披毛菌屬[29]和Sideroxydans[25]等，兩種細(xì)菌的豐度在處理系統(tǒng)前端和后端存在顯著差異，且隨著處理進(jìn)程在沉積物中逐漸降低. 披毛菌屬[24,30]和Sideroxydans在微氧條件下具備氧化Fe2+的能力，其中Sideroxydans可以在DO摩爾濃度小于50 μmol/L情況下，將Fe2+有效氧化成Fe3+[31]. 由于在多級(jí)復(fù)氧反應(yīng)池中87.7%的Fe2+被氧化，導(dǎo)致進(jìn)入濕地系統(tǒng)中Fe2+濃度極低，因此在濕地系統(tǒng)中低濃度Fe不足以維持化能自養(yǎng)細(xì)菌的大量生長(zhǎng).

地桿菌屬和紅育菌屬主要存在于多級(jí)復(fù)氧反應(yīng)池樣品中，而濕地樣品中的豐度較低(<0.47%). 地桿菌屬[32]和紅育菌屬[22]在酸性礦山廢水環(huán)境中能將Fe3+還原成Fe2+，其中地桿菌屬在Fe3+豐富且可供細(xì)菌利用時(shí)成為Fe3+還原的主力軍[33]，在酸性礦山環(huán)境中低濃度DO和高濃度Fe3+有利于鐵還原細(xì)菌對(duì)Fe3+的還原[34-35]. 隨著反應(yīng)系統(tǒng)DO濃度不斷提升，且進(jìn)入濕地系統(tǒng)中Fe濃度較低，故鐵還原細(xì)菌在濕地中不宜生存，但在反應(yīng)系統(tǒng)中存在較低豐度(<1%)的鐵氧化細(xì)菌Rhodobacter、Sediminibacterium與鐵還原細(xì)菌Anaeromyxobacter、Desulfuromonas等[24]. 其中Desulfuromonas是典型的SRB(sulfate-reducing bacteria)菌，不僅可以還原硫酸鹽，還可以利用Fe3+和Mn4+作為電子受體，使其還原為Fe2+和Mn2+[36].

煤礦廢水經(jīng)多級(jí)復(fù)氧反應(yīng)池處理后進(jìn)入垂直流人工濕地，人工濕地中植物可通過(guò)吸收和吸附等作用去除廢水中的金屬離子，如菖蒲對(duì)廢水中Mn具有很好的生物富集能力[37]. 濕地沉積物和植物根際土壤中Mn的含量(2.9%±0.16%)明顯高于多級(jí)復(fù)氧反應(yīng)池沉積物樣品中Mn的含量(0.08%～0.83%)，說(shuō)明在濕地系統(tǒng)中更有利于錳氧化物生成. 濕地系統(tǒng)沉積物和植物根際土壤中鐵和錳氧化物累積微生物土微菌屬和硝化螺旋菌屬，其豐度明顯高于多級(jí)復(fù)氧反應(yīng)池樣品. 土微菌屬可黏附在濕地系統(tǒng)中植物或者池壁等的表面，形成生物膜吸附鐵錳氧化物[38]. 硝化螺旋菌屬在濕地系統(tǒng)中不僅具有硝化功能，同時(shí)還能產(chǎn)生硫化物醌還原酶，將硫化物氧化為單質(zhì)硫[39]. 此外，從圖3中還可看出，反應(yīng)系統(tǒng)中有很多未歸類(lèi)和未培養(yǎng)的細(xì)菌群落豐度在沉淀池和濕地中高于進(jìn)水和反應(yīng)池，這些細(xì)菌的生理代謝和環(huán)境功能仍需依賴(lài)菌株分離培養(yǎng)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證[14].

4 結(jié)論

a) 該煤礦酸性廢水中Fe主要在多級(jí)復(fù)氧反應(yīng)池中去除，Mn主要在濕地系統(tǒng)中去除. 沉積物中富集了大量Fe、Mn、Ni、As和Pb等金屬，其中Fe含量高達(dá)26.74%，在濕地系統(tǒng)沉積物和植物根際土壤中Mn的含量(2.9%±0.16%)明顯高于多級(jí)復(fù)氧反應(yīng)池沉積物中Mn的含量(0.08%～0.83%).

b) 反應(yīng)系統(tǒng)中的主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形菌門(mén)(Proteobacteria)和綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)，藍(lán)細(xì)菌門(mén)(Cyanobacteria)為反應(yīng)池懸浮物中的主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，豐度為90.95%. 沉積物中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受金屬元素Fe、Ni、As和Pb含量影響較大，隨反應(yīng)系統(tǒng)的處理程度，沉積物中細(xì)菌α-多樣性指數(shù)增加.

c) Beta分析表明，細(xì)菌群落豐度在系統(tǒng)前端(進(jìn)水溝渠和反應(yīng)池)和后端(沉淀池和濕地)存在差異. 系統(tǒng)沉積物中鐵氧化細(xì)菌〔披毛菌屬(Gallionella)和Sideroxydans等〕和鐵還原細(xì)菌〔地桿菌屬(Geobacter)等〕豐度隨處理進(jìn)程均降低，但在濕地系統(tǒng)沉積物和植物根際土壤中土微菌屬(Pedomicrobium)(8.38%±1.51%)和硝化螺旋菌屬(Nitrospira)(14.75%±0.46%)豐度明顯高于多級(jí)復(fù)氧反應(yīng)池.