東洞庭湖表層水體中抗生素及抗性基因的賦存特征與源分析

宋冉冉, 國曉春, 盧少勇*, 劉曉暉, 王曉慧

1.北京化工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院, 北京 100029 2.中國環(huán)境科學(xué)研究院， 湖泊水污染治理與生態(tài)修復(fù)技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室, 環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100012

自20世紀(jì)30年代以來，抗生素被廣泛應(yīng)用于人畜疾病治療及農(nóng)業(yè)活動(dòng)等方面，然而只有25%～75%的抗生素能被吸收，剩余抗生素會(huì)以原形或代謝物形式經(jīng)由糞尿排出體外[1-4]. 未被吸收的抗生素進(jìn)入環(huán)境中不僅會(huì)增加環(huán)境污染負(fù)荷，還會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生一些耐藥菌群或抗生素抗性基因(ARGs)[5-7]. 環(huán)境中的ARGs可通過食物鏈進(jìn)入人體，影響疾病治療效果及危害人體健康[8-9]. 世界衛(wèi)生組織已將抗生素耐藥性作為重大的全球性公共健康問題之一[10]. 此外，ARGs可產(chǎn)生特殊的生態(tài)毒理效應(yīng)，通過水平轉(zhuǎn)移在菌間傳遞，也可隨微生物繁殖傳給子代，對(duì)公共衛(wèi)生、食品和飲用水安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅[11-12].

2006年，Pruden等[13]首次將ARGs視為新興污染物提出，由此ARGs開始受到世界范圍內(nèi)越來越多研究者的關(guān)注，在美國[14]、中國[15]、瑞士[16]、日本[17]、意大利[10]和澳大利亞[18]等國家均檢測出了ARGs. 我國作為世界上較大的抗生素生產(chǎn)國和消費(fèi)國，每年抗生素生產(chǎn)量和用量分別達(dá)24.8×104和16.2×104t，且超過5 t的抗生素排入水環(huán)境中[19-20]，導(dǎo)致ARGs在我國鄱陽湖[21]、洪澤湖[22]、博斯騰湖[4]、洪湖[23]、太湖[24]等水體中被廣泛檢出.

水環(huán)境是ARGs重要的聚集地，其可通過直接或間接途徑傳播給人類和動(dòng)物，產(chǎn)生健康風(fēng)險(xiǎn)[25]. 除背景水平的ARGs(微生物的內(nèi)在抗性)外，外源輸入是水環(huán)境中ARGs的重要來源，包括醫(yī)療廢水、畜禽養(yǎng)殖廢水、水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水和污水處理廠出水等[26-27]. 目前，對(duì)湖泊內(nèi)ARGs的研究主要集中在污染水平分析，對(duì)湖泊水環(huán)境與陸地污染源ARGs的響應(yīng)關(guān)系研究還比較少，進(jìn)行湖泊內(nèi)陸地污染源中ARGs污染特征的研究及量化其對(duì)湖內(nèi)ARGs污染的貢獻(xiàn)，是亟需解決的科學(xué)問題. 東洞庭湖作為洞庭湖流域東、西、南三湖中最大、最完整的集水盆地，是連接長江的紐帶，其水質(zhì)的好壞直接影響生態(tài)環(huán)境安全及長江的水質(zhì). 東洞庭湖區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖面積、畜禽養(yǎng)殖數(shù)量及人口密度均較大，向東洞庭湖輸送大量抗生素等污染物. 已有研究[19,28]表明，洞庭湖流域的抗生素排放量(3 440 t/a)居全國之首，且在洞庭湖流域東洞庭湖的污染水平最突出. 因此，研究ARGs在東洞庭湖流域中的賦存特征及遷移轉(zhuǎn)化至關(guān)重要. 已有的少數(shù)研究多關(guān)注東洞庭湖內(nèi)抗生素隨季節(jié)的變化特征[28]以及沉積物中ARGs的含量[23]，但尚沒有關(guān)于表層水體中ARGs的污染特征以及陸地污染源對(duì)湖內(nèi)ARGs貢獻(xiàn)的系統(tǒng)研究. 該研究通過調(diào)查東洞庭湖表層水體中ARGs和抗生素的污染情況，定量分析陸地污染源中的ARGs，并對(duì)抗生素等環(huán)境參數(shù)進(jìn)行冗余分析，明確東洞庭湖表層水體中抗生素及ARGs的賦存特征，探討陸地污染源ARGs的分布及其入湖通量，以及ARGs豐度與抗生素及環(huán)境因素之間的相關(guān)關(guān)系，以期為東洞庭湖水體的污染防治提供可靠的數(shù)據(jù)支撐.

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域及樣品采集

東洞庭湖(28°59′N～29°38′N、112°43′E～113°15′E)位于湖南省東北部，總面積 1 328 km2，平均水深6.39 m. 常年湖容量1.78×1010m3，年均氣溫17 ℃，總降水量 1 200～1 330 mm，無霜期258～275 d. 1982年成立東洞庭湖自然保護(hù)區(qū)，1994年升格為國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，主要保護(hù)洞庭湖濕地生態(tài)和生物資源. 東洞庭湖作為長江中下游僅有的2個(gè)天然湖泊之一，在調(diào)節(jié)洪水徑流和保護(hù)物種基因或生物多樣性方面發(fā)揮著重要作用.

該研究在東洞庭湖流域設(shè)定了14個(gè)采樣點(diǎn)(X1～X14)，于2019年11月采集表層水樣品. 采用不銹鋼桶采集0～1 m的表層水，置于1 L棕色瓶中，不銹鋼桶和棕色瓶使用前均用甲醇和超純水清洗并用水樣潤洗過. 加入5 mL甲醇抑制微生物生長，運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室于0～4 ℃冰箱保存. 同時(shí)，在東洞庭湖典型陸地污染源區(qū)(水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)和污水處理廠)布設(shè)7個(gè)采樣點(diǎn)：錢糧湖鎮(zhèn)污水處理廠(W1采樣點(diǎn))、水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)(W2、W3、W4和W5采樣點(diǎn))、岳陽市君山區(qū)第二污水廠(W6采樣點(diǎn))和君山區(qū)城區(qū)污水凈化中心(W7采樣點(diǎn))，利用不銹鋼桶采集水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)廢水以及污水處理廠進(jìn)、出水，置于1 L棕色瓶中. 采樣點(diǎn)布設(shè)如圖1所示.

圖1 東洞庭湖采樣點(diǎn)的布設(shè)Fig.1 Layout of sampling sites in East Dongting Lake

1.2 抗生素的檢測

1.2.1樣品預(yù)處理

用0.22 μm無菌濾膜過濾水樣(1 L)，加入0.5 g EDTA-2Na，用2 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至3.0. 樣品混勻后，以3 mL/min的流速通過Oasis HLB小柱進(jìn)行富集. 富集完成后，用10 mL 5%甲醇水和10 mL純水洗壁，抽干2 h. 再用6 mL甲醇、6 mL甲醇(5%)氨溶液進(jìn)行緩慢洗脫，收集洗脫液于15 mL氮吹管中，在40 ℃水浴條件下氮吹至近干. 最后用1 mL甲醇溶液進(jìn)行復(fù)溶，過0.22 μm濾膜后裝入進(jìn)樣小瓶中，于0～4 ℃冰箱保存待測.

1.2.2抗生素的測定

用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(ACQUITY UPLC-XEVO-TQMSUSA, 美國Waters公司)測定水樣中的12種抗生素(均購自德國的Ehrenstorfer公司)，即羅紅霉素(Roxithromycin，ROM)、土霉素(Oxytetracycline，OTC)、紅霉素(Erythromycin，ERM)、四環(huán)素(Tetracycline，TC)、金霉素(Chlortetracycline，CTC)、磺胺嘧啶(Sulfadiazine，SDZ)、磺胺二甲嘧啶(Sulfadimidine，SMZ)、磺胺甲惡唑(Sulfamethoxazole，SMX)、氧氟沙星(Ofloxacin，OFLO)、諾氟沙星(Norfloxacin，NOR)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)和恩諾沙星(Enrofloxacin，ENR). 所有化學(xué)試劑和溶劑均為色譜純，標(biāo)準(zhǔn)品(1 mg/L)溶于甲醇，在20 ℃下避光保存，直至分析.

色譜條件：色譜柱為UPLC BEH-C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫為40 ℃；流動(dòng)相為溶劑A(0.01%甲酸水溶液)和溶劑B(100%乙腈). 梯度洗脫分離：0～1 min，15%～20%溶劑A，保持1 min；1～8 min，20%～30%溶劑A；8～17 min，30%～15%溶劑A，保持9 min.

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧電離源(electrospray ionization，ESI)；干燥氣流速為10.0 L/min；霧化氣流速為3.0 L/min；加熱氣流速為10.0 L/min；加熱模塊溫度為400 ℃；掃描模式為多重反應(yīng)監(jiān)測(multiple-reaction monitoring，MRM).

1.3 抗性基因的檢測

1.3.1樣品預(yù)處理和DNA提取

用0.22 μm無菌濾膜過濾水樣(1 L)，利用基因組DNA提取試劑盒(美國OMEGA公司)提取DNA,并提取的DNA保存于-80 ℃冰箱備用.

1.3.2抗性基因的測定

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(LineGene9600plus型熒光定量PCR儀，杭州博日科技有限公司)進(jìn)行抗性基因的檢測，共檢測8種抗性基因：sul1、sul2、tetA、tetM、tetW、ermA、ermB、qnrS.引物序列和PCR反應(yīng)條件見表1. PCR條件：在95 ℃下初始變性3 min，隨后在95 ℃下保持30 s，在所需退火溫度(見表1)下退火30 s，最后在72 ℃下延伸40 s，所有步驟循環(huán)35次. ARGs的標(biāo)準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(R2>0.99)，標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增效率為88.93%～106.22%，滿足試驗(yàn)要求.

表1 抗性基因的引物序列和PCR反應(yīng)條件

1.4 水質(zhì)參數(shù)測定

利用EXO2便攜式多參數(shù)水質(zhì)檢測儀(美國YSI公司)檢測水樣的pH、氧化還原電位(ORP)、電導(dǎo)率(EC)、DO濃度和溫度(T). 利用DR5000紫外分光光度計(jì)(美國HACH公司)檢測水樣中TN、TP、NH4+-N、NO3--N和正磷酸鹽(M3PO4)的濃度.

1.5 陸地污染源入湖通量估算

污水處理廠按照點(diǎn)源排放考慮，根據(jù)式(1)[29]估算入湖通量：

(1)

式中：W為估算時(shí)間段內(nèi)污染物的入湖通量，copies/a；n為估算時(shí)間段內(nèi)的采樣次數(shù)，該研究取值為1；K為時(shí)段轉(zhuǎn)化系數(shù)，取值365；Qi為排放流量，m3/d；Ci為污染物濃度，copies/mL.

水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)按照面源排放考慮，參考《第一次全國污染源普查 水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)污染源產(chǎn)排污系數(shù)手冊(cè)》，并結(jié)合東洞庭湖周邊水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)污染物排放情況來確定水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)ARGs產(chǎn)排污系數(shù)，然后計(jì)算其入湖通量，即入湖通量=污染物排放量=排污系數(shù)×養(yǎng)殖增產(chǎn)量.

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的輸入和處理；利用Canoco 5 軟件進(jìn)行ARGs豐度與環(huán)境變量的冗余分析；使用Origin 9.0軟件繪制圖表；使用ArcGIS 10.0軟件繪制采樣點(diǎn)位圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 東洞庭湖表層水體中抗生素的賦存水平

抗生素的濃度水平如表2所示. 由表2可見，除紅霉素外其余11種抗生素均有不同程度的檢出，羅紅霉素、磺胺嘧啶和氧氟沙星的檢出率均為100%，諾氟沙星和環(huán)丙沙星的檢出率最低，均為7%. 東洞庭湖表層水體中抗生素濃度范圍為ND(未檢出)～486.59 ng/L，氧氟沙星濃度最高，其次為土霉素、磺胺甲惡唑、金霉素、羅紅霉素、恩諾沙星、四環(huán)素，其他抗生素濃度處于較低水平. 結(jié)合檢出率與檢出濃度來看，氧氟沙星和羅紅霉素是東洞庭湖表層水體中的主要抗生素類型.

表2 東洞庭湖表層水體中不同種類抗生素的濃度

喹諾酮類抗生素濃度范圍為ND～486.59 ng/L，平均值為18.58 ng/L. 氧氟沙星濃度最高達(dá)486.59 ng/L，平均值為63.41 ng/L，檢出率為100%，居所有抗生素之首. 氧氟沙星主要用于人類疾病治療，醫(yī)療用量較大[30]，因此水體中氧氟沙星的來源可能為周圍醫(yī)療廢水直排. 恩諾沙星的濃度水平位居第二，平均值為8.09 ng/L，檢出率為50%，歸因于恩諾沙星在水產(chǎn)養(yǎng)殖和畜牧業(yè)中的高使用量[31]. 諾氟沙星和環(huán)丙沙星的檢出率和濃度均處于較低水平，這是由于諾氟沙星已被禁止在未成年人中使用，限制了其用量[32]. 東洞庭湖中喹諾酮類抗生素的平均濃度高于巢湖(15.39 ng/L)[33]和大通湖(8.55 ng/L)[34]，略低于艾比湖(19.54 ng/L)[35]. 氧氟沙星的濃度遠(yuǎn)高于艾比湖(22.67 ng/L)[35]，與太湖貢湖灣(14～474 ng/L)[36]相當(dāng)；諾氟沙星的濃度比太湖貢湖灣(14～474 ng/L)[36]低很多；恩諾沙星的濃度與大通湖(8.04 ng/L)[34]基本持平. 喹諾酮類藥物主要應(yīng)用于規(guī)?；B(yǎng)殖及人類疾病控制，這些顯著的差異可能與研究區(qū)域內(nèi)喹諾酮類抗生素使用量不均有關(guān).

磺胺類抗生素濃度范圍為ND～220.95 ng/L，平均值為7.44 ng/L，低于珠江三角洲(<776 ng/L)[37]和大通湖(37.41 ng/L)[34]. 磺胺甲惡唑的平均濃度最高(20.73 ng/L)，歸因于其在水環(huán)境中的降解受光照及好氧等條件影響小，能在水體中長期存在[38]. 磺胺類抗生素由于具有廣譜性、療效強(qiáng)和價(jià)格低廉等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，以提高養(yǎng)殖魚類的健康和產(chǎn)量[39]. 因此，磺胺甲惡唑的高檢出濃度可能與研究區(qū)域內(nèi)磺胺甲惡唑在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的廣泛使用有關(guān).

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素濃度范圍為ND～110.66 ng/L，羅紅霉素檢出率為100%，紅霉素均未檢出. 羅紅霉素最高濃度達(dá)110.66 ng/L，低于太湖(218.3 ng/L)[40]和白洋淀(155 ng/L)[41]，但高于南昌市城市湖泊(20.8 ng/L)[31]4倍以上. 羅紅霉素主要用于農(nóng)業(yè)養(yǎng)殖及醫(yī)療，其在水體中的檢出率及檢出濃度相對(duì)較高，說明此類抗生素在東洞庭湖周圍居民中的使用量大，使用頻率高.

四環(huán)素類抗生素濃度范圍為ND～50.32 ng/L，平均值為14.08 ng/L. 東洞庭湖土霉素、四環(huán)素和金霉素的平均濃度均高于艾比湖(平均值分別為10.12 ng/L、2.49 ng/L、ND)[35]和大通湖(平均值分別為0.68、1.65、3.92 ng/L)[34]，呈現(xiàn)出較高水平，應(yīng)引起足夠注意. 土霉素的平均濃度最高(22.12 ng/L)，與王倩倩等[35]的研究結(jié)果一致. 四環(huán)素類抗生素主要用于動(dòng)物疾病的治療與預(yù)防，其在水環(huán)境的穩(wěn)定性與光照、微生物和沉積物的吸附作用等多種因素有關(guān)，進(jìn)而檢出不同的濃度水平[42-43].

2.2 東洞庭湖表層水體中抗生素的空間分布特征

抗生素的濃度水平及空間分布受消耗量、使用頻率和環(huán)境因子等多種因素的影響. 由圖2可見，抗生素的累積濃度為23.02～754.13 ng/L，具有一定的空間差異. X3采樣點(diǎn)抗生素的累積濃度最高，氧氟沙星和磺胺甲惡唑是主要貢獻(xiàn)因子，貢獻(xiàn)率在93%以上，其次為X7采樣點(diǎn)，其主要原因是：①X3采樣點(diǎn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達(dá)，且靠近生態(tài)漁村，飼料中抗生素的添加導(dǎo)致這片區(qū)域抗生素濃度相對(duì)較高；②X7采樣點(diǎn)靠近岳陽市岳陽樓區(qū)，人類活動(dòng)頻繁，在醫(yī)療中對(duì)抗生素的大量使用導(dǎo)致這片區(qū)域抗生素濃度較高. X13采樣點(diǎn)抗生素的累積濃度最低，可能與該采樣點(diǎn)遠(yuǎn)離人口密集區(qū)和水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)有關(guān).

圖2 東洞庭湖各采樣點(diǎn)抗生素的累積濃度Fig.2 Accumulative concentration of antibiotics at each sampling site in the East Dongting Lake

2.3 東洞庭湖表層水體中抗生素抗性基因的賦存水平

所有抗性基因的檢出率均為100%，說明東洞庭湖水體受到磺胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類抗性基因的共同污染. ARGs的濃度情況如圖3所示. 由圖3可見，8種抗性基因的最高濃度均大于2.9×101copies/mL. 基因sul2、tetW、ermA的平均濃度最高，分別為1.3×103、5.4×102和2.0×102copies/mL，磺胺類和四環(huán)素類抗性基因的高濃度水平與房平等[44]的研究結(jié)果一致.

圖3 抗性基因絕對(duì)濃度(c)的箱式分布圖Fig.3 Box-plot of absolute concentration of ARGs

磺胺類抗性基因濃度范圍為3.7～3.16×103copies/mL，平均值為7.07×102copies/mL，高于其他三類ARGs. 基因sul2的平均濃度最高，為1.3×103copies/mL，是東洞庭湖流域表層水體中的優(yōu)勢(shì)ARGs，這說明該區(qū)域磺胺類抗生素使用廣泛，存在潛在的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn). 截至目前，共發(fā)現(xiàn)4種磺胺類基因(sul1、sul2、sul3、sulA)，且基因sul1和sul2最常在水環(huán)境中檢出，這與該研究的結(jié)果一致. 與鄱陽湖流域ARGs濃度(基因sul2的平均濃度為1.9×101copies/mL)[45]相比，東洞庭湖表層水體中基因sul2的平均濃度(1.3×103copies/mL)相對(duì)較大，說明東洞庭湖流域磺胺類抗性基因污染情況嚴(yán)重，湖泊水環(huán)境已經(jīng)成為ARGs的一個(gè)重要儲(chǔ)庫.

四環(huán)素類抗性基因濃度范圍為2.69～2.43×103copies/mL，平均值為2.27×102copies/mL，僅次于磺胺類抗性基因，這表明東洞庭湖表層水受磺胺類和四環(huán)素類抗性基因污染嚴(yán)重. 一方面是由于ARGs的自我擴(kuò)增和在環(huán)境中的穩(wěn)定性造成的，ARGs可通過與轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒等可移動(dòng)元件結(jié)合，在不同細(xì)菌間轉(zhuǎn)移和傳播，而攜帶ARGs的菌株死亡后，其攜帶的ARGs可以在脫氧核糖核酸酶的保護(hù)下釋放到環(huán)境中并持久存在，并通過結(jié)合、轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式進(jìn)入到其他菌株內(nèi)[20,46]；另一方面是由于磺胺類和四環(huán)素類抗生素在動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)中的廣泛使用和濫用所產(chǎn)生的選擇性壓力造成的. 基因tetA、tetM、tetW的絕對(duì)濃度范圍分別為2.7～2.9×101、8.5×101～2.1×102、2.0×102～2.4×103copies/mL，平均值從大到小表現(xiàn)為基因tetW>基因tetM>基因tetA，這種濃度水平的差異可能與區(qū)域內(nèi)四環(huán)素類抗生素的使用方式、相應(yīng)抗性機(jī)制及不同種類的宿主細(xì)菌有關(guān). 四環(huán)素類抗性基因在表層水體中廣泛存在，四環(huán)素類抗生素在表層水體中的檢出率和檢出濃度較低，這可能與ARGs的“持久性”或“可復(fù)制性”有關(guān)[47].

大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因ermB和喹諾酮類抗性基因qnrS的濃度范圍分別為1.1×101～1.2×102、2.2×101～1.1×102copies/mL，含量低于其他兩類ARGs，且遠(yuǎn)低于長江下游湖泊中基因ermB和qnrS的濃度(分別為4.25×104～1.65×105、9.31×102～3.92×106copies/mL)[5]，表明這兩類抗性基因雖然普遍存在(檢出率均為100%)，但污染情況并不嚴(yán)重. 喹諾酮類抗生素的檢出率和檢出濃度都處于較高水平，而喹諾酮類抗性基因qnrS處于較低水平，說明ARGs的存在不完全取決于抗生素的污染程度，可能與該基因不如其他基因穩(wěn)定有關(guān)[48].

2.4 東洞庭湖表層水體中抗生素抗性基因的空間分布特征

湖泊中ARGs污染水平主要受沿湖污染源輸入的影響，東洞庭湖ARGs的濃度水平如圖4所示. 由圖4可見，基因sul2在X5、X14和X12采樣點(diǎn)均呈現(xiàn)較高濃度水平，由于周邊水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)相對(duì)發(fā)達(dá)，抗生素的使用量及使用頻率較高，通過雨水徑流或直接施用等途徑進(jìn)入湖中，導(dǎo)致湖內(nèi)區(qū)域磺胺類抗性基因濃度升高. 另外，X14采樣點(diǎn)靠近入江口，高濃度的ARGs會(huì)隨著湖水流至長江，對(duì)長江的水質(zhì)造成影響. X11采樣點(diǎn)各抗性基因的檢出濃度基本都低于其他采樣點(diǎn)，可能是因?yàn)樵摬蓸狱c(diǎn)遠(yuǎn)離岸邊，距離外界輸入型污染源較遠(yuǎn)，由于污染物的削減作用導(dǎo)致檢出濃度低[22].

圖4 東洞庭湖各采樣點(diǎn)抗性基因(ARGs)的濃度Fig.4 Concentration of ARGs at each sampling site in the East Dongting Lake

2.5 東洞庭湖流域抗生素抗性基因的污染源分析

人類活動(dòng)是影響ARGs分布的重要因素，包括畜禽養(yǎng)殖、水產(chǎn)養(yǎng)殖和污水處理廠等[49]. 陸地污染源ARGs的測定結(jié)果如圖5所示. 其中W1、W6和W7采樣點(diǎn)分別為錢糧湖鎮(zhèn)污水處理廠、岳陽市君山區(qū)第二污水廠和君山區(qū)城區(qū)污水凈化中心進(jìn)水，W1-1、W6-1和W7-1采樣點(diǎn)分別為錢糧湖鎮(zhèn)污水處理廠、岳陽市君山區(qū)第二污水廠和君山區(qū)城區(qū)污水凈化中心出水. 由圖5可見，錢糧湖鎮(zhèn)污水處理廠和君山區(qū)城區(qū)污水凈化中心出水中每種抗性基因的濃度都低于進(jìn)水，說明污水處理廠對(duì)ARGs具有一定的去除效果. 出水中仍含有一定濃度的ARGs，說明污水處理廠中的處理設(shè)施不能完全去除ARGs，處理后廢水的排放會(huì)增加其受納水體(河流和湖泊)中ARGs的濃度[50-51]. 岳陽市君山區(qū)第二污水廠中的基因qnrS經(jīng)過污水廠處理后濃度甚至增加，污水廠中的生物處理單元常常有大量微生物參與，這增加了ARGs傳播的可能性. 以上結(jié)果說明污水處理廠在改善環(huán)境的同時(shí)，有可能會(huì)帶來二次污染，傳統(tǒng)的污水處理方法不能完全去除ARGs，甚至可能增加其豐度，污水處理廠已經(jīng)成為ARGs向水環(huán)境中傳播的主要途徑[52]. 在水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)廢水中，4類ARGs均有不同程度的檢出，這與其對(duì)應(yīng)的抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中廣泛使用有關(guān). 基因sul2在4個(gè)水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中的濃度都居于首位，是主要污染物. 與表層水體中ARGs的檢測結(jié)果結(jié)合分析，錢糧湖鎮(zhèn)污水處理廠出水中基因qnrS絕對(duì)濃度最高(9.81×102copies/mL)，在距離該污水處理廠最近的湖內(nèi)X2采樣點(diǎn)也檢測到了基因qnrS的最高濃度(1.12×102copies/mL). W5采樣點(diǎn)四環(huán)素類抗性基因的累積濃度最高(6.16×102copies/mL)，在距離該采樣點(diǎn)最近的湖內(nèi)X11和X12采樣點(diǎn)，四環(huán)素類抗性基因累積濃度也處于較高水平，分別為2.53×103和9.65×102copies/mL. 該研究結(jié)果表明，陸地污染源中ARGs的濃度可能會(huì)影響湖內(nèi)表層水體中ARGs的賦存.

圖5 陸地污染源中ARGs的濃度(c′)Fig.5 Concentration of ARGs of land pollution sources

選取的4個(gè)水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)，養(yǎng)殖模式均為池塘養(yǎng)殖，主要養(yǎng)殖魚和蝦，通過查找《第一次全國污染源普查 水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)污染源產(chǎn)排污系數(shù)手冊(cè)》，確定養(yǎng)殖魚和蝦的排污系數(shù)分別為 0.003 1 和 0.009 0. 錢糧湖鎮(zhèn)污水處理廠、岳陽市君山區(qū)第二污水廠、君山區(qū)城區(qū)污水凈化中心的排放流量分別為 5 000、50 000、25 000 m3/d，其入湖通量計(jì)算結(jié)果如圖6所示. 由圖6可見，污水處理廠出水的ARGs對(duì)湖內(nèi)ARGs的貢獻(xiàn)遠(yuǎn)高于水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)，且所檢測的8種抗性基因都有不同程度的貢獻(xiàn). 基因sul2在錢糧湖鎮(zhèn)污水處理廠、岳陽市君山區(qū)第二污水廠、君山區(qū)城區(qū)污水凈化中心的入湖通量都呈現(xiàn)最高水平(分別為4.46×1016、2.56×1017、3.33×1017copies/a)，其次是基因sul1(分別為2.38×1016、5.14×1016、1.90×1017copies/a)，成為污水處理廠向湖內(nèi)輸入的主要ARGs. 但是水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)ARGs的污染也不能忽視，對(duì)于東洞庭湖來說，湖區(qū)水產(chǎn)品占湖南省的1/2，具有水產(chǎn)養(yǎng)殖面積廣闊、養(yǎng)殖總量大等特征[53]. 后續(xù)研究應(yīng)該對(duì)東洞庭湖所有水產(chǎn)養(yǎng)殖的企業(yè)及個(gè)體進(jìn)行普遍調(diào)查，從而明確其對(duì)湖內(nèi)污染物的總體貢獻(xiàn)，以期為東洞庭湖流域ARGs的污染防治提供決策支持.

圖6 陸地污染源中ARGs的入湖通量(W)Fig.6 ARGs fluxes flowing into lake of land pollution sources

2.6 東洞庭湖表層水體中ARGs、抗生素和環(huán)境參數(shù)之間的相互關(guān)系

已有研究[22]發(fā)現(xiàn)，ARGs的濃度水平不僅與環(huán)境中抗生素的暴露水平相關(guān)，還與有機(jī)質(zhì)含量等環(huán)境因素相關(guān). 環(huán)境中的外源抗生素及其代謝物可能通過基因突變或選擇壓力在低濃度下加速ARGs的進(jìn)化，因此ARGs豐度通常與環(huán)境中抗生素的濃度呈正相關(guān)[54]. 選擇水質(zhì)參數(shù)環(huán)境變量(如pH、ORP、EC、T以及TN、TP、NH3-N、NO3--N、M3PO4、DO濃度)和檢出的主要抗生素，與ARGs含量進(jìn)行相關(guān)性分析，以探究東洞庭湖流域表層水體中環(huán)境變量與ARGs豐度之間的潛在關(guān)系.

ARGs豐度與抗生素的冗余分析如圖7所示. 圖7中，藍(lán)色箭頭代表ARGs，紅色箭頭代表抗生素等環(huán)境變量，紅色箭頭與藍(lán)色箭頭之間的夾角余弦值代表該環(huán)境變量與ARGs豐度的相關(guān)性大小[55]. 軸1和軸2的特征值分別為 0.597 3 和 0.168 4，ARGs豐度與抗生素濃度的關(guān)系在軸1和軸2的累計(jì)解釋量為76.56%. 四環(huán)素類抗性基因tetA、tetM豐度與四環(huán)素(TC)、土霉素(OTC)、金霉素(CTC)濃度均呈正相關(guān)，磺胺類抗性基因sul1、sul2豐度與磺胺二甲嘧啶(SMZ)、磺胺甲惡唑(SMX)濃度均呈正相關(guān)，大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因ermA豐度與羅紅霉素(RXM)濃度呈正相關(guān)，喹諾酮類抗性基因qnrS豐度與環(huán)丙沙星(CIP)、恩諾沙星(ENR)濃度均呈正相關(guān)，均符合ARGs在其對(duì)應(yīng)抗生素選擇性壓力下的特征.

圖7 ARGs豐度與抗生素濃度的冗余分析Fig.7 Redundancy analysis between abundance of ARGs and concentration of antibiotics

ARGs豐度與水質(zhì)參數(shù)的冗余分析如圖8所示. 由圖8 可見，軸1特征值為 0.714 8，軸2特征值為 0.166 2，ARGs與水質(zhì)參數(shù)的關(guān)系在軸1和軸2的累計(jì)解釋量為88.10%. 該研究結(jié)果表明，對(duì)ARGs豐度影響最重要的4個(gè)水質(zhì)參數(shù)分別為TP濃度(貢獻(xiàn)率為28.9%)、EC(貢獻(xiàn)率為15.4%)、NO3--N濃度(貢獻(xiàn)率為13.3%)和T(貢獻(xiàn)率為12.7%). 基因tetA、tetW與DO濃度、ORP、T、pH之間的夾角均為銳角，說明這4種水質(zhì)參數(shù)與基因tetA、tetW均呈正相關(guān). pH、T以及TN、NO3--N、M3PO4濃度與基因tetM和qnrS豐度均呈正相關(guān)，與基因sul1和sul2豐度均呈負(fù)相關(guān). 基因ermA、ermB豐度與EC以及TN、NO3--N、M3PO4、NH3-N濃度均呈正相關(guān). 這表明ARGs的豐度不僅與其對(duì)應(yīng)抗生素的選擇性壓力有關(guān)，還與一些環(huán)境因素的壓力有關(guān).

注： TN、NO3--N、M3PO4、NH3-N均表示其濃度. 圖8 ARGs豐度與水質(zhì)參數(shù)濃度的冗余分析Fig.8 Redundancy analysis between abundance of ARGs and water quality parameters

3 結(jié)論

a) 東洞庭湖表層水體中抗生素濃度處于ND～486.59 ng/L水平，氧氟沙星濃度最高，其次依次為土霉素、磺胺甲惡唑、金霉素、羅紅霉素、恩諾沙星、四環(huán)素，其他抗生素濃度處于較低水平. 抗生素的累積濃度為23.02～754.13 ng/L，且具有一定的空間差異性，這與水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和人口密集程度相關(guān).

b) ARGs在東洞庭湖表層水體中均被檢出，檢出率均為100%. 基因sul2、tetW、ermA的平均濃度最高，分別為1.3×103、5.4×102和2.0×102copies/mL. ARGs的濃度水平具有一定的空間差異性，與該地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的用藥和外界輸入型污染源距離有關(guān).

c) 污水處理廠對(duì)ARGs具有一定的去除效果，但不能完全去除ARGs，甚至?xí)黾覣RGs傳播的可能性. 磺胺類抗性基因sul2是水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中的主要污染物. 入湖通量計(jì)算結(jié)果顯示，污水處理廠出水ARGs對(duì)湖內(nèi)ARGs的貢獻(xiàn)遠(yuǎn)高于水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)，磺胺類抗性基因sul11和sul2是污水廠向湖內(nèi)輸入的主要ARGs.

d) 冗余分析表明，基因tetA、tetM豐度與四環(huán)素、土霉素、金霉素濃度均呈正相關(guān)，基因sul1、sul2豐度與磺胺二甲嘧啶、磺胺甲惡唑濃度均呈正相關(guān)，基因qnrS豐度與環(huán)丙沙星、恩諾沙星濃度均呈正相關(guān)，符合ARGs在其對(duì)應(yīng)抗生素的選擇性壓力下的特征；TP濃度(貢獻(xiàn)率為28.9%)、EC(貢獻(xiàn)率為15.4%)、NO3--N濃度(貢獻(xiàn)率為13.3%)和T(貢獻(xiàn)率為12.7%)是影響ARGs豐度最重要的環(huán)境因子. 這表明ARGs的豐度不僅與其對(duì)應(yīng)抗生素的選擇性壓力有關(guān)，還與一些環(huán)境因素的壓力有關(guān).