呼吸道感染病原菌細(xì)菌分布與MUC5AC在慢性阻塞性肺疾病患者氣道中表達(dá)及其預(yù)后的關(guān)系

李華，周向東，李琪，鐘有清，王齊，方芳

（1.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，海南 海口 570102；2.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 干部保健科，海南 ?？?70102）

0 引言

臨床上慢性阻塞性肺疾病是呼吸科常見疾病之一，不僅發(fā)病率高，而且會(huì)呈現(xiàn)出進(jìn)行性的發(fā)展，不僅會(huì)直接降低患者的勞動(dòng)能力，還會(huì)嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量及水平，其治療也會(huì)為患者帶來相對較大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，這種疾病在老年患者中比較常見[1]。我國因慢性阻塞性肺疾病的死亡人數(shù)在全球范圍內(nèi)占31.1%左右，而且人數(shù)逐年增加，對于社會(huì)經(jīng)濟(jì)和家庭而言都是沉重的負(fù)擔(dān)，對于慢性阻塞性肺疾病患者而言，從病理學(xué)角度出發(fā)，其最顯著的癥狀為氣道黏液高分泌，這使氣道黏液既產(chǎn)生了量的改變，質(zhì)上也發(fā)生了改變，也就是黏度增大的同時(shí)，酸性也增強(qiáng)，這意味著患者在病中受到感染因素的影響，氣道上皮分泌MUC5AC明顯升高?；诖耍疚目偨Y(jié)分析呼吸道感染病原菌細(xì)菌分布情況，對比分析MUC5AC在慢性阻塞性肺疾病患者氣道中的表達(dá)及預(yù)后。

1 資料與方法

1.1 一般資料。隨機(jī)抽取2019年1月至2021年1月海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治的100例呼吸道感染患者，在其中進(jìn)行胸外科手術(shù)的患者中隨機(jī)抽取50例慢性阻塞性肺疾病患者作為觀察組，再從中抽取50例其他疾病患者作為對照組，一般資料見表1。

表1 一般資料分析（±s）

表1 一般資料分析（±s）

呼吸道感染患者（n=200）組別 觀察組（n=50）對照組（n=50）男（例） 28 29 57女（例） 22 21 43平均年齡（歲） 55.64±4.31 57.47±4.26 55.27±3.29平均病程（年） 5.56±0.85 5.43±0.82 3.21±1.38

納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床癥狀符合呼吸道感染診斷標(biāo)準(zhǔn)，觀察者患者符合COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)；②觀察組與對照組患者接受胸外科手術(shù)；③兩組患者的基本資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。排除標(biāo)準(zhǔn)：①短期內(nèi)接受過抗生素治療患者；②合并免疫功能障礙患者；③合并器官衰竭或其他臟器重癥疾病患者；④合并嚴(yán)重功能障礙患者；⑤具有精神疾病病史或合并精神障礙患者。本研究已獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬知情且已簽署同意書。

1.2 方法。所有患者均采用以下方式來進(jìn)行檢測。

（1）細(xì)胞培養(yǎng)。在無菌環(huán)境下在胸外科手術(shù)所摘除的肺葉中遠(yuǎn)離肺腫瘤組織的部位進(jìn)行氣道切取，分離培養(yǎng)后48 h內(nèi)使用，并對細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行采集。利用用角蛋白單克隆抗體免疫熒光法檢測提取上皮細(xì)胞純度。

（2）培養(yǎng)上清中MUC5AC定量檢測。沿用上述酶標(biāo)板包被和封閉方法，上清中MUC5AC定量是通過ELISA法而實(shí)現(xiàn)的。將100μL小鼠MUC5AC抗體（1∶500）利用PBS溶液進(jìn)行稀釋，并在其中添加1%胎牛血清，在37℃的環(huán)境下展開為期1 h的孵育，將辣根過氧化物酶偶聯(lián)的馬抗山羊IgG（HRP-IgG）（1∶1000）添加進(jìn)去后，在37℃的環(huán)境下展開為期1 h的孵育，隨后進(jìn)行洗滌，TMB顯色，最后于450 nm處進(jìn)行吸光度值（A值）的讀取。最后，讀取A值所對應(yīng)的MUC5AC量。

（3）MUC5AC mRNA的RT-PCR檢測。提取采集的各組培養(yǎng)細(xì)胞的mRNA，根據(jù)RT-PCR試劑盒（TaKaRa）說明書進(jìn)行提取操作，在反應(yīng)體系25 μL、50℃條件下，于30 min內(nèi)合成cDNA第一鏈，PCR擴(kuò)增條件在94℃+30 s、56.5℃+45 s、72℃+1 min，35次循環(huán)的PCR擴(kuò)增條件下，完成1%瓊脂糖凝膠電泳的擴(kuò)增。掃描采用Ultra·LUM凝膠成像系統(tǒng)，各條帶吸光度值利用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行評測，MUC5AC的相對含量為同一樣本的目的基因/內(nèi)參照β-actin 條帶的吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用SPSS 25.0計(jì)算數(shù)據(jù)，“%”代表計(jì)數(shù)資料，采用χ2檢驗(yàn)，“±s”代表計(jì)量資料，采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 呼吸道感染病原菌細(xì)菌分布分析結(jié)果。100例患者共培養(yǎng)出病原菌細(xì)菌263株，主要包含糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、溶血葡萄球菌、革蘭陽性菌、真菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、革蘭陰性菌、陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌，詳見表2。

表2 200例患者共培養(yǎng)出病原菌細(xì)菌分布分析結(jié)果[n（%）]

2.2 培養(yǎng)的人體氣道上皮細(xì)胞鑒定結(jié)果。經(jīng)鑒定，培養(yǎng)的人體氣道上皮細(xì)胞為原代培養(yǎng)的人體氣道上皮細(xì)胞，主要來源為小氣道，經(jīng)光學(xué)顯微鏡下觀察[3]，結(jié)果顯示上皮細(xì)胞純度為96.37%。

2.3 MUC5AC蛋白水平及MUC5ACmRNA水平對比。對比兩組的氣道上皮細(xì)胞MUC5AC蛋白水平及MUC5ACmRNA水平，觀察組接相對更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。另外檢測中發(fā)現(xiàn)MUC5AC蛋白水平、MUC5ACmRNA水平和FEVl/FVC水平皆具有良好的負(fù)相關(guān)性。

表3 MUC5AC蛋白水平及MUC5ACmRNA水平對比（±s）

表3 MUC5AC蛋白水平及MUC5ACmRNA水平對比（±s）

MUC5ACmRNA水平（μg/mL）組別 例數(shù) MUC5AC蛋白水平（μg/mL）觀察組 50 0.68±0.23 0.47±0.21對照組 50 0.32±0.14 0.12±0.04 t - 9.4541 11.5770 P - 0.0011 0.0011

3 討論

COPD會(huì)對患者的身體健康及整個(gè)家庭的生活質(zhì)量都造成嚴(yán)重的影響，同時(shí)若其伴隨著呼吸道感染疾病，還會(huì)導(dǎo)致其病情加劇。由于患者本身具備氣道細(xì)菌定值特點(diǎn)，所以該疾病的發(fā)病原因主要分為內(nèi)在誘因和外在誘因，受到這些誘因的影響，患者氣道內(nèi)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生劇烈增強(qiáng)負(fù)荷的現(xiàn)象。在過去的研究中認(rèn)為導(dǎo)致COPD的致病菌通常是肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌等病原菌，但通過醫(yī)療技術(shù)的突破發(fā)展，人們在研究中發(fā)現(xiàn)COPD的致病菌產(chǎn)生了極大的變化，特別是COPD患者存在呼吸道分泌物，病原菌耐藥嚴(yán)重的現(xiàn)象，這就可能導(dǎo)致患者病程較長，病情反復(fù)，使臨床治療難度增大。因此對于患者要注意綜合分析化驗(yàn)結(jié)果、藥敏反應(yīng)結(jié)果及細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采取合適的藥物按周期服藥，使患者的疾病能夠得到盡早治療[4-5]。

COPD的重要臨床特征包括氣道炎癥、氣道高反應(yīng)、杯狀細(xì)胞增生及伴隨的黏液高分泌等。所以，在炎癥介質(zhì)、顆粒刺激物、神經(jīng)活化因素等綜合因素刺激作用下，杯狀細(xì)胞會(huì)發(fā)生增生與分化變化，從而轉(zhuǎn)變?yōu)轲ひ悍置诩?xì)胞，和氣道上皮細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行維持，同時(shí)分泌MUC5AC，在氣道黏液中MUC5AC黏蛋白是非常主要的成分，直接影響著氣道黏液的粘附特性與彈性，同時(shí)也構(gòu)成患者抵御機(jī)制的核心組成部分，如果氣道黏液過度分泌會(huì)導(dǎo)致氣道黏膜炎癥呈現(xiàn)慢性進(jìn)行性發(fā)展，對患者的肺功能造成影響[6]。

COPD患者M(jìn)UC5AC呈現(xiàn)出明顯升高的狀態(tài)，是受到病原體等多種因素的刺激，患者疾病發(fā)生過程中這些刺激發(fā)揮了重要作用，COPD患者之所以肺功能會(huì)不斷減退的原因有兩點(diǎn)：一方面是由于過度產(chǎn)生黏液，導(dǎo)致黏液會(huì)對氣道表面產(chǎn)生覆蓋，使外周氣道不穩(wěn)定，受到內(nèi)外多種因素的刺激，使炎癥進(jìn)一步發(fā)展；另一方面，黏液的過度分泌，形成黏液栓，從而使外周氣道產(chǎn)生了阻塞現(xiàn)象，進(jìn)一步使患者肺功能受到影響。

綜上所述，作為一種呼吸系統(tǒng)疾病，COPD在過多的呼吸道致病菌分泌的干擾下，不僅癥狀明顯且會(huì)具有較強(qiáng)的耐藥性，這不僅會(huì)加劇患者的痛苦，同時(shí)會(huì)增強(qiáng)治療難度。在患病早期，利用病原學(xué)檢查進(jìn)行治療方案制定的指導(dǎo)與輔助，能夠讓醫(yī)生在全面把握患者細(xì)菌學(xué)特征的前提下制定更有針對性的治療方案，使患者能夠更快速的實(shí)現(xiàn)病情的改善及疾病的康復(fù)，對于患者的疾病治療及生活質(zhì)量提升都具有重要意義。而因?yàn)镃OPD是一種發(fā)展性疾病，因此其存在MUC5AC黏液蛋白過度分泌的問題，所以MUC5AC對于患者的治療與預(yù)后也具有重要影響。