探討QF-PCR在產(chǎn)前篩查中的臨床應(yīng)用

譚放，馮拓宇，楊嬌英

（湛江市婦幼保健計(jì)劃生育服務(wù)中心，廣東 湛江 524000）

0 引言

三體型和單體型最為常見染色體非整倍體異常情況。最常見的疾病有21三體綜合征、Turner綜合征（45，X）、18三體綜合征和Klinefelter綜合征（47，XXY）[1]。對(duì)于這種疾病，臨床檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)是傳統(tǒng)羊水細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析技術(shù)，可以發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目、結(jié)構(gòu)是否存在異常，但羊水培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，且操作要求嚴(yán)格孕婦，一旦失敗，就需要二次穿刺，在孕婦中接受度較低[2]。定量熒光PCR技術(shù)（QF-PCR）通過對(duì)染色體上多態(tài)性短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)過高分辨率膠電泳（如毛細(xì)管電泳等）對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離，是第二代遺傳標(biāo)記方法，其特點(diǎn)是檢測(cè)簡(jiǎn)便、快捷[3]。目前醫(yī)學(xué)對(duì)于染色體病還沒有有效的治療方法，因此在產(chǎn)前進(jìn)行診斷篩查意義重大。本次研究將探討QF-PCR的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料。經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，選取2020年7~12月在湛江市婦幼保健計(jì)劃生育服務(wù)中心產(chǎn)前診斷中心就診的高危孕婦289例，風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)主要包括高齡、唐篩高風(fēng)險(xiǎn)、超聲發(fā)現(xiàn)胎兒超聲軟指標(biāo)異常及夫婦雙方同型地中海貧血。所有孕婦均已被告知檢測(cè)風(fēng)險(xiǎn)且已簽訂知情同意書，均無羊水穿刺相關(guān)禁忌證。受檢孕婦年齡17~46歲，平均（32.51±2.09）歲，孕周16~27周，平均（19.21±2.63）周。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)289例孕婦進(jìn)行介入性穿刺，抽取20~25 mL羊水，分成15 mL和8 mL分別保存在兩支無菌離心管。

1.2.2 染色體核型分析：將裝有15 mL羊水的無菌離心管送至細(xì)胞遺傳室，進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)及制片G顯帶，核型分析參照ISCN（2016）標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 QF-PCR：根據(jù)提取劑盒說明書提取羊水細(xì)胞DNA，所提DNA均用Qubit4.0檢測(cè)DNA濃度以備用。檢測(cè)試劑盒由達(dá)瑞公司提供。部分懷疑母源污染的標(biāo)本，抽取2 mL母血檢測(cè)其STR位點(diǎn)加以排除。對(duì)每個(gè)標(biāo)本分A（21染色體）、B（18/13染色體）、C（X/Y染色體）三個(gè)體系進(jìn)行擴(kuò)增；每份檢測(cè)取1μl PCR產(chǎn)物和13.5μL甲酰胺、0.5μl GeneScanTM600 LIZ? Size standard v2.0（內(nèi)標(biāo)）混合，95℃變性5分鐘，放冰上至少1 min，將混合物置ABI3500Dx基因分析儀進(jìn)行上樣操作，用GeneMapper軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)收集和分析。

1.2.4 QF-PCR染色體非整倍體判斷 根據(jù)臨床生化協(xié)會(huì)/臨床分子遺傳協(xié)會(huì)（ACC/CMGS）規(guī)定判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：STR位點(diǎn)上等位基因擴(kuò)增后顯示為3個(gè)熒光峰，峰值面積比接近于1∶1∶1，可直接判斷為三體型。

若只顯示兩個(gè)峰，則計(jì)算兩個(gè)峰的峰面積比值，凡雙峰面積比值>1.8或者<0.65則可判定為三體。

正常雙峰面積比值區(qū)間為0.8-1.4，介于兩個(gè)區(qū)間之間的值無法判斷，需重新檢測(cè)。

每個(gè)染色體至少2個(gè) STR 位點(diǎn)能提供信息且為異常峰型，才能診斷此樣本為相應(yīng)染色體異常。

45，X診斷標(biāo)準(zhǔn)：所有的 X 染色體STR呈單峰[4]。

檢測(cè)所用STR位點(diǎn)、位置如下：

13號(hào)染色體標(biāo)記及位置：D13S305（13q13.3）、D13S628（13q31.3）、D13S634（13q21.32）、D13S742（13q12.12）。

18號(hào)染色體標(biāo)記及位置：D18S1002（18q11.2）、D18S386（18q22.1）、D18S391（18p11.31）、D18S535（18q12.3）。

21號(hào)染色體標(biāo)記及位置：21q11.2（21q11.2）、D21S1411（21q22.3）、D21S1412（21q22.2）、D21S1414（21q21.1）、D21S1433（21q21.1）。

XY特異性標(biāo)記及位置：DXS1187（Xq26.2）、DXS6809（Xq21.33）、DXS8377（Xq28）、DXS981（Xq13.1）、AMXY（Xp22.2/Yp11.2）。

2 結(jié)果

2.1 染色體核型分析結(jié)果。289例標(biāo)本中，檢出正常核型258例，21、18、13、X、Y染色體非整倍體31例。

2.2 QF-PCR結(jié)果。正常（46，XX或46，XY）有256例，異常有30例，分別為21三體15例、18三體5例、13三體1例，性染色體非整倍體6例（X0 2例，XXX 1例，XXX或XX/X0嵌合體1例，XXY1例，XYY1例），3例標(biāo)本存在母源污染。

2.3 兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致性為96.77%（30/31），異常檢測(cè)結(jié)果一致性100%，詳見表1。

表1 染色體核型分析與QF-PCR檢測(cè)結(jié)果比較

3 討論

染色體非整倍體是出生缺陷中的主要原因之一，最常見有唐氏綜合征，給家庭造成巨大的精神和經(jīng)濟(jì)壓力，對(duì)社會(huì)也是一種負(fù)擔(dān)。因此針對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)孕婦在孕期做相關(guān)檢查對(duì)預(yù)防染色體非整倍體是很有意義的。但是產(chǎn)前篩查結(jié)果為陽(yáng)性不代表相關(guān)疾病的發(fā)生，而是提示患病風(fēng)險(xiǎn)存在，且比正常陰性結(jié)果發(fā)生概率高。而結(jié)果提示陰性也不完全排除疾病的發(fā)展，僅代表發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)低[5]。

核型是指染色體組在有絲分裂中期的表型（數(shù)目、大小、形態(tài)特征等），對(duì)此進(jìn)行分析對(duì)于探討人類遺傳病的機(jī)制、物種親緣關(guān)系與進(jìn)化、遠(yuǎn)緣雜種的鑒定均有重要意義[6]。染色體核型能發(fā)現(xiàn)染色體結(jié)構(gòu)及數(shù)目異常，是染色體病檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)[7]。經(jīng)染色體核型分析，本研究的289例羊水標(biāo)本中檢出21、18、13、X、Y染色體非整倍體31例，正常核型258例。本研究應(yīng)用QF-PCR技術(shù)，通過對(duì)染色體上STR位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，正常（46，XX或46，XY）256例，異常30例（21三體15例、18三體5例、13三體1例），性染色體非整倍體6例（X0 2例，XXX 1例，XXX或XX/X0嵌合體1例，XXY1例，XYY1例），3例存在母源污染。QF-PCR在臨床上廣泛用于染色體非整倍體檢測(cè)，不僅有高度靈敏性，而且具有高準(zhǔn)確性和高特異性，在染色體非整倍體中具有較高的診斷率[8]。本研究將QF-PCR檢測(cè)結(jié)果與染色體核型分析檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，檢測(cè)結(jié)果一致性為96.77%，其中異常檢測(cè)結(jié)果一致性為100%，結(jié)果證實(shí)QF-PCR應(yīng)用于染色體非整倍體的診斷中有較高的準(zhǔn)確性。

綜上所述，在產(chǎn)前診斷中，QF-PCR技術(shù)可準(zhǔn)確快速檢出染色體非整倍體情況，雖只是一種篩查技術(shù)，但在實(shí)際應(yīng)用中可作為染色體核型分析的有效補(bǔ)充，在快速產(chǎn)前診斷中具有重要價(jià)值。