三種磁珠法核酸提取試劑在某呼吸道病毒檢測中的應(yīng)用效果比較

邢子偉，林艷艷，倫雪恩，譚翰清＊

（1.肇慶市醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，廣東 肇慶 526020；2.肇慶市疾病預(yù)防控制中心，廣東 肇慶 526060）

0 引言

核酸檢測是新型冠狀肺炎病原學(xué)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[1]，其檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、時效性嚴(yán)重地影響著我們防控措施及效果，特別是對應(yīng)檢盡檢的發(fā)熱病例需要在6 h出具報告，愿檢盡檢人群應(yīng)在12~24 h內(nèi)報告，核酸檢測報告需要快而準(zhǔn)。核酸提取試劑盒的質(zhì)量是影響熒光PCR檢測結(jié)果的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]。當(dāng)前我國部分省區(qū)以聯(lián)盟的形式開展核酸提取和檢測試劑的帶量集采[3]，不同品牌的提取試劑盒的市場價格均實現(xiàn)了大幅度的降低，使用單位需要加強(qiáng)核酸提取試劑的質(zhì)控。本研究評估三種磁珠法核酸提取試劑的提取效能和時效性，為保障新冠核酸檢測結(jié)果的準(zhǔn)確供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑。實時熒光PCR儀（美國賽默飛7500fast）、自動核酸提取儀（西安天隆NP968）、冷凍離心機(jī)（德國eppendorff）等；預(yù)分裝型核酸提取試劑盒（重慶中元，磁珠法），2019-ncov新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒（中山大學(xué)達(dá)安基因有限公司）；陽性質(zhì)控品（廣東省疾病預(yù)防控制中心提供）。

1.2 方法

1.2.1 測試樣本的制備與核酸提?。簩缁钚偷男鹿诓《娟栃再|(zhì)控品（原始Ct值約28）進(jìn)行梯度稀釋，制備成五個含有不同病毒濃度的樣本，各取200 μL分別加至三種不同品牌的磁珠法核酸提取試劑盒，96孔預(yù)分裝板的1和7列裂解孔，第6和12列核酸洗脫體積100 μL，分別在提取儀上按相應(yīng)使用說明書設(shè)置程序，歷經(jīng)裂解、吸附、洗滌和洗脫環(huán)節(jié)，完成自動提取。其中品牌A為重慶中元，其核酸提取試劑盒在提取儀的的程序設(shè)置僅需一步洗滌，總時長約10 min，見表1；另外兩個品牌B和C試劑盒在裂解吸附步驟后分別需洗滌2次和3次，總時長分別約20 min、30 min。

表1 品牌A核酸提取試劑盒運行程序的設(shè)置

1.2.2 實時熒光RT-PCR檢測：采用中山大學(xué)達(dá)安基因的2019-nCoV新型冠狀病毒熒光PCR試劑盒，反應(yīng)體積25μL，核酸模板5μL，反應(yīng)程序為：50℃逆轉(zhuǎn)錄15 min；95℃滅活15min；94℃變性15 s，55℃、45 s（末端收集熒光），45循環(huán)。Orf1ab/N/RNP內(nèi)參基因分別選擇“FAM”、“VIC”、“CY5”通道，淬滅基團(tuán)和校正均選“NONE”。結(jié)果判定以在陰性對照、陽性對照成立的條件下，各靶標(biāo)有“S”型擴(kuò)增曲線則判為陽性。

1.2.3 結(jié)果比較分析：分別對經(jīng)三種核酸提取試劑盒提取核酸的熒光PCR檢測效果比較，根據(jù)Ct值、擴(kuò)增效果圖、檢測靈敏度、提取步驟與時長等因素綜合比較。

2 結(jié)果

2.1 實時熒光RT-PCR檢測結(jié)果。5個稀釋梯度的模擬樣本分別經(jīng)A、B、C品牌磁珠法提取試劑盒提取，各自產(chǎn)物對同一種新冠熒光PCR試劑檢測靈敏度有差異。A品牌對5個稀釋梯度均有orf1ab/N雙靶基因擴(kuò)增陽性；B品牌對前4個稀釋梯度有orf1ab/N雙靶基因擴(kuò)增陽性，第5個稀釋梯度擴(kuò)增陰性；C品牌對前3個稀釋梯度均有orf1ab/N雙靶基因擴(kuò)增，第4個稀釋梯度僅有N靶基因均擴(kuò)增陽性，第5個稀釋梯度擴(kuò)增陰性。從擴(kuò)增圖效果來看，A、B、C品牌依次遞減，品牌A雙靶基因均呈典型“S”擴(kuò)增曲線，熒光強(qiáng)度均比另外兩個品牌的高（圖1）。

圖1 三種磁珠法核酸提取試劑對某呼吸道病毒熒光PCR結(jié)果比較圖

2.2 三種提取試劑綜合比較。從時間、操作步驟比較，重慶中元核酸提取試劑僅需3步驟、共約10 min完成核酸提取，所需時間最短、步驟最少；品牌B需7個步驟共約20 min完成；品牌C需9個步驟共約30 min完成。綜合比較結(jié)果可見品牌A總體效果占絕對優(yōu)勢，見表2。

表2 三種磁珠法核酸提取試劑盒總體效果比較

3 討論

近年來，實時熒光PCR方法依靠其快速、靈敏、特異等技術(shù)優(yōu)點，在MERS、SARS-2、寨卡病毒等新發(fā)傳染病的快速診斷方面得到了廣泛的應(yīng)用[4-5]。影響熒光PCR檢測結(jié)果的因素除了引物探針、反應(yīng)體系等自身內(nèi)在原因以外，還有一個核酸提取關(guān)鍵影響環(huán)節(jié)[6]。目前主要的核酸提取方法有濾膜法、磁珠法、trizol法等，各有優(yōu)勢，其中磁珠法易于實現(xiàn)自動化、提取速度快，在新發(fā)呼吸道傳染病疫情防控和診療中得到更為廣泛的應(yīng)用，催生了核酸提取試劑IVD產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展。為保證檢測質(zhì)量，國務(wù)院聯(lián)防聯(lián)控發(fā)布的醫(yī)療機(jī)構(gòu)核酸檢測手冊（第二版）明確對核酸提取試劑的質(zhì)量控制要求，在使用前需做好性能驗證。

核酸提取試劑盒的性能驗證指標(biāo)主要有回收率和提取純度測試，如A260/280比值法，通過紫外分光光度計測試的A260/280比值法可以直接計算其加標(biāo)回收率[7-8]。而對于新發(fā)傳染病來說，在初期難獲得其定標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，在實際檢測工作中使用梯度稀釋的陽性標(biāo)本測試不同品牌的核酸提取試劑盒，使用同一品牌的熒光PCR試劑盒測試相應(yīng)提取產(chǎn)物，比較其檢測下限、擴(kuò)增曲線、時效等參數(shù)，可快速評價不同品牌核酸提取試劑盒的效果。在本次A、B、C三家不同品牌核酸提取試劑的測試比對試驗中，核酸提取質(zhì)量是有差異的，品牌A、B、C的提取產(chǎn)物的靈敏度測試依次遞減，品牌A僅需10 min分鐘即可完成高效提取，且五個稀釋梯度均擴(kuò)增出來，“S”型曲線典型。其快速高效的優(yōu)勢在反應(yīng)程序上的僅需一步洗滌，其核心的磁珠修飾、裂解液和洗滌液配方的技術(shù)創(chuàng)新或改進(jìn)在當(dāng)中發(fā)揮重要的作用，使去除PCR抑制物、回收的核酸純度得到很好的保證，比另外兩種品牌的磁珠法試劑盒更快速、性能更為優(yōu)越。因此，在新發(fā)傳染病的實時熒光PCR檢測中，除了關(guān)注其技術(shù)本身因素外，更應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)核酸提取試劑的質(zhì)量評估，保障檢測體系的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。