舒血寧對(duì)慢性腎衰竭透析大鼠的心肌保護(hù)作用及對(duì)JAK2/STAT3信號(hào)通路的影響

胡春艷，劉建林，李方曉

慢性腎衰竭是指各種原因造成的慢性進(jìn)行性腎實(shí)質(zhì)損害，表現(xiàn)為腎臟明顯萎縮、功能受損等，發(fā)病率較高[1]。在我國(guó)，慢性腎衰竭的發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)，已嚴(yán)重威脅人類的身體健康。目前治療慢性腎衰竭的主要手段為腎移植、血液透析和腹膜透析，其中腹膜透析能保護(hù)腎臟功能不受損害，適用于凝血功能較差的病人，操作簡(jiǎn)單，但長(zhǎng)期腹膜透析的病人易出現(xiàn)心肌損傷、心肌纖維化和毛細(xì)血管減少，進(jìn)而導(dǎo)致病人發(fā)生心肌病和心律失常等并發(fā)癥，因此，找到減少腎透析心肌損傷等并發(fā)癥的方法尤為重要[2-3]。舒血寧是銀杏葉提取物，成分包括銀杏葉內(nèi)酯、銀杏新內(nèi)酯及銀杏葉黃酮苷，具有抗心肌缺血、抗心律失常及抗動(dòng)脈硬化等多種生物學(xué)作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，舒血寧對(duì)缺血再灌注大鼠心肌損傷有保護(hù)作用[5]，但對(duì)于慢性腎衰竭大鼠心肌細(xì)胞的影響及作用機(jī)制研究較少，因此，本研究探討舒血寧對(duì)慢性腎衰竭大鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，并進(jìn)一步探討其機(jī)制，為臨床慢性腎衰竭透析病人心肌損傷相關(guān)并發(fā)癥的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)健康SD雄性大鼠購(gòu)自廣東永諾生物科技有限公司，8周齡，體質(zhì)量250～300 g，生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(粵)2018-0186。所有大鼠均在同一飼養(yǎng)條件下喂養(yǎng)，室內(nèi)溫度控制在(25±1)℃，相對(duì)濕度為(55±10)%，光照條件為12 h明暗交替。

1.1.2 藥物、主要試劑和儀器 舒血寧片(純度≥99%，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20027949，江蘇揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn))，4.25%葡萄糖透析液(濟(jì)生醫(yī)藥生技股份有限公司)，香豆霉素(純度≥99%，湖北信康醫(yī)藥化工有限公司生產(chǎn))，戊巴比妥鈉(純度≥99%，德國(guó)Serva公司生產(chǎn))，40%中性甲醛(北京索萊寶科技有限公司)，Trizol試劑盒、SYBR Premix Ex Taq試劑盒、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒均購(gòu)自北京伯樂(lè)生命科學(xué)發(fā)展有限公司，兔抗鼠酪氨酸蛋白激酶2(tyrosine protein kinase 2，JAK2)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、天冬氨酸蛋白酶(Caspase-3)mRNA(一抗)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(二抗)均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，BSF-40光學(xué)顯微鏡(上海巴拓儀器有限公司)，T100實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，WD-9413A凝膠成像系統(tǒng)(北京六一儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 慢性腎衰竭透析大鼠模型制備 首先，采用5/6腎切除法[6]建立慢性腎衰竭大鼠模型，將40只大鼠采用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，仰臥位固定在手術(shù)臺(tái)上，從距離左脊肋骨1.5 cm處作約2.0 cm的切口，使左腎臟暴露，分離腎周脂肪，結(jié)扎動(dòng)靜脈血管，用眼科剪將左腎上、下級(jí)各切除1/3，無(wú)菌紗布止血，當(dāng)切除面無(wú)流動(dòng)性血液時(shí)復(fù)位剩余左腎，縫合。1周后，再將大鼠用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，仰臥位固定在手術(shù)臺(tái)上，從距離右脊肋骨1.5 cm處作約2.0 cm的切口，使右腎臟暴露，并與右腎門處結(jié)扎腎蒂，切除右腎。兩次手術(shù)縫合前每只大鼠均給予腹腔注射青霉素1×105U，每日1次，連續(xù)3 d，預(yù)防感染。于術(shù)后6周，大鼠眼眶后靜脈叢采血1～2 mL，檢測(cè)大鼠血肌酐和尿素氮值，以血肌酐、尿素氮值大于正常值2倍為造模成功。之后取建模成功大鼠，采用腹膜透析建立慢性腎衰竭透析大鼠模型，腹腔內(nèi)插入腹膜透析管，腹腔注射4.25%葡萄糖透析液，每日1次，連續(xù)4周。放置腹膜透析管后，采用肝素沖洗，若腹膜透析管順暢，則造模成功。本實(shí)驗(yàn)研究過(guò)程中6只大鼠血肌酐和尿素氮值低于正常值2倍，2只大鼠腹膜透析管不順暢，最后共32只大鼠建模成功。

1.2.2 分組及干預(yù) 取50只大鼠，40只建立慢性腎衰竭透析大鼠模型，剩余10只作為假手術(shù)組，假手術(shù)組僅分離腎周圍脂肪組織，不切除腎臟，其他操作均同造模大鼠。取建模成功32只大鼠，隨機(jī)分為模型組、舒血寧低劑量組、舒血寧高劑量組和舒血寧高劑量+抑制劑組，每組8只。慢性腎衰竭透析大鼠模型建立成功后，舒血寧低劑量組腹膜透析后腹腔注射5 mg/kg舒血寧2 mL(溶于生理鹽水)，舒血寧高劑量組腹膜透析后腹腔注射10 mg/kg舒血寧2 mL(溶于生理鹽水)，舒血寧高劑量+抑制劑組腹膜透析后腹腔注射10 mg/kg舒血寧(溶于生理鹽水)和JAK2/STAT3信號(hào)通路激活劑香豆霉素2 mg/kg(溶于生理鹽水)2 mL，假手術(shù)組和模型組腹腔注射等量生理鹽水，每日1次，持續(xù)4周。

1.2.3 組織取材 取干預(yù)4周后各組大鼠，1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，剖開(kāi)胸腔，取出心臟，取左心室心肌組織，部分-80 ℃保存，部分置于40%中性甲醛中固定。

1.2.4 心肌組織中SOD活性與MDA含量測(cè)定 取-80 ℃保存的心肌組織，制成心肌組織懸液，1 500 r/min離心5 min，離心半徑為10 cm，取上清，采用羥胺法和比色法分別測(cè)定SOD活性及MDA含量，具體步驟參考酶活性試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.5 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察大鼠心肌組織的病理學(xué)變化 取40%多聚甲醛中固定的心肌組織，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后進(jìn)行冠狀切片，切片厚度約為4 μm，后行HE染色，切片用中性樹(shù)膠封固，之后晾干，置光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選5個(gè)不同視野拍照，觀察病理變化。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況 取-80 ℃保存的心肌組織，加入預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，研磨至勻漿，于100目銅網(wǎng)上過(guò)濾并收集濾液，4℃，1 000 r/min離心10 min，離心半徑為10 cm，棄上清，預(yù)冷的PBS清洗3次，后加入適量Bingding buffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/mL，之后取100 μL細(xì)胞懸液，加入10 μL Annexin V-FITC、5 μL碘化丙啶(PI)充分混勻，避光孵育15 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率。

1.2.7 RT-qPCR檢測(cè)大鼠心肌組織中JAK2、STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量 取-80 ℃保存的心肌組織，Trizol試劑盒提取組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA模版，參照SYBR Premix Ex Taq試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行設(shè)定反應(yīng)體系，后利用RT-qPCR儀器進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火35 s，72 ℃延伸40 s，設(shè)置35個(gè)循環(huán)。采用β-actin為內(nèi)參基因，2-△△CT法計(jì)算JAK2、STAT3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.8 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)大鼠心肌組織中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量 取-80 ℃保存的心肌組織，根據(jù)蛋白試劑盒提取組織蛋白質(zhì)，BCA蛋白試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。之后將提取的蛋白樣品加入2倍加樣緩沖液，加熱煮沸10 min使其變性，上樣到SDS-聚丙烯酰胺凝膠加樣孔中分離蛋白，電壓設(shè)置為120 V，后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，5%牛血清蛋白室溫封閉PVDF膜2 h，加入1∶1 000稀釋的一抗中，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST緩沖液清洗3次，加入1∶3 000稀釋的二抗中，室溫孵育1 h，TBST清洗3次，顯影后，置凝膠成像系統(tǒng)中拍照記錄，用目的蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌組織中SOD活性及MDA含量比較 各組SOD活性及MDA含量比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組、舒血寧低劑量組、舒血寧高劑量組及舒血寧高劑量+抑制劑組SOD活性降低，MDA含量增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，舒血寧高劑量+抑制劑組、舒血寧低劑量組、舒血寧高劑量組SOD活性升高，MDA含量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與舒血寧低劑量組、舒血寧高劑量+抑制劑組比較，舒血寧高劑量組SOD活性升高，MDA含量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠心肌組織中SOD活性及MDA含量比較(±s)

2.2 各組大鼠心肌組織的病理學(xué)情況 假手術(shù)組可見(jiàn)心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，形態(tài)完整，細(xì)胞胞漿均勻紅染；模型組可見(jiàn)大量心肌細(xì)胞明顯腫脹變形、結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞染色呈藍(lán)黑色；舒血寧干預(yù)后上述病理變化均有所減輕，且舒血寧高劑量組減輕較舒血寧低劑量組較為明顯；在舒血寧高劑量干預(yù)基礎(chǔ)上加入香豆霉素后，上述病理變化加重，但仍較模型組減輕。詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠HE染色結(jié)果(×200)

2.3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較 各組心肌細(xì)胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組、舒血寧低劑量組、舒血寧高劑量組及舒血寧高劑量+抑制劑組心肌細(xì)胞凋亡率增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，舒血寧高劑量+抑制劑組、舒血寧低劑量組、舒血寧高劑量組心肌細(xì)胞凋亡率降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與舒血寧低劑量組、舒血寧高劑量+抑制劑組比較，舒血寧高劑量組心肌細(xì)胞凋亡率降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表3及圖2。

表3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較(±s) 單位：%

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組心肌細(xì)胞凋亡率

2.4 各組大鼠心肌組織中JAK2、STAT3、Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 各組JAK2 mRNA、STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組、舒血寧低劑量組、舒血寧高劑量組及舒血寧高劑量+抑制劑組Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，舒血寧高劑量+抑制劑組、舒血寧低劑量組、舒血寧高劑量組Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與舒血寧低劑量組、舒血寧高劑量+抑制劑組比較，舒血寧高劑量組Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表4。

表4 各組JAK2、STAT3、Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

2.5 各組大鼠心肌組織中Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比較 各組Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組、舒血寧低劑量組、舒血寧高劑量組及舒血寧高劑量+抑制劑組Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，舒血寧高劑量+抑制劑組、舒血寧低劑量組、舒血寧高劑量組Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與舒血寧低劑量組、舒血寧高劑量+抑制劑組比較，舒血寧高劑量組Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表5及圖3。

表5 各組Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比較(±s)

圖3 各組大鼠心肌組織中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

腹膜透析是治療慢性腎衰竭病人的主要手段，但經(jīng)腹膜透析治療后易出現(xiàn)心肌病變、心肌梗死，進(jìn)而引發(fā)心力衰竭等癥狀，因此，找到減少慢性腎衰竭透析病人心肌損傷等并發(fā)癥的方法尤為重要[7]。舒血寧注射液是銀杏提取物制成的水溶液，具有擴(kuò)張心腦血管及抑制氧自由基生成等作用，被廣泛用于治療心肌缺血及腦血管疾病的輔助治療，因此，研究舒血寧對(duì)慢性腎衰竭透析引起的心肌損傷有重要意義[8]。氧化應(yīng)激在慢性腎衰竭透析過(guò)程中起重要作用，SOD是機(jī)體重要的抗氧化酶，具有清除氧自由基、維持細(xì)胞正常功能的作用；MDA是介導(dǎo)自由基損傷的關(guān)鍵物質(zhì)，其過(guò)度積累會(huì)引發(fā)細(xì)胞內(nèi)氧化還原系統(tǒng)失衡，自由基堆積，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞、細(xì)胞功能缺失、細(xì)胞凋亡及心肌收縮能力下降等[9-10]。舒血寧是一種較強(qiáng)的自由基清除劑，可清除體內(nèi)自由基，抑制過(guò)氧化反應(yīng)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，舒血寧能增強(qiáng)心肌缺血大鼠心肌組織中SOD活性，降低MDA含量，進(jìn)而降低氧自由基對(duì)心肌的損傷[11]。邱占軍[12]研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物能降低應(yīng)激狀態(tài)下大鼠心肌細(xì)胞的氧化損傷，進(jìn)而改善心肌損傷大鼠的心臟功能。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，舒血寧低、高劑量組SOD活性增強(qiáng)，MDA含量降低，心肌細(xì)胞凋亡率降低。HE染色結(jié)果顯示，使用舒血寧后心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂及腫脹程度減輕，且與劑量呈一定程度的依賴性，說(shuō)明舒血寧能增強(qiáng)SOD活性、降低MDA含量和心肌細(xì)胞凋亡率，進(jìn)而降低慢性腎衰竭透析引起的心肌損傷。

JAK2/STAT3信號(hào)通路參與多種細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等[13]。研究證實(shí)，JAK2/STAT3信號(hào)通路在心肌細(xì)胞的損傷中起關(guān)鍵作用，抑制該通路能明顯降低脂質(zhì)化過(guò)氧化產(chǎn)物和增強(qiáng)線粒體抗氧化酶的生成，進(jìn)而降低細(xì)胞凋亡，減輕心肌細(xì)胞損傷[14]。研究發(fā)現(xiàn)，抵當(dāng)湯可通過(guò)抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路改善大鼠心肌損傷程度[15]。李玉慈等[16]研究發(fā)現(xiàn)，蘿卜硫素可抑制JAK2和STAT3蛋白磷酸化，降低氧化應(yīng)激損傷，從而達(dá)到對(duì)大鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。Caspase-3是Caspase家族中關(guān)鍵的效應(yīng)分子，主要負(fù)責(zé)凋亡途徑最后的執(zhí)行階段[17]。銀杏酮酯中含有銀杏內(nèi)酯成分，研究發(fā)現(xiàn)，銀杏酮酯能降低缺血再灌注大鼠心肌組織中Caspase-3的表達(dá)，進(jìn)而降低心肌細(xì)胞的凋亡率，對(duì)大鼠心肌細(xì)胞起保護(hù)作用[18]，與本研究結(jié)果相似。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，舒血寧低、高劑量組Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值均降低，且隨濃度升高降低越明顯，在舒血寧高劑量組中加入JAK2/STAT3信號(hào)通路抑制劑后，SOD活性降低，MDA含量升高，心肌細(xì)胞凋亡率升高，Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值較舒血寧低、高劑量組升高，但仍低于模型組，說(shuō)明舒血寧對(duì)慢性腎衰竭透析大鼠具有心肌保護(hù)作用，可能通過(guò)下調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)水平及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值發(fā)揮作用。

綜上所述，舒血寧對(duì)慢性腎衰竭透析大鼠心肌具有保護(hù)作用，可能通過(guò)抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路及Caspase-3蛋白表達(dá)發(fā)揮調(diào)控作用，下一步應(yīng)更深入地研究舒血寧對(duì)慢性腎衰竭透析大鼠的調(diào)控機(jī)制，為臨床治療慢性腎衰竭透析引起的心肌損傷提供參考。