CD4+CD45RClowTreg在大鼠肝移植免疫耐受中的調(diào)節(jié)作用研究

周林 李瀚 趙陽(yáng) 汪京 賈亞男 張欣雪 李先亮 郎韌 賀強(qiáng)

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）是一種具有負(fù)向免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞亞群，在移植術(shù)后免疫耐受的形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1-2]。目前，大多數(shù)關(guān)于Treg的研究主要集中在經(jīng)典的CD4+CD25+Treg亞群，但越來(lái)越多的證據(jù)表明CD8+Treg在維持機(jī)體免疫平衡以及誘導(dǎo)免疫耐受方面也扮演關(guān)鍵的角色[3-4]。首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院肝膽胰脾外科團(tuán)隊(duì)通過(guò)長(zhǎng)期研究，證實(shí)CD8+CD45RClowTreg是促使肝移植免疫耐受發(fā)生的關(guān)鍵細(xì)胞亞群[5-8]。在研究過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn)以CD45RC為分類標(biāo)準(zhǔn)的CD4+T細(xì)胞的亞群即CD4+T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）αβ+CD45RClowT細(xì)胞（CD4+CD45RClowTreg）在不同肝移植模型中表達(dá)差異顯著，且與Treg、漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（plasmacytoid dendritic cell，pDC）的表達(dá)具有相關(guān)性。關(guān)于CD4+CD45RClowTreg研究早在20世紀(jì)90年代就開始，但是研究一直處于落后狀態(tài)，且多數(shù)研究集中于心臟移植與腎移植[9-11]，關(guān)于肝移植方面的報(bào)道較少[12]。因而，本文旨在通過(guò)對(duì)肝移植免疫耐受與急性排斥反應(yīng)（acute rejection，AR）大鼠中不同免疫細(xì)胞亞群的變化進(jìn)行分析，結(jié)合組織病理學(xué)檢測(cè)，探討CD4+CD45RClowTreg作為免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞的潛能及其在免疫耐受發(fā)生中的作用，為豐富Treg亞群網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)Brown Norway（BN）大鼠與Lewis大鼠各15只，體質(zhì)量200～220 g，均購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證：SCXK-（京）2016-0006。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

熒光素標(biāo)記的單克隆抗體異硫氰酸苯酯（phenylisothiocyanate，PITC）/brilliant violet（BV）-421-CD3、別藻藍(lán)蛋白（allophycocyanin，APC）-CD4、異硫氰酸熒光素（ fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）-CD8、多甲藻黃素-葉綠素-蛋白質(zhì)復(fù)合物（peridinin-chlorophyll-protein complex，PerCP）-TCR-αβ、PE-CD45RC、PE-CD103、APC-主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC） Ⅱ及同型對(duì)照抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司，Lysing buffer 購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司，F(xiàn)ACS Canto Ⅱ流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司，免疫組織化學(xué)（免疫組化）CD4、CD45RC與CD103單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司和美國(guó)CST公司，二抗試劑盒PV-9000購(gòu)自美國(guó)OriGene公司，3,3'-二氨基聯(lián)苯胺（3,3'-diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.3 模型構(gòu)建與標(biāo)本收集

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，以BN大鼠為供體，Lewis大鼠為受體的肝移植可以自發(fā)產(chǎn)生免疫耐受；而以Lewis大鼠為供體，BN大鼠為受體肝移植會(huì)發(fā)生明顯的AR[13]。本研究采用“雙袖套法”建立BN→Lewis的大鼠肝移植耐受模型（耐受組，n=6）和Lewis→BN的大鼠肝移植AR模型（AR組，n=6），同時(shí)設(shè)置假手術(shù)組（對(duì)照組，n=6）作為對(duì)照，BN大鼠與Lewis大鼠各3只。術(shù)后7 d采集AR組大鼠外周血和組織標(biāo)本，術(shù)后100 d采集耐受組大鼠外周血和組織標(biāo)本，分別用于T細(xì)胞亞群分析和組織病理學(xué)分析。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1 肝組織病理學(xué)檢測(cè) 提取各組大鼠的肝組織，甲醛固定、脫水、包埋，切片后進(jìn)行蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織細(xì)胞形態(tài)并收集圖像。

1.4.2 大鼠外周血T細(xì)胞亞群和pDC分析 分別取100 μL外周血檢測(cè)T細(xì)胞亞群（加入5 μL PITC/BV-421-CD3、APC-CD4、FITC/PE-CD8）、CD4+Treg與 CD8+Treg（加入 5 μ L APC-CD4、FITC/PE-CD8、Percp-TCR-αβ、PE-CD45RC）、pDC（加入 5 μ L PE-CD103、APC-MHC Ⅱ），加入相應(yīng)的抗體后充分混勻，室溫暗室孵育15 min，加入1×Lysing繼續(xù)孵育15 min，加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS），180×g離心6 min，棄上清，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.3 移植肝和脾臟T細(xì)胞亞群和pDC分析 將脾臟與肝臟組織分別充分研磨，以200目篩網(wǎng)過(guò)濾，以Ficoll法4 ℃、180×g離心35 min，提取單個(gè)核細(xì)胞，加入PBS吹打混勻，180×g離心6 min，棄上清，加入PBS，分別取100 μL檢測(cè)CD4+Treg、CD8+Treg、pDC，抗體染色同外周血，孵育結(jié)束后，加入PBS，180×g離心6 min，棄上清，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.4 pDC與CD4+CD45RClowTreg相關(guān)性分析 在上述流式檢測(cè)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Pearson檢驗(yàn)對(duì)外周血、移植肝及脾臟中pDC與CD4+CD45RClowTreg的表達(dá)進(jìn)行整體分析。

1.4.5 移植肝和脾臟CD4、CD45RC、CD103表達(dá)情況 移植肝組織、脾臟組織石蠟切片后常規(guī)二甲苯脫蠟、水洗；3%過(guò)氧化氫滅活后抗原修復(fù)；自然冷卻后5%羊血清封閉30 min；一抗4 ℃濕盒孵育過(guò)夜；相應(yīng)二抗室溫孵育30 min；DAB顯色，顯微鏡下觀察并采集圖像，陽(yáng)性細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)染色呈棕褐色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠移植肝組織病理學(xué)檢查結(jié)果

以BN為供體，Lewis為受體的耐受組大鼠70%～80%可以產(chǎn)生耐受，存活時(shí)間超過(guò)100 d，以Lewis為供體，BN為受體的AR組大鼠術(shù)后產(chǎn)生明顯的AR，存活時(shí)間7～14 d，病理學(xué)主要表現(xiàn)為移植肝炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和組織結(jié)構(gòu)紊亂（圖1）。

圖1 各組大鼠肝組織病理學(xué)染色結(jié)果（HE，×200）Figure 1 Pathological staining results of liver tissues of rats in each group

2.2 各組大鼠外周血T細(xì)胞亞群表達(dá)情況

各組大鼠外周血T細(xì)胞亞群的流式細(xì)胞圖見(jiàn)圖2。與對(duì)照組大鼠比較，耐受組和AR組大鼠CD4+T細(xì)胞亞群的表達(dá)水平均升高（41.7±1.9比65.6±7.7、82.0±3.5，均為P＜0.05）；與對(duì)照組比較，AR組大鼠CD8+T細(xì)胞亞群的表達(dá)水平下降（21.2±1.8比 14.2±1.3，P＜0.05）。AR組大鼠CD4+/CD8+T細(xì)胞比值較對(duì)照組大鼠升高（5.4±0.9比2.0±0.2，P＜0.05），耐受組大鼠與對(duì)照組大鼠比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與AR組大鼠比較，耐受組大鼠的CD4+CD25+Treg、CD8+Treg表達(dá)水平均升高（均為P＜0.05），且CD4+CD25+Treg與CD8+Treg表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.742，P=0.022）。

圖2 各組大鼠外周血T細(xì)胞亞群的流式細(xì)胞圖Figure 2 Flow cytometry of T cell subsets in peripheral blood of rats in each group

2.3 各組大鼠外周血、移植肝、脾臟CD4+CD45RClow Treg和CD8+CD45RClowTreg表達(dá)情況

AR組大鼠外周血CD4+CD45RChighT細(xì)胞水平高于耐受組大鼠和對(duì)照組大鼠（44.6±15.6比21.0±9.0、16.8±1.2，均為P＜0.05）；耐受組大鼠與對(duì)照組大鼠比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

與對(duì)照組大鼠比較，AR組與耐受組大鼠移植肝、脾臟CD4+CD45RClowTreg表達(dá)水平均升高（均為P＜0.05）；與AR組大鼠比較，耐受組大鼠脾臟CD4+CD45RClowTreg表達(dá)水平升高（P＜0.05，圖3A）。與對(duì)照組大鼠比較，耐受組外周血CD8+CD45RClowTreg表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與AR組大鼠比較，耐受組大鼠外周血、移植肝、脾臟CD8+CD45RClowTreg表達(dá)水平均升高（均為P＜0.05，圖3B）。

與對(duì)照組大鼠比較，耐受組大鼠外周血CD4+CD45RClowTreg/CD4+T比值變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），AR組大鼠外周血CD4+CD45RClowTreg/CD4+T比值下降（P＜0.05）；與AR組大鼠比較，耐受組外周血CD4+CD45RClowTreg/CD4+T比值升高（P＜0.05，圖3C）。與對(duì)照組和AR組大鼠比較，耐受組大鼠外周血CD8+CD45RClowTreg/CD8+T比值升高（均為P＜0.05，圖3C）；AR組大鼠與對(duì)照組大鼠比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 各組大鼠CD4+CD45RClowTreg、CD8+CD45RClowTreg分析結(jié)果Figure 3 Analysis results of CD4+CD45RClowTreg and CD8+CD45RClowTreg of rats in each group

2.4 各組大鼠外周血、移植肝、脾臟pDC的表達(dá)及其與CD4+CD45RClowTreg的相關(guān)性分析

與對(duì)照組和AR組大鼠比較，耐受組大鼠外周血、移植肝、脾臟中pDC的表達(dá)水平均升高（均為P＜0.05，圖4A～C，E）；AR組大鼠與對(duì)照組大鼠比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＞0.05）。對(duì)外周血、移植肝與脾臟中CD4+CD45RClowTreg與pDC的表達(dá)水平進(jìn)行整體相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CD4+CD45RClowTreg與pDC表達(dá)水平的變化呈正相關(guān)（r=0.506，P=0.016，圖4D）。

圖4 各組大鼠pDC表達(dá)的差異性分析Figure 4 Differential analysis of pDC expression of rats in each group

2.5 大鼠移植肝和脾臟CD4、CD45RC、CD103的表達(dá)情況

耐受組大鼠移植肝和脾臟CD4、CD45RC、CD103的表達(dá)均增多，主要集中在匯管區(qū)與生發(fā)中心；而AR組大鼠移植肝CD4、CD45RC的表達(dá)雖增多，但肝組織結(jié)構(gòu)紊亂、小葉結(jié)構(gòu)消失，且CD103表達(dá)降低 ；AR組大鼠脾臟CD4、CD45RC、CD103表達(dá)均降低，且生發(fā)中心結(jié)構(gòu)紊亂（圖5）。

3 討 論

Treg是一種具有負(fù)向免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞亞群，在器官移植術(shù)后免疫耐受的形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2,14-15]。通過(guò)藥物、細(xì)胞因子或者納米修飾技術(shù)制備Treg過(guò)繼回輸是誘導(dǎo)免疫耐受發(fā)生的常用手段，研究主要集中在CD4+CD25+Treg。近年來(lái)，關(guān)于CD8+CD45RClowTreg的研究逐步被重視，其在移植免疫耐受中的調(diào)節(jié)作用有望成為突破免疫耐受誘導(dǎo)的新方向[5-6,16-17]。與CD4+CD25+Treg分類不同，依據(jù)CD45RC分子是否表達(dá)作為區(qū)分T細(xì)胞是否激活的標(biāo)準(zhǔn)，能精確篩選出負(fù)向調(diào)節(jié)效應(yīng)的CD8+Treg，因?yàn)镕oxp3缺失或表達(dá)陰性的T細(xì)胞亞群中能并不能排除CD8+Treg的存在[18]。

西班牙學(xué)者于1994年報(bào)道CD45RC低表達(dá)為T細(xì)胞分化和激活的表面標(biāo)志物[19]，隨后不斷有研究證實(shí)CD45RC可以作為區(qū)分大鼠CD8+Treg的表面標(biāo)志物[20]；我中心在大鼠同種異體原位肝移植、心臟免疫耐受誘導(dǎo)中證實(shí)，CD45RClowTreg顯著升高，并聚集移植物局部[5-8]。因而，目前CD45RC-/low被認(rèn)為是鑒定CD8+Treg的主要表面標(biāo)志物?；谝陨系睦碚摵突A(chǔ)，我們?cè)O(shè)想按照CD8+Treg的劃分標(biāo)準(zhǔn)，是否以CD45RC-/low區(qū)分的TCRαβ+CD4+T細(xì)胞同樣具有Treg的調(diào)節(jié)作用？其變化趨勢(shì)如何？有待進(jìn)一步探討。

關(guān)于CD4+CD45RClow/highT細(xì)胞的研究最早可以追溯到20世紀(jì)90年代[12]，有研究認(rèn)為CD4+CD45RClowTreg具有輔助性T細(xì)胞（helper T cell，Th）2的活性，可促進(jìn)移植心臟存活，而CD4+CD45RChighT細(xì)胞產(chǎn)生的白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-2與干擾素（interferon，IFN）-γ可誘導(dǎo)移植物抗宿主?。╣raft-versus-host disease，GVHD）[9]。本研究發(fā)現(xiàn)AR組大鼠CD4+CD45highT細(xì)胞的水平顯著升高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。在骨髓移植GVHD的研究中證實(shí)同種反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞中CD45RChighT細(xì)胞促進(jìn)急、慢性GVHD的發(fā)生，而選擇性回輸CD45RClowTreg可以明顯改善移植后免疫重建，無(wú)誘導(dǎo)GVHD的風(fēng)險(xiǎn)[10-11]，過(guò)繼回輸供體特異性輸血（donor-specific blood transfusion，DST）處理的CD45RClowT細(xì)胞可以延長(zhǎng)移植肝的存活[12]，這些均提示CD4+CD45RClowTreg具有負(fù)向免疫調(diào)節(jié)作用。然而過(guò)去20年間，關(guān)于CD4+CD45RClowTreg的研究進(jìn)展依舊緩慢，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道少。新近研究認(rèn)為，移植前CD4+CD45RChighT細(xì)胞和CD8+CD45RChighT細(xì)胞表達(dá)水平與腎移植術(shù)后AR相關(guān)[11,21]，而關(guān)于CD4+CD45RClowTreg亞群在肝移植中的作用目前很少報(bào)道。

表達(dá)低水平CD45RC的T細(xì)胞優(yōu)先分泌調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子，并含有Treg亞群[22-23]，目前已證實(shí)，CD8+T細(xì)胞高表達(dá)CD45RC與排斥反應(yīng)有關(guān)，低表達(dá)與誘導(dǎo)免疫耐受有關(guān)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)耐受組大鼠外周血CD8+Treg的水平顯著升高，且與經(jīng)典的CD4+CD25+Treg變化呈正相關(guān)。為了進(jìn)一步明確CD45RClowCD4+T細(xì)胞亞群的情況，我們分析了CD4+/CD8+T細(xì)胞的表達(dá)情況，CD4+和CD8+T細(xì)胞在排斥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，前者分泌Th1介導(dǎo)或誘導(dǎo)排斥反應(yīng)發(fā)生，后者以攻擊、破壞組織為主[19,24-25]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然耐受組大鼠CD4+和CD8+T細(xì)胞均升高，但CD4+/CD8+T細(xì)胞比值與正常大鼠一致，而AR組大鼠因?yàn)镃D8+T細(xì)胞的顯著減少，CD4+/CD8+T細(xì)胞比值升高。因此，我們認(rèn)為維持T細(xì)胞亞群的平衡是保護(hù)移植物生存的關(guān)鍵，CD8+T細(xì)胞的減少，可從側(cè)面反應(yīng)CD8+Treg處于低表達(dá)狀態(tài)。

我們分析發(fā)現(xiàn)，耐受組CD4+CD45RClowTreg/CD4+T比值高于AR組，與CD8+Treg的變化一致，提示CD4+CD45RClowTreg所占的比例高低是影響免疫耐受與排斥反應(yīng)發(fā)生的關(guān)鍵，而非單純的表達(dá)水平高低。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，CD4+CD45RClowTreg除與CD8+Treg的變化一致，同時(shí)與耐受組大鼠pDC的變化一致，相關(guān)性分析提示兩者呈正相關(guān)，pDC是目前認(rèn)為具有誘導(dǎo)耐受潛能的樹突狀細(xì)胞亞群，CD103是可以用來(lái)區(qū)分pDC的表面標(biāo)記，其可以誘導(dǎo)Treg的分化與產(chǎn)生[26-27]，CD4+CD45RClowTreg與pDC變化關(guān)系，還體現(xiàn)在免疫組化染色中CD4、CD45RC、CD103變化的一致性，提示其在肝移植免疫耐受的誘導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，CD45RC區(qū)分的CD4+CD45RClowTreg與CD8+Treg類似，是一群具有負(fù)向免疫調(diào)節(jié)功能參與肝移植免疫耐受誘導(dǎo)的CD4+Treg亞群，該細(xì)胞與CD8+CD5RClowTreg及pDC等構(gòu)成免疫耐受誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，共同發(fā)揮免疫負(fù)向調(diào)節(jié)作用。本研究?jī)H是組織細(xì)胞水平的變化結(jié)果，關(guān)于CD4+CD45RClowTreg參與調(diào)節(jié)免疫耐受的分子機(jī)制以及其對(duì)效應(yīng)性T細(xì)胞亞群尤其是CD4+T細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)是我們下一步研究的方向和內(nèi)容。