骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對小鼠缺血-再灌注急性腎損傷中IL-10和TNF-α表達(dá)的影響

藺晨雨 陳文 馬錫慧 孔祥瑞 樊文梅 韓永 肖漓 石炳毅

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是常見的由多種病因引起的腎功能急性下降綜合征[1-2]。文獻(xiàn)報道，外科手術(shù)引起的AKI是院內(nèi)病死率高的主要原因之一[3-5]，特別在腎移植術(shù)后，缺血-再灌注AKI（ischemia-reperfusion AKI，IR-AKI）如果得不到及時干預(yù)，會引起移植物功能延遲恢復(fù)或失功[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，缺血-再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）是一種系統(tǒng)性炎癥性疾病，炎癥過程中細(xì)胞因子是促炎反應(yīng)和抑炎反應(yīng)動態(tài)平衡的物質(zhì)基礎(chǔ)，腎IRI的修復(fù)與促炎因子和抑炎因子的生成、釋放相關(guān)，炎癥消退后腎組織得以修復(fù)[8]。其中白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-10是一種具有多效性的細(xì)胞因子，由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、B細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、角化細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞（helper T cell，Th）1等多種細(xì)胞分泌[9]。IL-10可減輕不同病理生理?xiàng)l件下的組織損傷，但內(nèi)源性IL-10在腎IRI修復(fù)中的作用報道少見[10]。腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α屬于TNF超家族，是由單核細(xì)胞衍生的細(xì)胞因子，生物學(xué)活性復(fù)雜，參與對造血、免疫和炎癥的調(diào)節(jié)，與腎臟缺血性疾病密切相關(guān)[11-12]。

近年來，在器官移植和IRI領(lǐng)域，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）作為潛在的治療因子取得了積極的進(jìn)展。BMSC具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎和組織修復(fù)等生物學(xué)作用，能夠靶向遷移至損傷部位，并通過旁分泌機(jī)制促進(jìn)損傷修復(fù)[13-15]。早期研究發(fā)現(xiàn)在腎IRI時，BMSC能夠減輕缺血性損傷，加速損傷部位再生[16]。但BMSC的應(yīng)用仍然存在諸多問題需要闡明。本研究擬觀察在小鼠腎IRI過程中，輸注BMSC對IL-10與TNF-α的影響，以進(jìn)一步補(bǔ)充研究IR-AKI的病理機(jī)制，并探討B(tài)MSC的修復(fù)作用和可能機(jī)制，為AKI的治療提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

6～8周齡雄性C57BL/6小鼠購于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，清潔等級為無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級。小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（對照組）、IRI組和BMSC治療組（BMSC組），每組6只。對照組小鼠用2%戊巴比妥（40 mg/kg）麻醉，于37 ℃恒溫板上固定，取腹部正中切口，逐層分離皮膚、皮下組織、腹膜，然后用生理鹽水浸濕的紗布覆蓋腹部30 min后縫合腹部；IRI組步驟同對照組，打開腹腔后，進(jìn)入腹腔，先找到左側(cè)腎蒂，用無創(chuàng)性動脈夾迅速夾閉腎蒂計(jì)時，然后找到右側(cè)腎蒂夾閉計(jì)時，分別到30 min后去掉各自動脈夾，讓血流恢復(fù)灌注后縫合腹部；BMSC組用IRI組的方法建立IR-AKI模型后，經(jīng)尾靜脈輸注BMSC 0.1 mL（1×107/mL）。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國人民解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動物管理倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 BMSC來源和分組

C57BL/6小鼠BMSC及其完全培養(yǎng)基購于廣州賽業(yè)生物科技有限公司。傳代后的BMSC融合至50%左右時血清饑餓24 h，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗2次，在37 ℃礦物油中浸泡60 min，用大量PBS沖洗多次后，恢復(fù)完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h（IRI組）。將正常培養(yǎng)的BMSC作為對照組。提取細(xì)胞上清備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

PBS購于美國Hyclone公司；脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nickend labeling，TUNEL）試劑盒、礦物油購于美國Sigma-Aldrich公司；含4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）的封片劑購于北京中杉金橋生物科技有限公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immune absorbent assay，ELISA）試劑盒購于深圳欣博盛生物科技有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 小鼠BMSC的培養(yǎng)和輸注 小鼠BMSC用完全培養(yǎng)基復(fù)蘇于培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5% CO2、95%濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)。復(fù)蘇24 h后換液，此后每隔2～3 d更換培養(yǎng)液。細(xì)胞長到80%～90%融合時傳代，提取第3代細(xì)胞用PBS重懸，制成活細(xì)胞懸液（濃度為1×107/mL），經(jīng)尾靜脈注射入實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)。

1.4.2 樣本采集 小鼠IRI模型成功建立后，每隔24 h觀察各組小鼠狀態(tài)，并于72 h后摘眼球取血并編號，然后處死取雙側(cè)腎組織根據(jù)分組編號并固定于10%多聚甲醛溶液中。

1.4.3 小鼠腎功能檢測 小鼠血于室溫靜置30 min觀察到有明顯分層后，1 125×g離心5 min后吸取上層血清，全自動生化分析儀測定血清肌酐（serum creatinine，Scr）和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平。

1.4.4 腎組織病理學(xué)檢查 石蠟包被固定腎組織，4 μm連續(xù)切片，常規(guī)行蘇木素-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。染色的組織切片使用半定量標(biāo)尺進(jìn)行評分，采用雙盲法評估腎小管壞死的程度。腎組織損傷定義為腎小管壞死、腎小管擴(kuò)張和（或）萎縮、炎癥細(xì)胞浸潤或細(xì)胞水腫，評分為0～4分。分?jǐn)?shù)越高表示損傷越嚴(yán)重：0分為正常腎，1分為輕度壞死（皮質(zhì)或髓質(zhì)受累＜5%），2分為輕中度壞死（皮質(zhì)或髓質(zhì)受累5%～25%），3分為中度壞死（皮質(zhì)或髓質(zhì)受累26%～75%），4分為重度壞死（皮質(zhì)或髓質(zhì)受累＞75%）。

1.4.5 TUNEL染色檢測腎組織細(xì)胞凋亡 按照試劑盒中說明書配置好TUNEL反應(yīng)混合物，置于冰盒上備用。石蠟切片常規(guī)脫蠟、復(fù)水后，將載玻片放入裝有檸檬酸鹽緩沖液中，微波輻射5 min，PBS沖洗2次，樣品周圍干燥后加50 μ L TUNEL反應(yīng)混合物，加蓋子在恒溫培養(yǎng)箱37 ℃潮濕黑暗環(huán)境中孵育60 min。PBS沖洗3次，用含DAPI的封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。每組切片隨機(jī)選取1張，每張隨機(jī)選取10個視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞個數(shù)。

1.4.6 ELISA檢測IL-10與TNF-α水平 ELISA檢測各組小鼠血清與兩組BMSC細(xì)胞上清中的IL-10與TNF-α水平，實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒內(nèi)說明書進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用ANOVA單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。方差不齊的計(jì)量資料、等級資料的比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BMSC輸注對IRI小鼠腎組織形態(tài)和腎功能的影響

IRI 72 h后，對照組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常；IRI組腎組織結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，表現(xiàn)為廣泛的急性腎小管壞死，大量炎癥細(xì)胞浸潤，腎小管擴(kuò)張，皮質(zhì)和外髓刷狀緣消失；BMSC組損傷較輕，炎癥細(xì)胞浸潤較少，細(xì)胞水腫較輕，邊緣較清晰（圖1A）。與對照組比較，IRI組和BMSC組腎組織損傷評分較高；與IRI組比較，BMSC組腎組織損傷評分較低（均為P＜0.05，圖1B）。

IRI 72 h后，3組小鼠Scr和BUN水平比較見圖1C、D。與對照組比較，IRI組Scr水平升高；與IRI組比較，BMSC組Scr水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＜0.05）；BMSC組與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.272）。與對照組比較，IRI組和BMSC組BUN水平升高；與IRI組比較，BMSC組BUN水平下降（均為P＜0.05）。

圖1 各組小鼠腎組織病理學(xué)和腎功能變化Figure 1 Changes in renal histopathology and renal function of mice in each group

2.2 BMSC輸注對IRI小鼠腎組織細(xì)胞凋亡的影響

各組小鼠腎組織細(xì)胞凋亡情況見圖2。與對照組比較，IRI組和BMSC組凋亡細(xì)胞數(shù)量增多[（2.0±1.4）個比（18.4±3.7）、（9.4±3.1）個，均為P＜0.05]；與IRI組比較，BMSC組凋亡細(xì)胞數(shù)量減少[（18.4±3.7）個比（9.4±3.1）個，P＜0.05]。

圖2 各組小鼠腎組織細(xì)胞凋亡情況（TUNEL，×400）Figure 2 Cell apoptosis of renal tissues of mice in each group

2.3 BMSC輸注對IRI小鼠外周血中IL-10和TNF-α的影響

IRI 72 h后，各組小鼠外周血中IL-10和TNF-α的表達(dá)情況見圖3。與對照組比較，IRI組和BMSC組小鼠血清IL-10水平升高；與IRI組比較，BMSC組小鼠血清IL-10水平下降（均為P＜0.05）。與對照組比較，IRI組小鼠血清TNF-α水平升高，BMSC組小鼠血清TNF-α水平下降；與IRI組比較，BMSC組小鼠血清TNF-α水平下降（均為P＜0.05）。

圖3 各組小鼠外周血IL-10和TNF-α的表達(dá)情況Figure 3 The expression of IL-10 and TNF-α in peripheral blood of mice in each group

2.4 缺氧復(fù)氧對BMSC分泌IL-10和TNF-α的影響

對照組和IRI組BMSC上清中IL-10水平分別為（51.3±2.0）pg/mL和（55.2±2.6）pg/mL，TNF-α水平分別為（52.5±2.2）pg/mL和（58.8±17.0）pg/mL，兩組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-1.944，P=0.080；t=-0.501，P=0.627）。

3 討 論

腎IRI與TNF-α釋放、IL-6誘導(dǎo)以及中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性損傷等炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[17]。TNF-α在正常腎臟中表達(dá)水平較低，在IRI后數(shù)分鐘到數(shù)小時內(nèi)上調(diào)，誘導(dǎo)多種炎癥基因表達(dá)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加重組織損傷[10]。Hou等[12]發(fā)現(xiàn)使用小干擾核糖核酸（small interfering ribonucleic acid，siRNA）下調(diào)TNF-α的表達(dá)，可顯著減輕IRI所致的腎功能障礙。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子是腎損傷修復(fù)的重要炎癥介質(zhì)，其中抑炎因子IL-10可反向調(diào)節(jié)炎癥急性期反應(yīng)的多種炎癥因子[18-19]。Sakai等[20]對比了IL-10-/-小鼠與野生型小鼠在IRI后不同時間TNF-α表達(dá)水平的變化，發(fā)現(xiàn)野生型小鼠TNF-α的表達(dá)在IRI后5 h開始升高，24 h到達(dá)峰值，而IL-10-/-小鼠IRI后5 h即可到達(dá)峰值。表明IL-10可通過抑制炎癥介質(zhì)減輕炎癥細(xì)胞浸潤，改善腎IRI。

本研究結(jié)果顯示，BMSC組小鼠腎功能改善，外周血中TNF-α表達(dá)減少，提示BMSC修復(fù)小鼠IRAKI是通過降低TNF-α的表達(dá)水平對腎組織起保護(hù)作用，而IL-10的表達(dá)水平未升高，提示IL-10不直接參與BMSC的保護(hù)作用，其機(jī)制有待進(jìn)一步驗(yàn)證和討論。此外，我們還觀察到在體外模擬的IRI條件下，BMSC幾乎不分泌TNF-α和IL-10。

與我們的研究結(jié)果一致，已有研究報道BMSC可通過抑制體內(nèi)TNF-α的釋放改善IR-AKI[21-22]。BMSC具有向中胚層組織分化的能力，改善IRI后腎臟的結(jié)構(gòu)和功能，其機(jī)制包括減輕炎癥、減少凋亡、促進(jìn)自噬、改善組織纖維化以及加速腎間質(zhì)細(xì)胞增殖等[23-25]。

與其他報道有所不同，本研究中輸注BMSC后IL-10的表達(dá)水平降低。其他研究發(fā)現(xiàn)IRI后TNF-α和IL-10可同步升高，TNF-α的信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）表達(dá)顯著增加，刺激單核細(xì)胞合成IL-10，從而抑制炎癥反應(yīng)以修復(fù)IRI[26]。而IL-10又可調(diào)節(jié)單核-巨噬細(xì)胞的表型和功能活性，從而下調(diào)單核細(xì)胞衍生細(xì)胞因子的產(chǎn)生，包括TNF-α、IL-1β、IL-6和 IL-8等[10,27]。TNF-α與IL-10相互調(diào)節(jié)，是由于機(jī)體啟動體內(nèi)調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮作用以維持IRI后的免疫穩(wěn)態(tài)[28-29]，而BMSC輸注可影響負(fù)性調(diào)節(jié)功能的免疫細(xì)胞及其衍生的細(xì)胞因子[30]。

IRI時，調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞與衍生細(xì)胞因子系統(tǒng)的交互作用，以及細(xì)胞因子產(chǎn)生并彼此影響的時間依賴性，可能是輸注BMSC修復(fù)IR-AKI后IL-10的表達(dá)水平降低的原因之一。此外，有研究證明IR-AKI與線粒體自噬受體B淋巴細(xì)胞瘤-2和腺病毒E1B 19 kD相互作用蛋白3（B cell lymphoma-2 and adenovirus E1B 19 kD-interacting protein 3，BNIP3）介導(dǎo)的線粒體自噬有關(guān)[30-31]。PTEN誘導(dǎo)假定激酶1（PTEN-induced putative kinase 1，PINK1）-帕金森病蛋白介導(dǎo)的線粒體自噬可促進(jìn)IR-AKI的損傷修復(fù)[32-33]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-10可以通過抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號促進(jìn)線粒體自噬，保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)完整，減輕組織損傷[34]。

BMSC可修復(fù)IRI并保護(hù)線粒體完整性，減少活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），但具體機(jī)制尚不完全清楚[23]。BMSC輸注后，可能直接促進(jìn)線粒體自噬，修復(fù)損傷組織，而IL-10的負(fù)性調(diào)節(jié)或不直接參與對線粒體自噬的促進(jìn)作用，可以解釋輸注BMSC修復(fù)IR-AKI后IL-10的表達(dá)水平降低。目前有較多的相關(guān)研究報道，由于疾病種類、發(fā)生部位、動物模型、干細(xì)胞種屬或來源以及細(xì)胞因子種類，特別是時相性、采用的技術(shù)方法的差異性，出現(xiàn)了趨勢一致、結(jié)果不統(tǒng)一或結(jié)論相悖。本研究結(jié)果提示BMSC可能通過促進(jìn)線粒體自噬等途徑直接修復(fù)損傷腎組織，而非上調(diào)IL-10減輕腎IRI，其機(jī)制亟待后續(xù)進(jìn)一步的研究證實(shí)。

本研究的初步探討，為臨床提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但存在樣本量有限且尚在動物模型實(shí)驗(yàn)階段，仍然需要更進(jìn)一步的驗(yàn)證。今后，進(jìn)一步精細(xì)化觀察炎癥因子的時間、濃度依賴性，有助于臨床對BMSC輸注時間和濃度的選擇，根據(jù)特定時間炎癥因子的水平進(jìn)行早期干預(yù)，可能成為治療IR-AKI的有效手段。此外本研究提示了BMSC在IR-AKI修復(fù)中可能存在抗炎反應(yīng)之外的修復(fù)機(jī)制，需深入闡釋其中的機(jī)制后為臨床應(yīng)用提供嶄新的視角。