大鼠左肺原位肺移植改良模型的學習曲線及步驟解析

唐宏濤 李偲涵 王俊杰 黃桁 徐琳 陳婷婷 劉眉涵 付思怡 田東

肺移植是終末期肺病唯一有效的治療方式，肺移植受者術后5年和10年生存率分別為54%和32%，遠低于其它實體器官移植受者[1]。肺移植術后多種因素導致的嚴重并發(fā)癥是影響肺移植受者總體生存率的主要原因[2-5]，然而其具體致病機制仍未十分明確。臨床前實驗動物模型的構建有助于探索肺移植術后異常病理生理變化的潛在機制，進而制定新的診治策略。

盡管一些大型動物在肺移植程序和生理性質方面與人體相似，但成本巨大、倫理爭議較大和圍手術期的管理復雜阻礙了其應用[6]。相比之下，大鼠因其價格低廉、繁殖快速、易于飼養(yǎng)和同基因遺傳背景等優(yōu)勢，受到許多移植科醫(yī)師的青睞。隨著Mizuta等[7]將套管技術引入嚙齒類動物肺移植，大鼠左肺原位肺移植及套管技術逐漸成為構建缺血-再灌注損傷、慢性移植肺功能障礙、肺水腫等肺移植相關疾病模型的首選[8-11]，同時也被廣泛應用于體外肺灌注等前沿技術的研究[12-14]，為肺移植基礎研究提供了重要的動物模型基礎。目前，國內外許多研究都報道過大鼠肺移植的改良模型，雖然經(jīng)過多次外科訓練后都能被移植科醫(yī)師所掌握，但多數(shù)改良模型的學習曲線長、可重復性低，且可能伴隨各種術后并發(fā)癥，無經(jīng)驗的移植科醫(yī)師很難在短時間內熟練掌握，移植手術質量難以保證[6, 15-16]。

本課題組前期對大鼠肺移植模型和套管技術進行了多方位的改進[17]，該改良模型在降低手術難度、縮短操作時間、降低并發(fā)癥和提高生存率方面具有顯著優(yōu)勢。肺移植的每一步程序都可能決定模型建立的成敗和質量，深入解析其技術要點和操作難點對外科訓練是極其必要的，而目前尚無相關文獻對大鼠肺移植具體步驟進行詳細介紹。本文將根據(jù)兩名無移植經(jīng)驗術者的學習過程繪制具體的學習曲線，并對手術關鍵步驟進行詳細解析，旨在進一步推廣這種改良模型，為建立肺移植基礎研究動物模型提供更多的經(jīng)驗。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60只周齡7～8周、體質量約250 g的雄性SD大鼠購于川北醫(yī)學院實驗動物中心。供體和受體大鼠體質量分別為（223±4）g和（240±3）g。所有大鼠于術前2 d放入無特定病原體（specefic pathogen free，SPF）飼養(yǎng)環(huán)境，術前1 d禁食不禁飲，手術環(huán)境潔凈，術后將受體大鼠放回SPF環(huán)境繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)。大鼠肺移植手術均于川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院心肺移植研究室完成，并得到川北醫(yī)學院倫理委員會的批準。

1.2 大鼠左肺原位肺移植改良模型的關鍵步驟

1.2.1 麻 醉 在誘導盒中采用不超過1.0 mL的吸入性麻醉藥異氟烷對大鼠進行麻醉誘導，待大鼠胸廓起伏頻率降低至約1次/秒且全身肌無力時，將其放置在自制氣管插管臺弧面。

1.2.2 氣管插管 用燈光透照大鼠頸前皮膚，配合鑷子暴露聲門，插入自制氣管插管（插管成功時有輕微連續(xù)環(huán)狀阻塞感，圖1A）。連接小動物呼吸機進行持續(xù)通氣和麻醉維持。

1.2.3 心肺整體獲取 剪開胸腹部皮膚至下頜，再行正中開腹至劍突，沿肋緣剪開膈肌暴露下腔靜脈，緩慢向下腔靜脈注射500 IU肝素鈉，待3～5 min后實現(xiàn)全身肝素化。沿胸骨體兩側血管走向行胸骨切開術，剪去部分胸腺，隨后離斷下腔靜脈，并剪破左心耳和肺動脈根部，使用器官保存液緩慢灌注全肺直至供肺基本呈白色（不超過15 mL，圖1B）。在呼吸機呼氣相時拔出氣管插管，使供肺內充滿約50%的氣體以防止冷缺血期間肺不張，離斷氣管后，朝大鼠尾部方向游離心肺整體，注意避免損傷食管污染供肺。

1.2.4 游離左肺 全程于碎冰上進行，心肺整體呈“反體位”（左肺位于術者左側，右肺位于右側），用灌注液浸濕的吸水紙潤濕和包裹供肺（圖1C）。在氣管隆嵴處離斷左主支氣管，若左肺迅速萎縮，則表示左肺灌注和通氣良好；沿迷走神經(jīng)方向分離肺動脈，隨后連同部分左心房離斷肺靜脈以保證足夠的長度；仔細游離肺門三支（左肺主支氣管、左肺動脈、左肺靜脈）結構，盡量避免對肺靜脈的過度處理。

1.2.5 供肺套管制備 采用“單向式”依次處理肺靜脈、左主支氣管和肺動脈，套管制備方法見前期研究[17]。橫斷部分左主支氣管軟骨環(huán)，使膜部在無張力時與軟骨環(huán)高度一致；套管尾部朝向供肺前緣，將血管或支氣管外翻至套管周圍后，套入預先準備好的滑結并打結；將套管制備完成后的供肺用上述吸水紙包裹，存于低溫環(huán)境待用（圖1D、E）。

1.2.6 受體移植 受體大鼠呈右側臥位，于心尖搏動最明顯處作胸部切口，用撐開器擴大胸腔視野，采用無損傷側壁鉗鉗夾肺門三支遠心端并固定，打開縱隔胸膜時注意保護膈神經(jīng)（圖1F）；仔細游離肺門三支至近心端以保證血管和支氣管的長度，肺靜脈應徹底游離至肺血管底部；用另一把無損傷側壁鉗鉗夾肺門三支近心端，使肺門平面與水平面呈20°左右夾角；于肺動脈前壁上段行“丄”形切口，于支氣管和肺靜脈上、下分支內側壁行 “V”形切口，排空管腔液體（圖1G）；若肺靜脈主干較短，可在其下分支作“丄”形切口。將供肺置于遠心端無損傷側壁鉗上，覆以上述吸水紙起牽引作用；移植前用細棉條排除支氣管內液體防止栓塞；移植吻合采用“鐘擺式”吻合法，即先吻合支氣管，再以支氣管為中軸，將供肺向肺動脈和肺靜脈依次擺動，保證所有套管在無張力情況下進行嵌入和吻合，避免移植過程反復吻合造成的血管撕裂（圖1H）；肺復張前修剪受體自體肺門三支結構殘端以防止肺不張等并發(fā)癥；關胸時應密閉大鼠肋間隙以恢復胸腔負壓（圖1I），詳見前期研究[17]。

圖1 大鼠左肺原位肺移植手術步驟Figure 1 Surgical procedures for orthotopic left lung transplantation in rats

1.3 研究方法

肺移植手術均由單人操作。自首次成功完成大鼠左肺原位肺移植起，兩名無移植經(jīng)驗術者（術者A和術者B）利用課題組改良的肺移植模型分別連續(xù)行完整移植手術15例，每5例手術為一個練習階段，詳細記錄各移植程序（包括心肺整體獲取、套管制備、冷缺血、熱缺血和移植）的操作時間以及大鼠的存活情況和并發(fā)癥情況。移植時間定義為受體大鼠做切口開始至受體大鼠切口縫合完畢的時間間隔，大鼠移植總體成功率=（手術成功例數(shù)/總手術例數(shù)）×100%，1周存活率=（術后1周存活大鼠數(shù)/術后順利蘇醒大鼠數(shù)）×100%，其余時間定義及手術器械參照本課題組前期研究[17]。

使用累積和（cumulative sum，CUSUM）法構建學習曲線，將各移植程序的操作時間作為參考指標，并將其量化值分別定義為δ1、δ2、δ3、δ4及δ5。計算各項參考指標的平均值（i，i=1,2,3,4,5），≥i的數(shù)據(jù)所占比例為失敗率（Fi）。對于第n例手術，若xi≥i則δ1=1-Fi；反之δi=0-Fi。定義每例手術的5項量化指標和為∑(n)。每例手術的CUSUM值：CUSUM(n)=∑(n)+CUSUM(n-1)。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學分析，GraphPad Prism 9.1.0繪制學習曲線。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，方差齊的數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，方差不齊的數(shù)據(jù)比較采用Jonckheere-Terpstra檢驗，兩兩比較均采用Bonferroni法（α’=0.05/3）。檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 不同術者各移植程序時間和移植結果比較

術者A、B自開始練習起，首次移植成功的手術次數(shù)分別為第5次、第6次，最終移植總體成功率分別為80%（12/15）和87%（13/15），大鼠1周存活率分別為92%（11/12）和92%（12/13）。隨著手術例數(shù)的增加，術者A、B的各移植程序時間和總手術時間均呈下降趨勢，且總手術時間在各練習階段間差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表1）。

表1 兩名術者肺移植各階段操作時間Table 1 The operating time of each stage of lung transplantation from two surgeons (±s, min)

表1 兩名術者肺移植各階段操作時間Table 1 The operating time of each stage of lung transplantation from two surgeons (±s, min)

注：與階段Ⅰ比較，aP＜0.05/3；與階段Ⅱ比較，bP＜0.05/3。

術者A 術者B階段Ⅰ 階段Ⅱ 階段Ⅲ P值 階段Ⅰ 階段Ⅱ 階段Ⅲ P值心肺整體獲取時間 11.4±1.8 10.6±1.4 8.8±0.7 a 0.006 16.9±1.6 16.0±0.8 12.2±1.7 a,b ＜0.001套管制備時間 23.5±5.9 25.1±2.8 17.8±3.1 a,b 0.038 48.9±2.1 39.2±7.3 a 22.4±6.2 a,b ＜0.001冷缺血時間 52.9±8.8 51.7±2.8 43.7±2.6 a,b 0.017 84.9±1.2 69.9±12.7 a 43.8±3.4 a,b ＜0.001熱缺血時間 41.2±11.3 23.6±7.5 a 13.1±3.5 a ＜0.001 34.1±2.0 33.0±7.0 21.3±11.1 a,b 0.039移植時間 73.2±8.5 53.0±6.2 a 42.2±3.0 a,b ＜0.001 74.0±2.1 66.9±11.4 44.2±11.3 a,b 0.001總手術時間 108.8±10.8 88.8±9.0 a 68.7±4.5 a,b ＜0.001 139.8±4.3 122.1±14.1 a 80.7±14.2 a,b ＜0.001移植程序時間images/BZ_63_1403_2539_1423_2597.png

術者A、B每次氣管插管均一次性成功，移植吻合成功率100%，術中無氣管、血管撕裂。術者A、B操作的手術中分別有3只、2只大鼠因麻醉過度導致心力衰竭死亡，各有1只大鼠于術后1 d、7 d死亡，尸檢后確認死因分別為靜脈扭曲和肺不張。少數(shù)大鼠術后存在不同程度的濕啰音，多數(shù)大鼠術后存在呼吸急促、食欲減退、運動減少現(xiàn)象，隨后均逐漸恢復。

2.2 不同術者的CUSUM學習曲線比較

經(jīng)非線性擬合，兩名術者的學習曲線符合四次方曲線規(guī)律，擬合優(yōu)度R2分別為0.992 8和0.976 6。兩名術者先后于第7例和第8例移植手術時抵達學習曲線拐點，術者A，第1～7例為學習提高階段，第8～15例為熟練掌握階段；術者B，第1～8例為學習提高階段，第9～15例為熟練掌握階段（圖2）。

圖2 術者A、B的CUSUM學習曲線Figure 2 The CUSUM learning curves of surgeon A and B

3 討 論

自套管技術被引入嚙齒類動物肺移植以來，大鼠左肺原位肺移植模型已被廣泛應用于肺移植基礎研究領域[12-14,18-21]。近年來有多項研究對大鼠肺移植模型進行改進，但部分關鍵步驟未被詳細介紹，無經(jīng)驗的移植科醫(yī)師難以快速掌握該項技術，這不僅浪費時間成本與動物資源，還會對術者信心造成極大影響。本課題組前期對大鼠肺移植模型及套管技術進行了多方位改良，本文深入解析了該改良模型建立的關鍵步驟，并成功繪制其學習曲線，旨在進一步推廣該項技術，為大鼠肺移植模型的建立提供更多學習經(jīng)驗。

大鼠肺移植需要持續(xù)的機械通氣和麻醉，故氣管插管是手術取得成功的首要前提。大鼠體型較小，難以直接觀察其喉口和聲帶，盲探氣管插管失敗易導致大鼠喉頭水腫、黏液堵塞聲門、恢復聲門反射，甚至因呼吸衰竭而死亡[22-23]。既往的氣管插管臺多為斜面，在插管時需復查，耗時較長[23-24]。本模型采用弧面自制氣管插管臺，利用絲線懸掛大鼠上切牙，使其頸部呈后仰狀態(tài)。燈光透照大鼠頸前皮膚使聲門和喉口可視化，可有效降低氣管插管誤入食管或損傷口咽的風險。本模型采用的氣管插管由14 G靜脈留置針管制成，其管徑大小大致與體質量250 g左右大鼠的氣管管腔相匹配，降低了氣管漏氣或撕裂的發(fā)生率。根據(jù)兩名術者的移植經(jīng)驗，配合自制氣管插管臺的氣管插管操作簡單、易于學習，熟練掌握后不到10 s即可完成。

恰到好處的供肺灌注是大鼠供肺術后實現(xiàn)正常氧合的重要保障，灌注速度、供肺通暢程度和通氣幅度是影響灌注質量的主要因素。灌注速度過快極易導致肺水腫，而灌注液流出受阻或雙肺通氣不良，則很難排出殘余血液。Pieróg等[25]將灌注液用量設定為20 mL，但即使是體質量相當?shù)拇笫?，其肺部體積和結構仍存在巨大差異，定量灌注極易導致灌注過度或不足，進而嚴重影響供肺質量。本模型首先保證供肺灌注過程平緩，灌注時間控制在1 min內，灌注液不超過15 mL[17]，可有效避免肺水腫和肺淤血等并發(fā)癥。經(jīng)測試，當供肺被灌注至呈雪白色且流出液澄清或少血色時效果最佳。當局部供肺難以灌注徹底時，切忌隨意更改灌注量和灌注速度。此外，灌注前使大鼠全身肝素化、灌注時保留呼氣末正壓也有助于促進灌注進程和改善供肺質量。

套管制備是受體移植前的關鍵步驟，既往研究顯示，套管過小容易引起血管血栓和肺不張[6,15-16,22]。本模型套管由14 G和16 G靜脈留置針管制成，且表面被打磨粗糙，有利于套管體和支氣管、血管壁之間的緊密結扎。根據(jù)兩名術者所操作的移植手術結果，僅1只大鼠于術后1周內出現(xiàn)肺不張，考慮為支氣管扭曲所致。Guo等[22]建議在套管制備時剪掉套管尾部以減少并發(fā)癥，但該操作增加了吻合難度，同時容易引起供肺損傷。本模型將套管尾部裁剪成弧形，以防止術中、術后對肺實質或血管的意外損傷，術后未發(fā)現(xiàn)因套管原因引起的各種并發(fā)癥。此外，少數(shù)研究報道了供肺套管制備所用器械，但均對供肺有不同程度的壓迫，且供肺容易擺動，操作時間較長[15-16]。本模型套管制備在自制套管制備盤中進行，極大增加了套管制備的穩(wěn)定性。此外，既往模型大多優(yōu)先處理肺動脈[6,16]，但解剖上肺靜脈通常較短，優(yōu)先處理肺動脈極易造成移植后供肺與縱隔平面成角。本模型采用“單向式”原則，首先制備肺靜脈套管，并將支氣管和肺動脈修剪至與肺靜脈相當?shù)拈L度?；诟倪M后的套管及套管制備盤，本模型套管制備所需時間大大減少，制備過程基本無壓迫，且術后所有大鼠未發(fā)現(xiàn)成角等并發(fā)癥。

受體移植是大鼠肺移植的核心步驟，受體胸部切口位置不當、血管撕裂和扭轉、套管滑脫、管腔折疊等均可能導致手術的徹底失敗。既往研究大多以大鼠肋間隙和肩胛骨下緣為體表特征以確定切口位置[11,15-16,22,26]，但實際操作中難以準確定位這些體表特征。本模型于心尖搏動最明顯處作切口，可充分暴露受體左側肺門。關于吻合順序，既往研究多采用“單向式”吻合肺門三支[15,27]，但該方法極易增加套管嵌入受體管腔后產生的張力，進而導致套管反復滑出和血管撕裂。本模型采用的“鐘擺式”吻合法可顯著減小吻合時的血管張力，極大地降低了吻合難度[17]。肺靜脈吻合通常被認為是大鼠肺移植中最困難的步驟，肺靜脈長度較短、收縮性差、易撕裂，給大鼠肺移植帶來巨大的挑戰(zhàn)。既往研究常通過縫線懸吊或牽引法來固定供體肺靜脈套管[7]，但此舉破壞了肺靜脈的完整性，使其更容易撕裂。本模型構建過程中，術者首先通過“連同部分心房離斷供肺肺靜脈”和“將肺靜脈徹底游離至肺血管底部”的方法以增加供、受體靜脈長度；此外，術者在肺靜脈下分支作“丄”形切口，順利吻合后再連同上分支一同結扎[17]；同時，適當保留肺靜脈表面的結締組織可增加其韌性，進而防止吻合時的撕裂[22]。既往研究均未涉及供肺再通氣和再灌注前對受體肺門三支殘端的處理，肺門三支殘端可能會因彈性回縮導致供肺肺門血管、支氣管受壓迫，故在肺復張之前修剪受體自體肺門三支結構殘端可有效預防肺不張、血流阻塞等術后并發(fā)癥。基于以上改進，本模型移植肺術后血栓形成、供血不足或氣道壓迫的發(fā)生率顯著降低，極大提高了受體移植的成功率。

充分了解大鼠肺移植外科訓練進度對術者的移植計劃和信心提升具有重要作用。基于課題組的改良模型，隨著手術例數(shù)的增加，本研究兩名術者各移植程序操作時間和總手術時間均呈下降趨勢，且總手術時間在各練習階段間差異均有統(tǒng)計學意義，移植總體成功率（80%和87%）和大鼠1周存活率（均為92%）也較既往研究明顯提高[7,22]，這充分表明該模型具有高度的可操作性和可重復性。CUSUM被廣泛應用于構建動物模型或手術方法的學習曲線[28]。大鼠肺移植的每個移植程序都能獨立影響手術最終結果，因此將移植程序完整納入?yún)⒖贾笜四芨鼫蚀_地反映術者的學習情況，本研究中兩名術者的CUSUM學習曲線可分為學習提高階段和熟練掌握階段。在學習提高階段，術者操作相對生疏、耗時較長；隨著練習階段的推進，兩名術者對模型構建方法、手術器械以及實驗設備進一步熟悉，最終跨越學習曲線拐點（分別為第7次和第8次），逐漸熟練掌握該模型，最終，相對其他同類研究，本模型顯著減少了手術操作時間，極大縮短了學習曲線[6,16,22]。

綜上所述，本課題組改進后的大鼠左肺原位肺移植模型在理論和技術上均具有良好的可操作性和可重復性。基于術者學習曲線短、受體存活率高且并發(fā)癥少、成本低廉等優(yōu)點，本模型將促進大鼠左肺原位肺移植技術的推廣發(fā)展和經(jīng)驗學習，并為肺移植相關疾病的基礎研究提供一個穩(wěn)定可靠的平臺，在未來肺移植臨床藥物治療和病理生理變化研究等方面具有較大應用潛力。