羅乃杰 賴漢漳 劉玲 盤偉嵐 王小芬 梁慧婷 陳潮錦 于亞南 陳瑞愛

摘 要：用LMH細胞擴繁I群禽腺病毒血清4型（FAdV-4）并通過口服途徑感染24周齡SPF公雞，心臟無菌采血制備雞抗FAdV-4血清。通過ELISA、AGP、IFA和HI等方法檢測血清，結(jié)果未見其他禽類常見病毒抗體。該血清用于間接免疫熒光檢測FAdV-4，染色效果較好，測定FAID₅₀敏感性高。試驗結(jié)果表明，該批血清2000倍稀釋可以作為一抗用于FAdV-4毒價檢測。

關(guān)鍵詞：FAdV-4;陽性血清;間接免疫熒光試驗;FAID50

中圖分類號：S858.31 文獻標(biāo)識碼：B文章編號：1673-1085（2021）8-0045-05

禽腺病毒（FAdV）屬于腺病毒科禽腺病毒屬，為無囊膜的雙股DNA病毒，可引起禽類心包積液綜合征、包涵體肝炎、雞胃糜爛等多種疾病，是當(dāng)前危害我國養(yǎng)禽業(yè)的主要致病原之一^[1-2]。I群禽腺病毒血清4型（FAdV-4）可引起雞心包積液肝炎綜合征（HPS），臨床特征為心包積液和肝臟腫大發(fā)炎，該病發(fā)病急，傳播速度快，死亡率高，給養(yǎng)禽業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失^[3]。FAdV-4主要利用LMH細胞進行體外培養(yǎng)，病變特征為細胞變圓聚集，但是健康LMH貼壁細胞本身容易聚團變圓與病變細胞混淆，影響了病毒鑒定和TCID₅₀的測定。基于特異抗體的間接免疫熒光法（IFA）可更客觀的鑒別被感染的細胞，但目前只有少數(shù)單位開發(fā)出禽腺病毒單克隆抗體^[4]，且尚未普及應(yīng)用，眾多研發(fā)機構(gòu)和養(yǎng)禽企業(yè)仍然依靠細胞病變結(jié)合PCR法來判斷病毒感染與否。若將培養(yǎng)的病毒注射免疫SPF雞制備陽性血清開展IFA，容易產(chǎn)生細胞等其他培養(yǎng)成分的抗體，從而出現(xiàn)非特異性熒光，干擾判讀。因此，需要制備特異性好的陽性血清為開展基于IFA 法檢測FAdV-4以及準(zhǔn)確測定病毒含量提供有效手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 貼壁LMH細胞，由肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司保存。

1.1.2 病毒 I群禽腺病毒血清4型（FAdV-4）毒株，由肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司純化、鑒定和保存。

1.1.3 熒光二抗 FITC標(biāo)記的兔抗雞IgG，購自Sigma公司。

1.1.4 雞抗體檢測試劑盒 IBV抗體、ILTV抗體、AEV抗體、IBDV抗體、ALV抗體、REO抗體、CAV抗體ELISA檢測試劑盒，均購自IDEXX公司。

1.1.5 細胞培養(yǎng)液 高糖DMEM培養(yǎng)基、胰酶，購自Gibco公司;胎牛血清，購自德國Serana公司。

1.1.6 SPF雞 24周齡公雞，購自大華農(nóng)生藥SPF實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 血清制備

1.2.1.1 FAdV-4病毒液制備 取FAdV-4病毒接種于LMH單層細胞，37 ℃吸附1 h后加入含2%血清的DMEM維持液，37 ℃培養(yǎng)5 d，反復(fù)凍融3次后2000 g離心5 min，收集上清。

1.2.1.2 動物免疫及采血 取1.2.1.1制備的FAdV-4病毒液，用無菌PBS稀釋10倍，通過口服途徑感染10只24周齡SPF公雞，1 mL/只，在隔離器中飼養(yǎng)觀察28 d，期間出現(xiàn)死雞則剔除處理，感染后第28天，仍然存活的雞全部經(jīng)心臟無菌采集血液，分離血清后混合，留小樣待檢。

1.2.2 外源病毒抗體檢測 應(yīng)用 ELISA、AGP、IFA和HI等方法對陽性血清樣品進行特異性檢定，檢測除Ⅰ群禽腺病毒以外13種常見禽類外源病毒的抗體。

1.2.3 間接免疫熒光效價測定

1.2.3.1 細胞板的制備 將對數(shù)生長期的LMH細胞鋪到96孔細胞培養(yǎng)板中，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至匯合度60%～80%。將FAdV-4病毒液用DMEM做10倍梯度稀釋（10-1～10-10）后接種到96孔板，每孔接種100 μL，設(shè)兩列空白對照。置37 ℃、5%CO₂培養(yǎng)箱孵育，1 h后添加100 μL含2%胎牛血清DMEM至 200 μL維持，然后置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d。

1.2.3.2 間接免疫熒光實驗（IFA） 將已接毒細胞板棄去培養(yǎng)液，PBS清洗3次，每孔加入50 μL冷甲醇（-20 ℃），置室溫固定15 min，棄去甲醇，自然晾干后，用PBS洗細胞面1次，然后每孔加入50 μL用PBS進行100倍稀釋的陽性血清，同時設(shè)陰性對照（非接毒細胞加陽性血清）和空白對照（接毒細胞加PBS），置37 ℃作用1 h。用PBST清洗3次，每孔加入50 μL用PBS進行200倍稀釋的FITC標(biāo)記的兔抗雞IgG，置37 ℃作用1 h。棄去熒光二抗染料，用PBST清洗3次后用熒光顯微鏡觀察。

1.2.3.3 陽性血清最適工作濃度的確定 將制備的陽性血清用PBS進行1∶1000、1∶2000、1∶3000和1∶4000稀釋，按照擬定的方法進行間接免疫熒光染色。

2 結(jié)果及分析

2.1 制備陽性血清

口服途徑接種稀釋后的FAdV-4培養(yǎng)物上清，10只SPF雞在7 d內(nèi)陸續(xù)死亡3只，其余7只至接種后第28 天仍然存活，說明降低接種物中的FAdV-4病毒含量、使用大日齡的SPF公雞可以減少動物急性死亡，有利于延長病毒在機體繁殖和刺激免疫系統(tǒng)時間，提高血清抗體效價。

2.2 陽性血清特異性檢定

使用ELISA、AGP、IFA和HI等方法檢測制備的陽性血清樣品，結(jié)果如表1所示，各項檢測結(jié)果均為陰性，說明該血清樣品具有良好的特異性。

2.3 陽性血清IFA效價測定

將制備的抗FAdV-4陽性血清稀釋100倍后用于IFA檢測，陽性細胞可見綠色熒光，表明陽性血清對FAdV-4感染的LMH細胞具有特異性，但是背景過重不利于觀察判斷。將陽性血清用PBS進行1∶1000、1∶2000、1∶3000和1∶4000稀釋后進行IFA檢測，探索最適工作濃度，結(jié)果表明1∶1 000～1∶3000稀釋度染色陽性對照清晰，健康細胞對照背景良好，1∶4 000 稀釋度熒光不明顯?？紤]到保存和使用過程中可能造成血清抗體效價出現(xiàn)下降，綜合上述結(jié)果，確定該 FAdV-4陽性血清用于IFA試驗時作為一抗的稀釋度為1∶2 000。

3 討論與小結(jié)

間接免疫熒光試驗（IFA）是一種利用抗原抗體的免疫學(xué)反應(yīng)對組織或細胞內(nèi)的抗原進行定位，該方法操作簡單、敏感性高、特異性好，在病毒定位與分布、致病原診斷、致病機理研究中得到了廣泛應(yīng)用^[5]。

本研究通過口服途徑來降低免疫劑量和使用24周齡的大日齡SPF雞。其中有7只至接種后第28天仍然存活，留樣用PCR檢查確認(rèn)已無FAdV病毒，說明降低接種物中的FAdV-4病毒含量、使用大日齡的SPF公雞可以減少動物急性死亡，有利于延長病毒在機體繁殖和刺激免疫系統(tǒng)時間，提高血清抗體效價。

李俊平等也曾使用滴鼻、點眼和肌肉注射途徑免疫SPF雞制備REV陽性血清開展IFA^[6]，發(fā)現(xiàn)若將培養(yǎng)的病毒培養(yǎng)物注射免疫SPF雞制備陽性血清開展IFA，容易產(chǎn)生細胞等其他培養(yǎng)成分的抗體，從而出現(xiàn)非特異性熒光，干擾判讀。本研究通過將FAdV-4病毒培養(yǎng)上清通過口服途徑感染SPF雞制備陽性血清，盡可能避免了病毒抗原以外成份抗體的產(chǎn)生。

本試驗制備了一批雞抗FAdV-4血清，經(jīng)檢測，血清中未檢出雞痘病毒、傳染性法氏囊病毒、馬立克氏病病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、禽流感病毒（H₅、H₇、H₉）、傳染性喉氣管炎病毒、禽呼腸孤病毒、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒、禽白血病病毒J亞群、禽白血病病毒AB亞群、禽腦脊髓炎病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒等13種常見禽類外源病毒的抗體，具有良好的單一特異性。 間接免疫熒光抗體效價為1︰3000，綜合考慮確定該批血清用于FAID₅₀時1︰2000稀釋作為一抗。細胞病變結(jié)合PCR法雖然作為現(xiàn)在一種通用的檢測方法，技術(shù)成熟，快速簡便，但用在測定病毒效價時，其測得的病毒效價比實際病毒效價偏低^[7]。用IFA法檢測FAdV-4的TCID₅₀，只要在孔內(nèi)檢測到一個陽性，就可以判定為陽性，敏感性高。

本研究制備了雞抗FAdV-4陽性血清，技術(shù)路線簡單、非特異熒光背景弱、檢測成本低，為開展基于IFA法檢測FAdV-4以及準(zhǔn)確測定病毒含量提供了有效手段。

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Preparation of Chicken Anti- Serotype 4 Fowl Adenovirus Group Ⅰ Polyclonal Antibody and its Application in IFA

LUO Naijie1， LAI Hanzhang1， LIU Ling1， PAN Weilan1， WANG Xiaofen1，

LIANG Huiting1， CHEN Chaojin1， YU Yanan1， CHEN Ruiai1，2*

（1.Key Laboratory of Biotechnology and Bioproducts Development for Animal Epidemic Prevention， Ministry of Agriculture，P.R.China，Guangdong Enterprise Key Laboratory of Biotechnology R&D of Veterinary Biology Products，Zhaoqing Dahuanong Biology Medicine CO.，LTD，Zhaoqing 526238 ， China;

2. College of Veterinary Medicine，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China ）

Abstract： The 24 weeks old SPF chickens were immunized with FADV-4 amplified using LMH cells by Oral route. Chicken anti-FADV-4 serum was prepared by cardiac sterile blood collection. The collected chicken antisera were free of 13 kinds of foreign antibody by ELISA，IFA，AGP or HI. Using the serum to detect FADV-4 by IFA， the staining effect was excellent， and the FAID50 was sensitive. The studies showed that the polyclonal antibody diluted 2000 times can be used as primary antibody in IFA to detected FADV-4 .

Keywords： FAdV-4; antisera; IFA; FAID50

收稿日期：2021-07-20

作者簡介：羅乃杰（1988-），男，本科，生物技術(shù)助理工程師，主要從事畜禽疾病防控技術(shù)研究及細胞生物反應(yīng)器培養(yǎng)技術(shù)研究，E -mail：972634506@qq.com。

*通訊作者：陳瑞愛（1970-），女，教授，高級獸醫(yī)師，主要從事動物醫(yī)學(xué)及生物制品研究，E-mail：chensa727@yahoo.com.cn。