一株鵪鶉源雞毒支原體的分離鑒定

劉麗萍 李玉杰 路曉 趙巧雅 盛媛 高月花 郭效珍 胡峰 田野 劉存霞 于可響

摘 要：本研究從發(fā)病鵪鶉體內(nèi)分離出1株支原體，通過菌落形態(tài)、pvpA基因的PCR擴(kuò)增與測序分析，鑒定為雞毒支原體。采用6種抗菌藥物測其最小抑菌濃度（MIC），發(fā)現(xiàn)該分離株對泰妙菌素最敏感，MIC達(dá)0.00625 μg/mL;其次為酒石酸泰樂菌素、鹽酸強(qiáng)力霉素，對大觀霉素、慶大霉素、卡那霉素的敏感性較差。

關(guān)鍵詞：雞毒支原體;鵪鶉;pvpA基因;最小抑菌濃度

中圖分類號：S858.39? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B? ? ? ? 文章編號：1673-1085（2021）8-0041-04

雞毒支原體（Mycoplsma gallisepticum，MG）又稱為雞敗血支原體、雞毒霉形體，宿主譜較廣，雞、鵪鶉、火雞等包括野生鳥在內(nèi)的10多種禽類均可感染，但主要感染雞和火雞，感染雞而引起雞的慢性呼吸道?。╟hronic respiratory disease，CRD），感染火雞而引起火雞的傳染性竇炎（infectious sinusitis）^[1，2]。該病廣泛分布于世界各地，致死率不高，但會導(dǎo)致家禽產(chǎn)蛋率、孵化率和飼料轉(zhuǎn)化率降低。臨床上常常繼發(fā)或并發(fā)于新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性喉氣管炎、大腸埃希氏菌病等傳染病，導(dǎo)致病情加重，死亡率升高，為家禽養(yǎng)殖帶來很大的經(jīng)濟(jì)損失^[3]。

鵪鶉感染支原體主要表現(xiàn)為呼吸道癥狀，如鼻腔內(nèi)有分泌物，鼻竇腫脹，有粘性和膿性液體，喉頭和氣管內(nèi)有粘液，氣囊增厚、渾濁，氣囊間有泡沫樣粘稠液體和黃色干酪樣物^[4]。本試驗從發(fā)病鵪鶉中分離到一株雞毒支原體，并測定了分離株的藥物敏感性，以期為臨床給藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 支原體培養(yǎng)基 本研究采用改良Frey氏培養(yǎng)基，購買自北京中海生物科技有限公司。

1.1.2 菌株及病料 雞毒支原體標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G31;雞毒支原體SD株，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所保存。

病料：來自2020年12月山東發(fā)生氣囊炎的某鵪鶉廠，無菌取病鵪鶉氣管及肺。

1.1.3 抗菌藥物 鹽酸強(qiáng)力霉素（S17064，上海源葉生物）、泰妙菌素（S24754，上海源葉生物）、酒石酸泰樂菌素（S30996，上海源葉生物）、鹽酸大觀霉素（S7013，上海源葉生物）、慶大霉素（S17024，上海源葉生物）、硫酸卡那霉素（25389-94-0，Ruitaibio）。

1.2 方法

1.2.1 病原核酸檢測 將鵪鶉氣管及肺按1︰5（W/V）比例加入磷酸鹽緩沖液（PBS）碾磨，取碾磨液提取核酸，進(jìn)行支原體、新城疫病毒、禽流感病毒、傳染性支氣管炎病毒的檢測。檢測引物見表1。

1.2.2 支原體分離培養(yǎng)及形態(tài)觀察 參考之前的資料^[5，6]，無菌條件下采集鵪鶉氣管及肺，加入適量磷酸鹽緩沖液（PBS），碾磨后靜置，取上清加入到改良Frey氏液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，觀察約5～7 d，待液體培養(yǎng)基由紅色變?yōu)槌赛S色為培養(yǎng)終點。將培養(yǎng)液接種于固體培養(yǎng)基后，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7 d，即可得支原體菌落。低倍鏡下觀察菌落形態(tài)，挑取低倍鏡下呈“荷包蛋”樣菌落接種于液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3～5 d，待培養(yǎng)基變黃后接種于支原體固體培養(yǎng)基，挑單菌落再接種于液體培養(yǎng)基，重復(fù)三次，獲得支原體純培養(yǎng)物。

1.2.3 雞毒支原體PCR鑒定 根據(jù)NCBI中發(fā)表的雞毒支原體pvpA基因序列設(shè)計一對特異性引物，MG-F：5-AGAATGCTCATCCAGGTCAAC-3，MG-R：5-GGTGTAGACCATTTGGCATTG- 3，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小為330 bp。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，同時送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行核酸比對。

1.2.4 顏色改變單位（CCU）測定 將支原體純培養(yǎng)物連續(xù)傳代，待穩(wěn)定傳代后將菌液置于-80 ℃保存?zhèn)溆茫瑓⒖紖乔迕?sup>[7]的方法進(jìn)行活菌濃度測定。首先將改良Frey氏液體培養(yǎng)基分裝于滅菌離心管，1.8 mL/管，共11管，取分離菌液0.2 mL加入離心管中，混勻后取0.2 mL加入到第二管，將培養(yǎng)菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋，一直稀釋至第10管，第11管作為支原體培養(yǎng)基對照，密封好，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，每天觀察試管的變色情況。待培養(yǎng)基顏色不再發(fā)生變化時，培養(yǎng)基顏色由紅色變?yōu)辄S色的最高稀釋的試管數(shù)就作為待測菌液的顏色改變單位，用CCU/mL來表示支原體的活菌濃度。

1.2.5 藥物最低抑菌濃度（MIC）測定 參考之前的資料^[8]，采用微量稀釋法對6種抗菌藥物進(jìn)行MIC測定。取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每一排為1組。所有孔中加入100 μL支原體液體培養(yǎng)基，于第1排中加入上述稀釋并除菌的藥液，充分混勻后取100 μL加至第2孔，依次倍比稀釋至第10孔后棄掉多余的100 μL。每排的第1～10孔中各加100 μL稀釋至1×10⁴CCU/mL的菌液。第11孔加100 μL支原體液體培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基對照（陰性對照），第12孔加100 μL稀釋至1×10⁴CCU/mL支原體菌液作為支原體生長對照（陽性對照）。密封細(xì)胞板，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1周，觀察試驗結(jié)果。當(dāng)陽性對照變成黃色，陰性對照不發(fā)生顏色變化時，記錄試驗藥物顏色變化的孔數(shù)，該藥物濃度即為MIC。同時采用相同方法，選取泰妙菌素、酒石酸泰樂菌素、強(qiáng)力霉素3種藥物，檢測MG陽性菌株SD株和標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G31株的MIC。

3 結(jié)果

3.1 病原核酸檢測

核酸檢測結(jié)果顯示，只有雞毒支原體PCR結(jié)果為陽性，其它病原PCR結(jié)果為陰性，排除了其它呼吸道病原感染的可能。

3.2 分離培養(yǎng)

從發(fā)病鵪鶉體內(nèi)分離到一株支原體，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～5 d，培養(yǎng)基顏色由玫紅色變?yōu)槌赛S色，穩(wěn)定傳代后24 h可變?yōu)槌赛S色，陰性對照不變色。在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～5 d，培養(yǎng)基表面有針尖大小、透明、光滑菌落，低倍鏡下觀察似“荷包蛋”樣，如圖1。

3.3 PCR鑒定

將分離到的支原體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，得到1條約330 bp大小的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。擴(kuò)增產(chǎn)物測序后，將測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)其與雞毒支原體的同源性最高，在87.85%～98.44%之間，說明該分離株為雞毒支原體，并將其命名為MG1203。

注：M：DL2000 Marker;1：支原體分離株;2：滑液囊支原體;3：雞毒支原體陽性對照;4：空白對照。

3.4 藥物MIC測定

選用6種抗菌藥，分別測定MIC，結(jié)果見表2。該分離株對泰妙菌素最敏感，MIC達(dá)0.00625 μg/mL，其次為酒石酸泰樂菌素、鹽酸強(qiáng)力霉素，對大觀霉素、卡那霉素、慶大霉素的敏感性較差。相比較SD株和PG31株，分離株MG1203對泰妙菌素、酒石酸泰樂菌素、鹽酸強(qiáng)力霉素的MIC均升高。

4 討論

支原體、新城疫病毒、禽流感病毒、傳染性支氣管炎病毒等都會引起的鵪鶉呼吸道疾病，臨床上很難鑒別?；灲Y(jié)果表明此次鵪鶉發(fā)病為支原體引起的。

禽支原體感染在全世界范圍內(nèi)廣泛存在，主要包括雞毒支原體感染和滑液囊支原體感染，這兩種支原體不僅能感染雞，也能感染其他禽類。本試驗從發(fā)病鵪鶉中分離到一株支原體，在改良Frey氏液體培養(yǎng)基中生長能使培養(yǎng)基顏色變黃而不渾濁，在固體培養(yǎng)基上長出“荷包蛋”樣菌落，完全符合支原體生長特性。禽支原體pvpA基因編碼的PvpA蛋白屬于MG的一個粘附因子，該蛋白是一整合于禽支原體膜上的可變蛋白，在不同株系間大小不同，常用于鑒別不同種類的支原體。因此，本試驗根據(jù)雞毒支原體的pvpA基因序列設(shè)計了一對特異性引物，對分離株進(jìn)行擴(kuò)增與測序，經(jīng)比對，發(fā)現(xiàn)該分離株為雞毒支原體。

目前，藥物防治仍是控制支原體感染的主要手段，但是抗生素的濫用也導(dǎo)致了耐藥性的產(chǎn)生。相比較本實驗室保存的雞毒支原體SD株和PG31標(biāo)準(zhǔn)株，本文分離的鵪鶉源MG1203對泰妙菌素、酒石酸泰樂菌素、鹽酸強(qiáng)力霉素的敏感性顯著降低，表明MG1203對這3種藥物產(chǎn)生了耐藥性，這可能與臨床常用這些藥物治療支原體病有關(guān)。與之前報道相比較^[9]，MG1203對酒石酸泰樂菌素的MIC明顯升高，對泰妙菌素的MIC差異不大，而對鹽酸強(qiáng)力霉素的MIC降低。因此，及時進(jìn)行藥物敏感性試驗才能更好的指導(dǎo)臨床用藥。本試驗采用更敏感、可量化的最低抑菌濃度（MIC）試驗對6種常見抗菌藥物進(jìn)行敏感性試驗，發(fā)現(xiàn)該分離株對泰妙菌素敏感性最高，可用于臨床治療。

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收稿日期：2021-07-05

作者簡介：劉麗萍（1989-），女，漢，山東高密人，研究實習(xí)員，研究生，從事禽病診斷與防控，E-mail：liulping0114@sina.com。

*通訊作者：于可響（1979-），男，漢，山東青島人，副研究員，從事禽病診斷與防控，E-mail：yukx1979@163.com。

將雞蛋加熱后，會發(fā)生什么？

雞蛋分成蛋黃、蛋清和蛋殼三層。蛋黃凝固的溫度為68～71℃，蛋清凝固的溫度為62～64℃，煮雞蛋時如果火太大，在蛋黃外面，凝固溫度低的蛋清就會迅速凝固并且變硬，從而阻礙熱量繼續(xù)向蛋黃內(nèi)傳遞，影響凝固溫度較高的蛋黃凝固，使煮出來的雞蛋清熟黃不熟。因此雞蛋應(yīng)該冷水下鍋，慢火升溫，沸騰后微火煮3～5 min，?；鸷笤俳? min。這樣煮出來的蛋清嫩，蛋黃凝固又不老，蛋白變性程度最佳，也最容易消化。而煮沸時間超過10 min的雞蛋，不但口感變老，維生素?fù)p失大，蛋白質(zhì)也會變得難消化。

但是如果煮沸數(shù)個小時甚至?xí)r間更長，雞蛋會發(fā)生什么樣的變化呢？雞蛋會被煮的過分成熟，蛋殼破碎，內(nèi)容物變成糊狀物質(zhì)。

雞蛋中充滿了卷曲的蛋白質(zhì)分子，加熱后的蛋白質(zhì)變性，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，形成一個三維結(jié)構(gòu)晶格。繼續(xù)加熱雞蛋，蛋白質(zhì)繼續(xù)形成交聯(lián)，使雞蛋內(nèi)部變得更加堅硬，蛋清也會釋放出硫化氫，這也是為什么煮過的蛋在蛋黃上也有綠色的薄膜。雖然蛋殼足夠堅固，可以在沸水中堅持一段時間，但不可能永遠(yuǎn)存在。

Deb-El Foods公司的食品科學(xué)家Shelly McKee表示：“雞蛋的內(nèi)部結(jié)構(gòu)受到蛋殼和幾層膜的保護(hù)，但是如果花足夠長的時間（幾個月）加熱，蛋殼或許就承受不了其中存在的物理或化學(xué)變化，最終導(dǎo)致雞蛋破裂，形成糊狀物。但是這些都取決于加熱的時長、蛋殼的變化和加熱所用水的水質(zhì)?！?/p>

（轉(zhuǎn)自《蛋品世界》）