小續(xù)命湯與桃紅四物湯對大鼠腦缺血再灌注損傷的干預研究

陳雙龍 齊麒 楊青素 范瑞娟

【摘 要】 目的：觀察小續(xù)命湯與桃紅四物湯對大鼠腦缺血再灌注損傷的干預作用及療效對比。方法：將120只健康雄性SD大鼠隨機分為6組（n=20）：正常組、假手術(shù)組、模型組、小續(xù)命湯組、桃紅四物湯組以及小續(xù)命湯和桃紅四物湯合用組，除正常組和假手術(shù)組不插栓線外，其余組采用線栓法制備大腦中動脈阻塞1.5 h再灌注模型，24 h后采用Garcia JH法進行大鼠神經(jīng)功能評分，造模成功后分別以1 mL·100 g-1小續(xù)命湯、桃紅四物湯、小續(xù)命湯和桃紅四物湯合用混合液進行灌胃治療，正常組和假手術(shù)組予等容量生理鹽水灌胃;術(shù)后治療第7天時將各組大鼠神經(jīng)功能評分后處死，取腦組織使用TTC染色法和Nissl染色法觀察各組大鼠腦梗死體積和大鼠神經(jīng)細胞形態(tài)和數(shù)量。結(jié)果：造模成功后，與模型組比較，小續(xù)命湯組、桃紅四物湯組及兩方合用組均能增加神經(jīng)功能評分（P<0.05），降低大鼠腦梗死體積率（P<0.05），增加大鼠大腦皮質(zhì)頂葉區(qū)尼氏體數(shù)量（P<0.05）;且兩方合用組神經(jīng)功能評分，大鼠腦梗死體積率，大腦皮質(zhì)缺血再灌注區(qū)正常存活尼氏體數(shù)量明顯優(yōu)于桃紅四物湯組及小續(xù)命湯組（P<0.05），桃紅四物湯組又顯著于小續(xù)命湯組（P<0.05）。結(jié)論：小續(xù)命湯和桃紅四物湯對大鼠腦缺血再灌注損傷均具有一定保護作用，其中以桃紅四物湯的療效為優(yōu)，而兩方合用療效較單用小續(xù)命湯和桃紅四物湯更為顯著。

【關(guān)鍵詞】 桃紅四物湯;小續(xù)命湯;腦缺血再灌注;療效對比

【中圖分類號】R285.5?? 【文獻標志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2021）16-0018-05

Intervention Study of Xiao Xumingtang and Taohong Siwu Tang on Cerebral Ischemia Reperfusion Injury in Rats

CHEN Shuanglong1 QI Qi1 YANG Qingsu1 FAN Ruijuan1*

Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550025，China

Abstract：Objective Observe the effect of Xiao Xumingtang and Taohong Siwu Tang on the effects of cerebral ischemia-reperfusion injury in rats and their curative effects.Methods 120 healthy male SD rats were randomly divided into 6 groups （n=20） normal group，sham operation group，model group，Xiao Xunmingtanggroup，Taohong Siwu Tang group，and combination group of Xiao Xumingtang and Taohong Siwu Tang，except for the normal group and the sham operation group，the middle cerebral artery occlusion 1.5 h reperfusion model was prepared by the suture method in the rest of the group.After 24 hours，the rat neurological function was scored by the Garcia JH method.After success，1 mL·100 g-1Xiao Xumingtang，Taohong Siwu Tang，Xiao Xunmingtang and Taohong Siwu Tang were used for intragastric administration.The normal group and the sham operation group were given equal volume of normal saline.On the 7th day of postoperative treatment，the rats in each group were scored for neurological function and then sacrificed.The brain tissues were collected and used TTC staining and Nissl staining to observe the cerebral infarction volume and the morphology and number of rat nerve cells in each group.Results After successful modeling，compared with the model group，the Xiao Xumingtang group，Taohong Siwu Tang group and the combination of two prescriptions can increase the neurological function score （P<0.05） and reduce the rate of cerebral infarction volume in rats （P< 0.05），increase the number of Nissl bodies in the parietal area ofthe cerebral cortex in rats （P<0.05）;and the two-party combination group has neurological function scores，rat cerebral infarction volume rate，and the number of normal surviving Nissl bodies in the cerebral cortex ischemia-reperfusion area It was significantly better than the Taohong Siwu Tang group and the Xiao Xunmingtang group（P<0.05），and the Taohong Siwu Tang group was significantly better than the Xiao Xumingtang group （P<0.05）.Conclusion Both Xiao Xumingtang and Taohong Siwu Tang have a certain protective effect on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats.Among them，Taohong Siwu Tang has the best effect，and the combined effect of the two prescriptions is better than that of Xiao Xumingtang and single use Taohong Siwu Tang is more remarkable.

Keywords：Taohong Siwu Tang; Xiao Xumingtang; Cerebralischemia-reperfusion; Comparison of Effects

腦血管疾病為臨床常見病，其致殘率和死亡率明顯高于其他疾病，嚴重影響患者家庭生活水平，有研究者對中國31個省，20歲以上約48萬的成年人做調(diào)查，顯示其患病率為1.1148%，死亡率高達0.1148%[1]，給整個社會發(fā)展帶來沉重的經(jīng)濟負擔。腦血管病成為當今人類主要關(guān)注的問題。中醫(yī)認為，中風和瘀血是腦血管病的常見病理因素。小續(xù)命湯和桃紅四物湯分別具有扶正祛風和活血除瘀的療效，是治療腦血管病的經(jīng)典方劑。有研究[2]發(fā)現(xiàn)小續(xù)命湯治療腦卒中可促進神經(jīng)功能的恢復，桃紅四物湯對神經(jīng)元損傷改善效果顯著[3]。但兩方聯(lián)合治療同一種疾病的相關(guān)研究較少，本實驗選取上述兩方合用，對大鼠腦缺血再灌注損傷模型進行干預，觀察兩方的療效差別及是否存在協(xié)同作用，以期為腦血管疾病的治療提供新思路。

1 材料

1.1 實驗動物 選取120只健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量（250±30）g，購自重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司[許可證號：SCXK（軍）2012-0011]。

1.2 實驗藥材 本實驗藥材均購自北京同仁堂（貴陽分店）。桃紅四物湯《醫(yī)壘元戎》：由桃仁、紅花、熟地黃、白芍、當歸、川芎組成，按原方比例濃縮成生藥濃度為2.1 g·mL-1的水煎液。小續(xù)命湯原方見于（唐·孫思邈《備急千金要方》）：由麻黃、桂枝、白芍、川芎、黃芩、杏仁、附子、甘草、人參、防己、防風、生姜組成以原比例配藥制為水煎劑，用蒸餾水調(diào)藥物濃度至1.5 g·mL-1。

1.3 實驗試劑和儀器 TTC染色液（北京索萊寶科技有限公司，批號：T8170）;MCAO拴線（北京西濃科技有限公司，批號：2634-50A4）;4%多聚甲醛固定液（國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)，批號：20180112）;PBS磷酸鹽緩沖液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號：ZLI-9062）;無水乙醇（江蘇海興化工有限公司，批號：GB678-90）;蘇木素染液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司，批號：BA-4097）;鹽酸（成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)，批號：20180118）;中性樹膠（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20171009）;重鉻酸鉀（成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)，批號：20180120）;濃硫酸（成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)，批號：20180119）;APES（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：ZLI-9001）;CPBS（0.01 M PH6.0）（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：ZLI-9064）;氯托洛寧（上海如吉生物科技發(fā)展有限公司，批號：180118）;轉(zhuǎn)輪式切片機（上海聚慕醫(yī)療器械有限公司，型號：徠卡-2016）;全自動封閉式組織脫水機（常州市中威電子儀器有限公司，型號：TSJ-Ⅱ）;包埋機（常州郊區(qū)中威電子儀器廠，型號：BMJ-Ⅲ）;病理組織漂烘儀（常州市中威電子儀器有限公司，型號：PHY-Ⅲ）;數(shù)碼三目攝像顯微鏡（麥克奧迪實業(yè)集團有限公司，型號：BA400Digital）;圖像分析軟件（美國Media Cybernetics公司，型號：Image-Pro Plus 6.0）。

2 方法

2.1 動物造模 按改良版Longa線栓法制備大腦中動脈阻塞1.5 h再灌注模型。實驗前對大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，術(shù)前禁食12 h，自由飲水。在大鼠予10%水合氯醛（0.3 mL·100 g-1） 麻醉下，取仰臥位固定，頸前區(qū)備皮消毒后沿頸正中線切開3～4 cm，沿胸鎖乳突肌內(nèi)側(cè)分離，找到右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈，在頸總動脈近心端穿線結(jié)扎，遠心端為松結(jié)。在頸總動脈分叉處暫時用微動脈夾夾閉。在頸總動脈兩線間，距頸總動脈分叉處5 mm左右處將直徑約0.23 mm的栓線插入頸總動脈后，取下微動脈夾。然后將栓線沿右側(cè)頸總動脈插入頸內(nèi)動脈，至大腦中動脈，插入（深度為18.5±0.5 mm）有阻力感時停止，將遠心端的拴線系緊，縫合切口缺血1.5 h后抽出栓線，并給大鼠腹腔注射1 mL·100 g-1的限制性補液。術(shù)后各組采用Garcia JH評分為8～12分的大鼠即造模成功。（ 除假手術(shù)組除不插栓線外，余下步驟同模型組）

2.2 分組及給藥 120只健康雄性SD大鼠，隨機分為正常組、假手術(shù)組、模型組、小續(xù)命湯組、桃紅四物湯組及兩方合用組，每組20只，正常組和假手術(shù)組不予任何藥物治療正常喂養(yǎng)，模型組予等容量的生理鹽水灌胃，小續(xù)命湯組、桃紅四物湯組分別以小續(xù)命湯、桃紅四物湯1 mL ·100 g-1·d-1灌胃，而兩方合用組先予小續(xù)命湯劑量（60 g·kg-1·d-1）治療3 d，后再予桃紅四物湯治療。治療至第7天時對各組大鼠進行神經(jīng)功能評分后處死，取腦組織進行TTC染色和Nissl染色。

2.3 神經(jīng)功能缺損 評分參照Garcia JH評分標準[4]，從大鼠自主運動、前爪伸展功能、體態(tài)運動的對稱性、身體雙側(cè)觸覺、網(wǎng)屏抓取實驗、雙側(cè)觸須反應(yīng)6個方面進行神經(jīng)功能評分，記錄并分別作比較。

2.4 2，3，5-氯化三苯基四氮唑 （TTC）染色按照TTC染色試劑盒說明，將腦組織置于-20 ℃冰箱中冰凍25 min后取出，制成的冠狀切片厚度約為2 mm，放入2%的TTC染液避光器皿中，置于37 ℃的恒溫烘箱中25～30 min染色，15 min翻動一次使其均勻接觸到染色液。染色后取出置于4%多聚甲醛中避光保存，固定24 h后將腦組織取出按切片順序排列拍照，并使用Image-Pro-Plus 6.0分析軟件測出腦梗死面積，再根據(jù)腦梗死體積百分率/%=腦梗死區(qū)體積/正常側(cè)大腦半球體積×100%公式計算梗死體積。

2.5 Nissl染色 使用蒸餾水沖洗固定好的腦組織，換無水乙醇脫水，二甲苯溶液透明腦組織，石蠟包埋后再切片。使用APTES浸泡撈片后置于60 ℃烤箱中60 min使切片緊密黏附，切片按常規(guī)脫蠟至水，放入經(jīng)預熱至50 ℃的1%氯托洛寧水溶液中，置于56 ℃溫箱中20 min染色，再用蒸餾水沖洗后酒精分化、脫水，鏡下控制，以尼氏小體顯示清晰為度，再使用無水乙醇脫水二甲苯透明2次后封片，在光學顯微鏡下觀察尼氏體數(shù)量和大鼠大腦皮質(zhì)缺血區(qū)進行拍照分析結(jié)果。染色后的尼氏小體可呈藍紫色。

2.6 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 23.0軟件進行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以（x±s）形式表示，組間比較為單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)分析都采用雙側(cè)檢驗法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 小續(xù)命湯和桃紅四物湯對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能的影響 正常組及假手術(shù)組大鼠均未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)（P>0.05）;模型組大鼠神經(jīng)功能評分顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，小續(xù)命湯組、桃紅四物湯組、兩方合用組大鼠神經(jīng)功能評分顯著提升（P<0.05），而兩方合用組大鼠神經(jīng)功能評分顯著高于小續(xù)命湯組和桃紅四物湯組（P<0.05），其中，桃紅四物湯組的神經(jīng)功能評分與小續(xù)命湯組比較組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

3.2 小續(xù)命湯和桃紅四物湯對腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積率的影響 正常組及假手術(shù)組大鼠腦組織切片無蒼白梗死區(qū);模型組有大范圍白色梗死灶出現(xiàn)，經(jīng)小續(xù)命湯、桃紅四物湯、兩方合用治療后大鼠腦組織切片的蒼白梗死面積均有不同程度的縮小。與模型組比較，小續(xù)命湯組、桃紅四物湯組、兩方合用組大鼠腦組織切片的腦梗死體積率均明顯降低（P<0.05）。兩方合用組的腦梗死體積率顯著低于小續(xù)命湯組和桃紅四物湯組（P<0.05），桃紅四物湯組腦梗死體積率低于小續(xù)命湯組（P<0.05）。見表2、圖1。

3.3 小續(xù)命湯和桃紅四物湯對腦缺血再灌注大鼠存活神經(jīng)元個數(shù)的影響 正常組與假手術(shù)組大鼠的神經(jīng)元個數(shù)無明顯差異（P>0.05），模型組大鼠的神經(jīng)元個數(shù)顯著減少（P<0.05）;與模型組相比，小續(xù)命湯組、桃紅四物湯組及兩方合用組神經(jīng)元存活個數(shù)顯著增多（P<0.05），兩方合用組神經(jīng)元存活個數(shù)明顯多于小續(xù)命湯組和桃紅四物湯組（P<0.05），桃紅四物湯組神經(jīng)元存活個數(shù)又多于小續(xù)命湯組（P<0.05）。見表3，圖2。

4 討論

缺血性腦血管疾病是因組織和器官血液供應(yīng)不足，多機制、多環(huán)節(jié)相互作用，出現(xiàn)一系列復雜的結(jié)構(gòu)損害和功能障礙的神經(jīng)性疾病，細胞的凋亡壞死是腦缺血再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)之一。研究[5]認為，及時恢復大腦缺血區(qū)域供血和減少神經(jīng)細胞損害是治療腦缺血再灌注損傷的關(guān)鍵。目前，對缺血性再灌注性腦損傷繼發(fā)神經(jīng)細胞損傷的發(fā)病機制并無定論，臨床上治療神經(jīng)細胞損傷的藥物也極度匱乏，因此，腦缺血再灌注損傷的病理機制、防治方法和藥物的研究是近年來的熱點所在。部分研究[6-7]發(fā)現(xiàn)小續(xù)命湯與桃紅四物湯的有效成分均可改善腦缺血再灌注損傷的癥狀及神經(jīng)細胞損傷的修復。

中醫(yī)無腦血管疾病、腦缺血再灌注這個病名，根據(jù)相關(guān)文獻記載可以參照中醫(yī)之“中風和腦卒中”進行辨證論治。小續(xù)命湯出自孫思邈《備急千金要方》，具有祛風散寒、益氣活血、通絡(luò)等功效，臨床上多用于急性腦梗死患者的治療減少神經(jīng)功能損傷，不良反應(yīng)較少[8-9]。研究[10-11]表明，該方可改善腦缺血、增加腦組織血流量，及時恢復大腦缺血區(qū)域供血減少神經(jīng)功能損傷，促進對突觸生長及神經(jīng)細胞本身的保護作用，有效恢復神經(jīng)功能和修復腦組織而改善腦缺血再灌注損傷。桃紅四物湯出自《醫(yī)壘元戎》，由四物湯加桃仁、紅花組成使之為治療腦血管疾病活血化瘀的經(jīng)典方劑。研究[12-13]發(fā)現(xiàn)該方能改善腦部血流動力學、抑制細胞的凋亡、調(diào)節(jié)神經(jīng)血管修復因子及促進腦缺血再灌注損傷大腦神經(jīng)細胞修復，減少腦梗死體積。

本實驗使用小續(xù)命湯和桃紅四物湯對腦缺血再灌注模型大鼠進行干預研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過小續(xù)命湯、桃紅四物湯及兩方合用的治療，小續(xù)命湯組、桃紅四物湯組及兩方合用組均能改善神經(jīng)功能缺損障礙，降低腦梗死體積率及增加大鼠大腦皮質(zhì)頂葉區(qū)尼氏體數(shù)量，其中以桃紅四物湯組的療效為優(yōu)，而兩方合用組的療效較單用小續(xù)命湯組和桃紅四物湯組更為顯著。在實驗過程中，我們發(fā)現(xiàn)早期單用小續(xù)命湯較單用桃紅四物湯治療大鼠的死亡率更低，神經(jīng)功能評分相對桃紅四物湯組更高，推測可能與小續(xù)命湯具有扶正祛風的作用有關(guān)，更適合應(yīng)用于急性期。

參考文獻

[1]WANG W，JING B，SUN H，et al. Prevalence，incidence，and mortality of stroke in China[J]. Circulation，2017（135）：759.

[2]WEI D F，XI E D，LI H，et al. The positive effects of Xueshuan Xinmai tablets on brain functional connectivity in acute ischemic stroke： a placebo controlled randomized trial[J]. Sci Rep，2017，7（1）;15244.

[3]HAN L，JI Z J，CHEN W D，et al.Protective effects of Tao-Hong-Si-Wu decoction on memory impairment and hippocampal damage in animal model of vascular dementia[J].Evid Based Complement Alternat Med，2015（2015）：195835.

[4]GARCIA J H，WAGNER S，LIU K F，et al.Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats.Statistical validation[J].Stroke，1995，26 （ 4 ） ：627-34.

[5]DUAN X C，HAN L，PENG D Y，et al.High Throughput mRNA Sequencing Reveals Potential TherapeuticTargets of Tao-Hong-Si-Wu Decoction in Experimental Middle Cerebral Artery Occlusion[J].Front Pharmacol， 2018（9）：1570.

[6]

FURLANIS G，AJCˇEVIC'M，STRAGAPEDE L， et al.

Ischemic Volume and Neurological Deficit：Correlation of Computed Tomography Perfusion with the National Institutes of Health Stroke Scale Score in Acute Ischemic Stroke[J].StrokeCerebrovasc Dis，2018（27）：2200-2207.

[7]熊興江.古代“中風”內(nèi)涵及《千金要方》小續(xù)命湯治療腦梗死、腦出血體會[J].中國中藥雜志，2020，45（12）：2725-2734.

[8]王艷惠.小續(xù)命湯治療急性腦梗死的臨床療效和安全性評價[J].首都食品與醫(yī)藥，2018，25（11）：138.

[9]姜祖超，朱文宗，劉斐雯，等.小續(xù)命湯對急性缺血性腦卒中患者神經(jīng)功能及中醫(yī)證候的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2019，57（5）：113-115，118.

[10]李莉，孫海洋，郭雁玲.小續(xù)命湯加減治療急性缺血性腦卒中（風火上擾證）的療效分析[J].中國中醫(yī)急癥，2020，29（4）：683-686.

[11]范瑞娟，羅亞非，陳永順，等.桃紅四物湯對大鼠腦缺血再灌注損傷后大腦皮質(zhì)神經(jīng)元Caspase-3與p53表達的影響[J].神經(jīng)解剖學雜志，2015，31（6）：739-745.

[12]黃清霞，鐘應(yīng)虎.桃紅四物湯對腦梗死神經(jīng)血管單元的臨床療效[J].深圳中西醫(yī)結(jié)合雜志，2018，28（12）：49-50.

[13]常永霞，李姣，侯文麗.滌痰湯合桃紅四物湯加減對腦梗死恢復早期痰瘀阻絡(luò)證腦神經(jīng)保護作用研究[J/OL].中國實驗方劑學雜志：1-10[2020-10-05].

（收稿日期：2021-01-14 編輯：劉 斌）

基金項目：貴州省中醫(yī)藥管理局項目（QZYY-2018-012）;貴州省高等學校大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目[貴中醫(yī)大創(chuàng)合字（2018）4 號]。

作者簡介：陳雙龍（1997-），男，土家族，本科在讀，研究方向為中醫(yī)學。E-mail：1049323800@qq.com

通信作者：范瑞娟（1987-），女，漢族，碩士，貴州中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院講師，研究方向為中醫(yī)藥對腦血管疾病的作用研究。E-mail：18286037356@163.com