兩種γ-干擾素釋放試驗試劑盒在結(jié)核病診斷中的比較研究

束玉鳳，孫正松，王金富

（江蘇揚州市第三人民醫(yī)院，江蘇 揚州 211500）

0 引言

結(jié)核病是一種慢性傳染病，由結(jié)核分枝桿菌（簡稱結(jié)核桿菌）入侵引起，在全球范圍內(nèi)稱為感染性疾病“頭號殺手”。據(jù)不完全統(tǒng)計，全球22個肺結(jié)核高疫情國家中，就包括中國，當(dāng)前我國現(xiàn)有活動性肺結(jié)核患者約170萬人，每年確診肺結(jié)核的患者有100萬人，占全球發(fā)病人數(shù)的14.3%[1]。所以說在診斷肺結(jié)核疾病的過程中，應(yīng)該落實早診斷、早治療[2]。目前，病理學(xué)診斷和細菌學(xué)診斷是結(jié)核病的主要確診手段，但是細菌學(xué)檢查的陽性率較低、耗時長，臨床上廣泛應(yīng)用的結(jié)核菌素皮膚試驗（Tuberculin skin test，TST）又受接種卡介苗、非結(jié)核分枝桿菌感染、機體免疫力等因素的影響，易產(chǎn)生假陽性、假陰性結(jié)果[3]，所以這種診斷方法準確性仍待考察。因此尋找一種準確、快速、可靠的診斷結(jié)核病方法十分迫切。近年來，以T細胞免疫為基礎(chǔ)的體外γ-干擾素釋放試驗（interferon -γ release assays，IGRA）以其較高的靈敏性及特異性備受關(guān)注[4-5]，在歐美等發(fā)達國家廣泛應(yīng)用于結(jié)核病的診斷[6]。近些年來，隨著我國醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)有關(guān)IGRA診斷方法的研究越來越多，但是大多數(shù)研究選擇的進口試劑價格昂貴，因此IGRA檢測試劑需要國產(chǎn)化[7]。鄭州安圖生物工程股份有限公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌特異性細胞免疫反應(yīng)檢測試劑盒磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法（簡稱安圖試劑）和北京萬泰生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的結(jié)核桿菌相關(guān)γ-干擾素檢測試劑盒體外酶聯(lián)免疫法（簡稱萬泰試劑）均選取了卡介苗及大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌沒有的6-kDa early secreted antigenic target（ESAT-6）和10-kDa culture filtrate protein（CFP-10）作為結(jié)核桿菌特異性抗原[8]，因而IGRA不受卡介苗接種和非結(jié)核桿菌感染的影響，因此在結(jié)核桿菌潛伏感染或活動結(jié)核病的診斷過程中可以進行輔助診斷。本次研究針對在結(jié)核病診斷中應(yīng)用兩種試劑的敏感度、特異度、一致性進行深入分析，進而研究這種方法的作用效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料。擇取2018年1～5月在揚州市第三人民醫(yī)院住院確診結(jié)核患者87例，年齡19～93歲，平均（54±3）歲，根據(jù)痰涂片結(jié)果分為涂片陰性結(jié)核病組61例，涂片陽性結(jié)核病組26例。

1.2 所有患者均根據(jù)《傳染性肺結(jié)核診斷標準及處理原則》確診為肺結(jié)核[10]：①抗酸桿菌檢查利用分離培養(yǎng)法、痰標本涂片鏡檢檢查結(jié)果二次以上陰性；②胸部X線攝片結(jié)果為活動性肺結(jié)核征象；③均存在咳嗽、咳痰、疲乏、胸悶氣短、胸痛、低燒、食欲不振、血痰或咯血、體重減輕、月經(jīng)失調(diào)等癥狀；④5個單位結(jié)核菌素（OT或 PPD-T）皮內(nèi)注射，72 h注射局部硬結(jié)反應(yīng)直徑超過5 mm；⑤肺部病理標本經(jīng)病理學(xué)診斷為結(jié)核病變。具備①②或同時伴有③④中一項者，以及具備①⑤者，均可確診。80例非結(jié)核組：包括非結(jié)核性肺部疾病患者67例和健康志愿者13名，其中男l(wèi)例，女16例；年齡24～82歲，平均54歲；PPD試驗均為陰性，為結(jié)核分枝桿菌（MTB）染低暴露風(fēng)險人群。本次研究入選患者均知曉研究并自愿加入，本次研究通過醫(yī)院倫理委員會審核批準。

1.3 儀器與試劑。ALISEI酶標儀、AUTO2000化學(xué)發(fā)光儀、電恒浴箱、北京萬泰生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的結(jié)核桿菌相關(guān)γ-干擾素檢測試劑盒（體外酶聯(lián)免疫法）（簡稱酶免試劑）和鄭州安圖生物工程股份有限公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌特異性細胞免疫反應(yīng)檢測試劑盒（磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法）（簡稱發(fā)光試劑）。

1.4 方法

1.4.1 安圖試劑檢測步驟：將陰性對照培養(yǎng)液（N）、陽性對照培養(yǎng)液（P）、測試培養(yǎng)液（T）各100 μl分別加到對應(yīng)的培養(yǎng)孔內(nèi)，采集的新鮮全血4 mL置入肝素抗凝管保存，在8 h內(nèi)檢驗完畢，將全血標本輕柔顛倒混勻3～5次后按“N”、“T”、“P”的順序加入到含有培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)板相應(yīng)的孔內(nèi)，1 mL/孔，蓋緊培養(yǎng)板上蓋并直立置于37℃溫箱中培養(yǎng)培養(yǎng)16～24 h后取出，靜置1 min小心開蓋，從每個細胞培養(yǎng)板孔中吸取上清液200 ul進行γ-干擾素（IFN-γ）含量的檢測。結(jié)果判斷通過參考試劑盒說明書鑒定。

1.4.2 萬泰試劑檢測步驟：用肝素抗凝真空采血管采集新鮮全血4 mL，所有全血標本在2 h內(nèi)緩慢顛倒混勻3～5次后按“N”、“T”、“P”的順序加入到對應(yīng)的培養(yǎng)管中，1 mL/管，并直立置于37℃溫箱中培養(yǎng)培養(yǎng)20～24 h后取出，以3500 r/min離心10 min收集上清液，用ELISA法定量檢測上清液中γ-干擾素的含量。參結(jié)果判斷通過參考試劑盒說明書鑒定。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析。采用SPSS 13.0軟件進行分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)光法和酶免法在不同組別檢出率。發(fā)光試劑在結(jié)核病組、菌陽組、菌陰組的檢出率分別為74.71%、75.41%、73.08%；酶免試劑在結(jié)核病組、菌陽組、菌陰組的檢出率分別為68.97%、65.57%、76.92%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；發(fā)光試劑和酶免試劑在非結(jié)核肺部疾病組的檢出率分別為25.32%，22.78，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。發(fā)光試劑在老年組肺結(jié)核和中青年組肺結(jié)核患者中的檢出率分別為63.64%、79.63%，酶免試劑在老年組肺結(jié)核和中青年組肺結(jié)核患者中的檢出率分別為57.58%、74.07%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），詳情見表1、表2。

表1 不同組別的檢測結(jié)果[n（%）]

表2 兩種試劑盒對中青年結(jié)核病患者與老年結(jié)核病患者檢測的檢出率比較

2.2 方法學(xué)比較。發(fā)光試劑和酶免試劑的敏感度分別為74.71%，68.97%，特異度分別為74.68%，77.22%，準確度分別為74.70%，72.89%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），詳情見表3。

表3 兩種試劑盒靈敏度、特異度、預(yù)測值和似然比比較（n，%）

3 討論

本院是結(jié)核病定點醫(yī)院之一，從臨床上看，結(jié)核潛伏感染率較高人群為非結(jié)核肺部疾病患者，因此在非結(jié)核肺部疾病患者中IGRA檢測結(jié)果陰性的排除診斷價值明顯超過檢測結(jié)果陽性的診斷價值，IGRA是當(dāng)前最有效診斷各型結(jié)核病的輔助手段，具有快速有效的特點，尤其對菌陰結(jié)核病的應(yīng)用價值更高。目前化學(xué)發(fā)光法用于檢測結(jié)核感染，使得傳統(tǒng)的IGRA檢測更加快捷，全自動化，人為干擾因素減少，不僅能提高結(jié)核的診斷效率，更加節(jié)約人力資源，該方法學(xué)適宜在臨床推廣應(yīng)用。

目前，全球已經(jīng)有25個國家發(fā)布了應(yīng)用指南。美國CDC建議，PPD試驗當(dāng)前完全可以被IGRA替代；瑞士肺科協(xié)會建議，必須在接受抗腫瘤壞死因子α治療前，進行IGRA結(jié)核桿菌感染篩查；WHO組織和歐洲疾病預(yù)防控制中心也相繼發(fā)布了應(yīng)用指南。不僅如此，中國衛(wèi)生和計劃生育委員也將IGRA檢測加入了最新頒布的肺結(jié)核診斷標準中[14]。IGRA 是一個非常有效的輔助診斷方法，在臨床上可以作為痰菌陰性肺結(jié)核診斷金標準之外的一種技術(shù)，發(fā)展前景較高。