誘變結(jié)合小孢子培養(yǎng)的氮高效大麥DH株系評(píng)價(jià)

高潤(rùn)紅，徐紅衛(wèi)，郭桂梅，宗營(yíng)杰，李穎波，杜志釗，陳志偉，陸瑞菊，王亦菲，劉成洪

(1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 上海 201106; 2.上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201106;3.上海市農(nóng)業(yè)科技服務(wù)中心，上海200335)

氮素是作物生長(zhǎng)所必需的元素之一，近幾十年農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力的提高與氮肥使用量大幅增加有關(guān)[1]。由于谷類作物的氮效率比較低，只有33%的肥料氮在谷物中得到利用[2]。過量的氮肥施用會(huì)導(dǎo)致資源的巨大浪費(fèi)以及潛在的主要污染物[3]，因此，提高作物氮效率是作物改良的主要 目標(biāo)。

大麥作為世界上第四大谷類作物，主要用于動(dòng)物飼料和啤酒釀造。到目前為止，大麥育種主要集中在提高籽粒產(chǎn)量和品質(zhì)上，與此同時(shí)氮效率也得到了提高，而且氮效率的兩個(gè)組成部分氮素吸收效率和氮素利用效率在基因型間也存在顯著差異[4]。但是由于集約化的育種和栽培導(dǎo)致大麥的遺傳多樣性變窄，成為遺傳改良的瓶頸[5]，因此，創(chuàng)制和篩選氮高效突變體的種質(zhì)資源成為氮高效育種的一種有效的方法。

單倍體和加倍單倍體是加速植物育種的一種特別有吸引力的生物技術(shù)方法。單倍體技術(shù)通過配子胚胎發(fā)生，使雜合子親本一步培育出完整的純合品系，已經(jīng)對(duì)許多農(nóng)作物產(chǎn)生了重要的影響[6]。加倍單倍體在單倍體誘導(dǎo)后的第一個(gè)世代就能達(dá)到100%的純合率，不僅加速育種進(jìn)程，而且從單倍體中獲得目的基因型(包括突變體)所需要的群體規(guī)模較小，同時(shí)也可以用于發(fā)現(xiàn)隱性、顯性以及有害性突變等[7]。單倍體誘導(dǎo)系統(tǒng)為突變體的誘導(dǎo)和選擇提供了一個(gè)理想的靶位點(diǎn)[6]。小孢子培養(yǎng)技術(shù)是產(chǎn)生單倍體的主要手段，通過誘變并與小孢子培養(yǎng)相結(jié)合可以在第一代中篩選隱性突變體，避免嵌合體；通過加倍能夠獲得純合穩(wěn)定的突變體，縮短純合突變體產(chǎn)生的周期[8]，而且在一個(gè)培養(yǎng)體系里可同時(shí)實(shí)現(xiàn)突變體的誘變、篩選和純合穩(wěn)定[9]。誘變結(jié)合小孢子低氮脅迫培養(yǎng)獲得低氮高效突變體材料已經(jīng)在前期的工作中得到驗(yàn)證[10]，獲得的低氮高效突變體材料氮效率的提高均是由于氮素吸收效率提高所導(dǎo)致[11-12]，還未篩選到氮素利用效率提高的突變體材料。

本實(shí)驗(yàn)室利用誘變并結(jié)合小孢子低氮脅迫培養(yǎng)創(chuàng)制了一批DH株系，經(jīng)過連續(xù)多年的田間肥力水平鑒定，獲得表現(xiàn)優(yōu)異的突變體材料。本研究以花30不同誘變來源的8份DH株系為研究對(duì)象，在兩個(gè)氮肥水平下，以產(chǎn)量為標(biāo)準(zhǔn)將其劃分為不同的氮效率類型，同時(shí)對(duì)雙高效類型和低氮高效類型的株系進(jìn)行干物質(zhì)和氮素積累、轉(zhuǎn)運(yùn)特征以及氮效率相關(guān)指標(biāo)分析，以期為大麥氮高效篩選評(píng)價(jià)機(jī)制提供依據(jù)，并為氮高效品種的選育奠定材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為大麥(HordeumvulgareL.)品種花30以及花30不同組織(小孢子、種子和離體穗)經(jīng)過化學(xué)或者物理誘變并結(jié)合小孢子低氮脅迫培養(yǎng)獲得的8份DH株系，分別為A1-184、A1-226、A9-41、A9-47、A4-17、A4-21、A5-24和A11-15。其中A1-184和A1-226是離體小孢子經(jīng)過3 mg·L-1的甲基磺酸乙酯(ethyl methyl sulfone, EMS)誘變后低氮脅迫培養(yǎng)獲得；A9-47和A9-41是離體小孢子經(jīng)過5 mg·L-1的EMS誘變后低氮脅迫培養(yǎng)獲得；A4-17和A4-21是干種子經(jīng)過400 GY的鈷60(60Co)輻照后田間種植，取游離小孢子低氮脅迫培養(yǎng)獲得；A5-24是干種子經(jīng)過500 GY的60Co輻照后田間種植，取游離小孢子低氮脅迫培養(yǎng)獲得；A11-15是離體穗經(jīng)過5 GY的60Co輻照后，取游離小孢子低氮脅迫培養(yǎng)獲得。材料創(chuàng)制方法詳情見陸瑞菊等[13]的 方法。

1.2 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2018-2019年在上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院重固試驗(yàn)基地進(jìn)行。大田試驗(yàn)采取裂區(qū)設(shè)計(jì)，氮肥水平為主因素，株系為副因素，3次重復(fù)，小區(qū)行長(zhǎng)3.3 m，行距0.33 m，每個(gè)材料種5行，每行180粒種子?；久鐬?50萬株·hm-2。施肥水平為45 kg·hm-2純氮(低氮)和160 kg·hm-2純氮(高氮)。低氮只施入基肥，高氮施入基肥和追肥，基肥與追肥分配比例是3∶7，以氮磷鉀復(fù)合肥(各占15%)作為基肥在播種之前均勻施入，尿素(含N 46%)作為追肥，在分蘗期和拔節(jié)期分1∶1施入。其他措施按照一般田間管理方式進(jìn)行。

1.3 樣品采集與測(cè)定

于開花期與成熟期，每個(gè)小區(qū)隨機(jī)選取5株生長(zhǎng)表現(xiàn)一致的單株，分穗子和營(yíng)養(yǎng)器官收獲，105 ℃殺青30 min，75 ℃烘干至恒重，稱干重并記錄。粉碎后精確稱取0.100 0 g，濃硫酸消煮后定容至100 mL，取5 mL利用連續(xù)流動(dòng)分析儀進(jìn)行氮素含量測(cè)定。

1.4 計(jì)算方法

干物質(zhì)積累量、氮素積累量、花前干物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)量(花后干物質(zhì)積累量)對(duì)籽粒產(chǎn)量的貢獻(xiàn)率和花前氮素轉(zhuǎn)運(yùn)量(花后氮素積累量)對(duì)籽粒氮素含量的貢獻(xiàn)率的計(jì)算參考熊淑萍等[14]的方法；氮效率、氮素吸收效率以及氮素利用效率的計(jì)算參考Moll等[15]的方法。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行整理，并利用DPS 7.05軟件進(jìn)行顯著性分析(LSD法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間氮高效株系的篩選

為了篩選氮高效株系，以產(chǎn)量性狀為指標(biāo)，分別在高氮和低氮水平下進(jìn)行比較分析。從表1可以看出，以親本花30作為對(duì)照，在高氮水平下有2份DH株系(A9-47和A1-184)的產(chǎn)量顯著高于花30；低氮水平下有3份DH株系(A5-24、A4-17和A9-47)的產(chǎn)量顯著高于花30。在田間施氮量降低70%的情況下，產(chǎn)量也明顯下降；與高氮水平相比，低氮水平下大多數(shù)株系包括親本花30的產(chǎn)量均下降了60%以上，其中，A9-41和A1-226的降幅達(dá)到了70%以上，說明這兩份株系對(duì)氮肥比較敏感；在這些株系中只有A5-24和A4-17的產(chǎn)量下降的幅度在60%以下，說明這兩份材料的耐低氮性要比其他株系好。

表1 花30和不同DH株系在兩個(gè)氮肥水平下的產(chǎn)量表現(xiàn)Table 1 Different yield performance of Hua 30 and the DH lines under two nitrogen fertilizer levels

Ⅰ：雙高效型；Ⅱ：低氮高效型；Ⅲ：雙低效型；Ⅳ：高氮高效型。H30：花30；HN：高氮；LN：低氮。

為了明確不同DH株系對(duì)氮肥的響應(yīng)，以高氮和低氮水平下的平均產(chǎn)量為基準(zhǔn)，將包括花30在內(nèi)的9份株系分為4個(gè)不同的區(qū)。從圖1可以看出，A9-47和A1-184為雙高效類型，這2個(gè)DH株系在高氮和低氮水平下產(chǎn)量都高于供試株系的平均產(chǎn)量；A4-17和A5-24為低氮高效類型，這2個(gè)DH株系在低氮水平下產(chǎn)量高于供試株系的平均產(chǎn)量；A11-15、A4-21和花30歸為雙低效類型，這3個(gè)株系在高氮和低氮水平下產(chǎn)量均低于供試株系的平均產(chǎn)量；A1-226和A9-41歸于高氮高效類型，這2個(gè)株系只有在高氮水平下產(chǎn)量才高于供試株系的平均產(chǎn)量。

2.2 不同氮肥水平下雙高效和低氮高效類型株系與親本花30開花期和成熟期的干物質(zhì)和氮素積累以及轉(zhuǎn)運(yùn)特征

基于環(huán)境友好型考慮，分析了雙高效和低氮高效類型中4份材料的干物質(zhì)和氮素積累特征(表2)。高氮水平下，開花期和成熟期A9-47和A1-184的干物質(zhì)積累量以及A9-47的氮素積累量均顯著高于親本花30。低氮水平下，開花期A9-47和A1-184的干物質(zhì)積累量和氮素積累量均顯著高于親本花30，成熟期四份株系的干物質(zhì)積累量均顯著高于親本花30，其中A5-24和A9-47的氮素積累量也顯著高于親本花30。說明氮高效株系具有較高的干物質(zhì)和氮素積累能力。

對(duì)花前干物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)量(花后干物質(zhì)積累量)對(duì)籽粒產(chǎn)量的貢獻(xiàn)以及花前氮素轉(zhuǎn)運(yùn)量(花后氮素積累量)對(duì)籽粒氮素含量的貢獻(xiàn)進(jìn)行分析。結(jié)果(表3)表明，無論高氮還是低氮水平，花后干物質(zhì)積累量對(duì)籽粒產(chǎn)量占主要貢獻(xiàn)，而高氮水平下花前氮素轉(zhuǎn)運(yùn)量對(duì)籽粒氮素的含量占主要貢獻(xiàn)，低氮水平下花后氮素積累量占主要貢獻(xiàn)。對(duì)于不同株系而言，高氮水平下，A5-24和A9-47的花前干物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)量對(duì)籽粒產(chǎn)量的貢獻(xiàn)率顯著高于花30，而花30的花后干物質(zhì)積累量對(duì)籽粒產(chǎn)量的貢獻(xiàn)率最高，顯著高于A5-24和A9-47，與其他株系之間差異不顯著；A5-24和A1-184的花前氮素轉(zhuǎn)運(yùn)量對(duì)籽粒氮素的貢獻(xiàn)率顯著高于A4-17，和親本花30和A9-47之間差異不顯著，而A4-17的花后氮素積累量對(duì)籽粒氮素的貢獻(xiàn)率顯著高于A5-24，與親本花30、A9-47和A1-184之間差異不顯著。低氮水平下，A1-184的花前干物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)量對(duì)籽粒產(chǎn)量的貢獻(xiàn)率最大，其次是花30和A9-47，三者之間差異不顯著，A1-184的花前干物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)量對(duì)籽粒產(chǎn)量的貢獻(xiàn)率顯著高于A5-24和A4-17，而A4-17的花后干物質(zhì)積累量對(duì)籽粒產(chǎn)量的貢獻(xiàn)率顯著高于A1-184，與其他株系之間差異不顯著；A1-184的花前氮素轉(zhuǎn)運(yùn)量對(duì)籽粒氮素的貢獻(xiàn)率最大，其次是花30，兩者之間差異不顯著，而A1-184的花前氮素轉(zhuǎn)運(yùn)量對(duì)籽粒氮素的貢獻(xiàn)率顯著高于A9-47、A5-24和A4-17，且花30的花前氮素轉(zhuǎn)運(yùn)量對(duì)籽粒氮素的貢獻(xiàn)率顯著高于A4-17，而A4-17的花后氮素積累量對(duì)籽粒氮素的貢獻(xiàn)率顯著高于花30和A1-184，且A5-24、A4-17和A9-47的花后氮素積累量對(duì)籽粒氮素的貢獻(xiàn)率均顯著高于A1-184。說明同一類型株系之間的花前干物質(zhì)(氮素)轉(zhuǎn)運(yùn)量和花后干物質(zhì)(氮素)積累量對(duì)籽粒產(chǎn)量(氮素)的貢獻(xiàn)也可能存在顯著的差異，推測(cè)同一類型株系之間也可能存在不同的氮素吸收利用機(jī)制。

表3 花30與不同DH株系干物質(zhì)和氮素轉(zhuǎn)運(yùn)特征Table 3 Characteristics of dry matter and nitrogen transportations between Hua 30 and DH lines

2.3 不同氮肥水平下雙高效和低氮高效類型株系的氮素吸收利用效率分析

從表4可以看出，高氮水平下，A9-47和A1-184的氮效率與親本花30相比，分別提高了 19.54%和19.68%，均顯著高于親本花30；A9-47的氮素吸收效率顯著高于親本花30，是花30的1.5倍；A1-184的氮素利用效率顯著高于親本花30，增幅14.53%。低氮水平下，A5-24和A9-47的氮效率和氮素吸收效率均顯著高于親本花30，增幅在20%以上，而A4-17的氮素利用效率略高于親本花30，但差異不顯著。說明在高氮水平下，A9-47氮效率的提高主要是由于氮素吸收效率的提高所導(dǎo)致，而A1-184氮效率的提高主要是由于氮素利用效率的提高所導(dǎo)致；在低氮水平下，A9-47和A5-24氮效率的提高主要是由于氮素吸收效率的提高所導(dǎo)致，A4-17具有相對(duì)較高的氮素利用效率，但氮效率與親本花30差異不顯著。值得注意的是，低氮水平能夠提高氮效率和氮素利用效率，表明低氮處理下較高的氮素同化能力能夠促使氮效率提高并促進(jìn)產(chǎn)量增加。

表4 花30與不同DH株系在兩個(gè)氮肥水平下的氮素吸收利用情況Table 4 Difference of nitrogen use efficiency, nitrogen uptake efficiency and nitrogen utilization efficiency among Hua 30 and DH lines under two nitrogen fertilizer levels

3 討 論

3.1 關(guān)于氮效率類型的劃分

氮素在農(nóng)業(yè)和食物系統(tǒng)中的行為與資源、環(huán)境、食物安全和人體健康等密切相關(guān)，是反映農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展的關(guān)鍵指標(biāo)[16]，氮高效種質(zhì)資源的創(chuàng)制和新品種培育是發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)的一個(gè)重要途徑。氮效率被定義為單位面積土壤供氮量所產(chǎn)生的作物籽粒產(chǎn)量，在同一個(gè)供氮水平下，多以籽粒產(chǎn)量作為氮效率評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)[17-18]。本研究在兩個(gè)氮肥水平下根據(jù)籽粒平均產(chǎn)量將花30及8份DH株系劃分為雙高效、低氮高效、高氮高效和雙低效四種類型?；?0作為親本被劃分為雙低效型，A1-184和A9-47被劃分為雙高效型，其在高氮和低氮下均能夠獲得較高的籽粒產(chǎn)量，這兩個(gè)株系在實(shí)際生產(chǎn)中具有較大的應(yīng)用潛力。A5-24和A4-17被劃分為低氮高效型，這兩個(gè)株系在低氮脅迫下能更好的吸收和利用氮素，可能存在氮高效吸收利用的分子機(jī)制。

目前，世界各地大多數(shù)品種測(cè)試系統(tǒng)都使用相對(duì)較高的氮素供應(yīng)，育種者選擇的都是在這種水平下表現(xiàn)較好的品種，但是由于基因型和供氮量的互作，高氮水平下選擇的高產(chǎn)品種在低氮水平下表現(xiàn)并不一定優(yōu)異[19]，因此，為了可靠地確定哪些品種在低氮水平下產(chǎn)量較高，需要在低氮水平下進(jìn)行育種和測(cè)試[20]。Gouis等[21]證實(shí)了低氮水平下籽粒產(chǎn)量存在遺傳變異，基因型和氮素互作顯著；徐 晴等[17]認(rèn)為，低氮處理更容易顯示出不同種質(zhì)在氮素利用相關(guān)性狀上的差異；黃 億等[22]認(rèn)為，氮高效基因型大麥在各個(gè)生育期的物質(zhì)生產(chǎn)和氮素積累能力強(qiáng)，而且低氮處理下優(yōu)勢(shì)較為明顯；Brancourt-Hulmel等[20]已經(jīng)證明，小麥在低氮水平下進(jìn)行直接選擇會(huì)更有效。本研究中A5-24和A4-17在低氮水平下的優(yōu)異表現(xiàn)也證明了這一點(diǎn)，說明進(jìn)行低氮脅迫篩選有必要且有用。

3.2 關(guān)于開花前后干物質(zhì)和氮素積累量對(duì)籽粒產(chǎn)量的影響

植物在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期，根系和葉片起到儲(chǔ)存器官的作用，吸收無機(jī)氮用于氨基酸和蛋白質(zhì)的合成；在轉(zhuǎn)運(yùn)期，植物根系和葉片將營(yíng)養(yǎng)器官中儲(chǔ)存的氮素轉(zhuǎn)移到生殖器官[23-24]。有研究表明，大多數(shù)氮素在開花期之前積累在營(yíng)養(yǎng)器官中，而在花后吸收的氮素很少，籽粒中的氮素積累主要依賴于營(yíng)養(yǎng)器官的氮素供應(yīng)[25-26]。本研究中，在氮素充足的條件下，同一個(gè)株系開花期和成熟期的氮素積累量之間差異較小，說明籽粒中積累的氮素在開花前就已經(jīng)積累在營(yíng)養(yǎng)器官中，而且花前氮素轉(zhuǎn)運(yùn)量對(duì)籽粒氮素的貢獻(xiàn)率大于花后氮素積累量，也證明了這一觀點(diǎn)。而在低氮脅迫條件下，花前干物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)量對(duì)籽粒產(chǎn)量的貢獻(xiàn)率和花前氮素轉(zhuǎn)運(yùn)量對(duì)籽粒氮素貢獻(xiàn)率都比較小，可能是由于缺氮導(dǎo)致光合作用受阻，抑制營(yíng)養(yǎng)體的生長(zhǎng)，使籽粒干重和氮素含量主要來源于花后干物質(zhì)和氮素的積累。

作物干物質(zhì)生產(chǎn)和氮素積累特性與產(chǎn)量和氮效率關(guān)系密切[22]。徐 晴等[17]認(rèn)為，氮素高效小麥應(yīng)具有較高的形成生物學(xué)產(chǎn)量和積累氮素的能力；李淑文等[27]表明，氮脅迫條件下小麥生育中后期較強(qiáng)的氮素吸收能力是氮高效品種在缺氮條件下籽粒產(chǎn)量和氮效率提高的重要生理基礎(chǔ)；Worku等[28]研究表明，低氮條件下熱帶玉米雜交種的高產(chǎn)與后期較高的氮素吸收量、單位氮素積累量和氮素收獲指數(shù)密切相關(guān)。葉利庭等[29]認(rèn)為，齊穗后氮高效水稻具有較強(qiáng)的氮素吸收或轉(zhuǎn)運(yùn)能力才能滿足植株對(duì)氮素的利用。在本研究中，對(duì)于雙高效型株系A(chǔ)9-47和A1-184而言，不管是高氮水平還是低氮水平，開花期和成熟期的干物質(zhì)和氮素積累量均高于或者顯著高于親本花30；低氮水平下，A5-24和A4-17在成熟期的干物質(zhì)和氮素積累量均高于或者顯著高于親本花30，這種較高的干物質(zhì)和氮素積累能力為籽粒產(chǎn)量的提高奠定生理基礎(chǔ)，同時(shí)也可以作為氮高效種質(zhì)材料篩選的基礎(chǔ)指標(biāo)。

3.3 關(guān)于氮素高效吸收(NUpE)與氮素高效利用(NUtE)材料的獲得

氮效率可以被分為氮素吸收效率和氮素利用效率兩部分，這兩個(gè)部分哪個(gè)更重要尚無統(tǒng)一報(bào)道。在玉米中有報(bào)道認(rèn)為，在高氮水平下，氮效率的變化可以用氮素吸收能力的變化來解釋，而在低氮水平下，氮效率的變化主要是由于氮素利用效率的不同導(dǎo)致的[15,30]；劉 鵬等[31]認(rèn)為，高粱在高氮處理水平下，氮素吸收效率和氮素利用效率對(duì)氮效率貢獻(xiàn)相同，而在低氮處理水平下，氮素利用效率對(duì)氮效率貢獻(xiàn)大于氮素吸收效率；張亞麗等[18]認(rèn)為，吸氮量和氮素利用效率對(duì)產(chǎn)量的貢獻(xiàn)率受到水稻生育期的影響，對(duì)于生育期較短的水稻，無論供氮水平高低，均是氮素利用效率對(duì)產(chǎn)量起決定作用；而生育期較長(zhǎng)的水稻，低氮水平下是氮生理利用效率起決定作用，高氮水平下是氮吸收量起決定作用；Worku等[28]研究表明，低氮水平下玉米的氮素吸收效率和氮素利用效率對(duì)氮效率有同等貢獻(xiàn)；在前期工作中我們篩選到了氮高效大麥種質(zhì)材料，不管是高氮還是低氮水平，氮效率的提高均是由氮素吸收效率提高導(dǎo)致的[11-12]，而在本研究中不僅篩選到了氮素吸收效率提高的DH株系A(chǔ)9-47和A5-24，而且也篩選到了氮素利用效率提高的DH株系A(chǔ)1-184和A4-17。高氮水平下，A1-184的氮素吸收效率和親本花30沒有顯著差異，但是氮素利用效率的顯著提高導(dǎo)致了氮效率的提高；而低氮水平下，A4-17的氮素利用效率也略高于親本花30，從而促使產(chǎn)量的 提高。