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    芽殖酵母Sik1蛋白在紡錘體定位中的功能

    2021-06-25 02:13:26唐仙英龐文穎海力滕雪張楠朱順
    關(guān)鍵詞:紡錘體雙核母細(xì)胞

    唐仙英,龐文穎,海力,滕雪,張楠,朱順

    (中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 & 武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 &生物技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430074)

    紡錘體是在有絲分裂過程中驅(qū)動染色體分離的細(xì)胞器. 在不對稱性分裂的細(xì)胞中,紡錘體的正確定位還決定兩個子細(xì)胞的命運(yùn)[1]. 目前的研究已從細(xì)胞皮層、動力蛋白和星體微管網(wǎng)絡(luò)等方面對紡錘體定位的機(jī)理進(jìn)行了闡釋[2]. 在模式生物芽殖酵母(Saccharomycescerevisiae)中,已知的調(diào)控紡錘體定位的重要通路有兩條:一條由動力蛋白Dynein介導(dǎo),另一條由Kar9介導(dǎo)[3]. 二者在不同階段調(diào)控紡錘體的定位,其中Kar9通路負(fù)責(zé)將短紡錘體從母細(xì)胞移向母-芽頸,而Dynein通路則負(fù)責(zé)將紡錘體通過母-芽頸拉入子細(xì)胞[4-5].

    在Dynein通路中,動力蛋白Dynein先結(jié)合于星體微管正端,在隨微管擺動過程中被細(xì)胞皮層上的Num1蛋白(Nuclear migration 1)捕獲并激活,這一過程稱為卸載;然后Dynein通過水解ATP向星體微管負(fù)端運(yùn)動并產(chǎn)生拉力,使紡錘體和細(xì)胞核穿過母-芽頸而從母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到子細(xì)胞中[6],這一過程稱為核遷移.

    Num1是Dynein在細(xì)胞皮層上的錨定蛋白.NUM1基因缺失將使細(xì)胞核向子細(xì)胞的轉(zhuǎn)移失敗,導(dǎo)致雙核細(xì)胞的產(chǎn)生[7]. Num1蛋白是一個由多結(jié)構(gòu)域組成的約313 kD的大分子蛋白,它在質(zhì)膜上成簇分布,其C末端的PH結(jié)構(gòu)域與質(zhì)膜上的4,5-二磷酸磷脂?;?PI4,5P2)結(jié)合,由此將Num1定位在質(zhì)膜上. 同時,其N末端的CC結(jié)構(gòu)域與線粒體膜上的心磷脂結(jié)合,使Num1和線粒體相連[8].

    Sik1(suppressors of IκB),別名Nop56[9],是一種進(jìn)化保守的核仁蛋白,參與rRNA的加工過程[10]. 有研究表明,過表達(dá)SIK1基因的細(xì)胞比同樣條件下培養(yǎng)的野生型細(xì)胞體積大5%左右,且G1期進(jìn)程縮短,但有絲分裂進(jìn)程延長[11],這是因?yàn)檫^表達(dá)SIK1破壞了微管的功能,使紡錘體定位受損. 但是,該紡錘體定位受損是否足以影響核遷移,以及Sik1是否在Kar9或Dynein通路中扮演角色,目前還未知. 本實(shí)驗(yàn)室通過Num1的CC結(jié)構(gòu)域的Pull down實(shí)驗(yàn)篩選出了一系列Num1的互作蛋白[12],Sik1是其中一員,因此推測二者可能存在功能關(guān)系. 本研究將從這一觀點(diǎn)出發(fā),檢測Sik1在核遷移中的作用及與Num1的功能關(guān)系.

    1 材料與方法

    1.1 材料和儀器

    Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase (Vazyme);魚精DNA (Invitrogen);凝膠回收試劑盒 (OMEGA);DMSO (Sigma);G418 (上海生工);PVDF膜 (Immobilon?-P Membrane, 0.45 μm);Zymolase (ZYMO research);鼠源HA抗體、GFP抗體(Genescript).

    孢子解離顯微操作儀(MSM400,英國Singer),珠磨式細(xì)胞破碎儀(Mini Bead Beater-16, 美國BioSpec);微量冷凍離心機(jī)(FC5515R, 美國OHAUS);顯微鏡(BX53,日本Olympus).

    1.2 質(zhì)粒與酵母菌株

    本實(shí)驗(yàn)中所用的菌株見表1. 所用質(zhì)粒為pFA6a-kanMX6-GAL1p-3HA[13], pBJ1351(pRS305:Tub1-GFP).

    表1 本實(shí)驗(yàn)所用酵母菌株Tab.1 Yeast strains used in this study

    1.3 培養(yǎng)基

    YPD培養(yǎng)基,SC(synthetic complete)培養(yǎng)基參照LONGTINE 等[13],YPG培養(yǎng)基用半乳糖取代蔗糖,其他同YPD培養(yǎng)基. 用于誘導(dǎo)二倍體細(xì)胞減數(shù)分裂的SPM培養(yǎng)基為:酵母提取物 1 g/L, CSM 0.2 g/L, 蔗糖 0.5 g/L, 醋酸鉀 10 g/L.

    1.4 SIK1基因過表達(dá)菌株的構(gòu)建

    PCR擴(kuò)增待轉(zhuǎn)化片段:利用PCR反應(yīng)從質(zhì)粒pFA6a-kanMX6-PGAL1-3HA[13]上擴(kuò)增KanMX6-GAL1p-3HA片段,上游引物Tang130,下游引物Tang131,引物序列見表2,使用50 μL體系進(jìn)行擴(kuò)增:ddH2O 18 μL; 2×SF Buffer 25 μL; 模板50~400 ng; Tang130 (10 μM) 2 μL; Tang131 (10 μM) 2 μL; dNTPs mixture 1 μL; Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL. PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃ 3 min;98 ℃ 10 s,45 ℃ 20 s,72 ℃ 2 min,2個循環(huán);98 ℃ 10 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 2 min,33個循環(huán);72 ℃ 8 min;12 ℃保存.

    表2 引物序列Tab.2 Sequence of primers

    回收目的片段:將PCR反應(yīng)產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中電泳,切下目的條帶回收.

    制備YWL36的感受態(tài)細(xì)胞及轉(zhuǎn)化:采用醋酸鋰程序制備感受態(tài)細(xì)胞并轉(zhuǎn)化[13]. 轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布于含G418的YPG固體培養(yǎng)基上,30 ℃培養(yǎng)24 h后將細(xì)胞復(fù)制于新的含G418的YPG固體培養(yǎng)基,30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)至長出克隆.

    克隆鑒定:挑取數(shù)個單克隆在新的YPG固體培養(yǎng)基上劃線兩次,將最終得到的單克隆接種至3 mL YPG液體培養(yǎng)基中,在30 ℃搖床中培養(yǎng)至對數(shù)期,提取總蛋白,進(jìn)行Western blot檢測.

    1.5 TCA(三氯乙酸)法提取總蛋白

    TCA法提取總蛋白參照Tang[14]等.

    1.6 蛋白免疫印跡分析

    蛋白樣品用10%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離[15],轉(zhuǎn)印至PVDF蛋白膜,用抗體孵育后在凝膠成像儀成像.

    1.7 低溫雙核實(shí)驗(yàn)及DAPI染色

    參照Tang等[16]方法.

    2 結(jié)果與分析

    2.1 SIK1基因過表達(dá)菌株的構(gòu)建

    已有研究表明,SIK1是一個必需基因,缺失可導(dǎo)致細(xì)胞死亡,因此為了檢測Sik1蛋白在有絲分裂過程中的功能,本研究構(gòu)建了過表達(dá)SIK1的菌株. 首先通過PCR從質(zhì)粒pFA6a-kanMX6-GAL1p-3HA上擴(kuò)增KanMX6-GAL1p-3HA片段(圖1(a)),片段回收后再轉(zhuǎn)化到野生型(YWL36)感受態(tài)細(xì)胞中,涂布于含G418的YPG平板上,24 h后復(fù)制一次至相同的培養(yǎng)基上. 當(dāng)復(fù)制平板上長出單克隆時挑取5個在新YPG平板上劃線2次得到純化的單菌落,在液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)并提取總蛋白進(jìn)行Western分析(圖1(b)). 結(jié)果顯示第1、2、3、5號克隆表達(dá)與預(yù)測尺寸相符的GAL1p-3HA-Sik1蛋白. 選取其中兩個克隆提取基因組DNA, 通過PCR擴(kuò)增標(biāo)記位點(diǎn)片段送去測序(圖1(c)). 測序結(jié)果標(biāo)明這兩個克隆均成功發(fā)生基因重組,即GAL1啟動子已替換SIK1的內(nèi)源啟動子,SIK1過表達(dá)菌株KanMX6-GAL1p-3HA-SIK1構(gòu)建成功,命名為YT125.

    圖1 KanMX6-GAL1p-3HA-SIK1菌株的構(gòu)建Fig.1 The construction of KanMX6-GAL1p-3HA-SIK1 strain(a)PCR擴(kuò)增片段 KanMX6-GAL1p-3HA,1~4為同一片段,M為Marker;(b) Western blot分析檢測GAL1p-3HA-Sik1蛋白的表達(dá),1~5為不同的克隆,6為未標(biāo)記的陰性對照;(c) PCR擴(kuò)增KanMX6-GAL1p-3HA標(biāo)記位點(diǎn)片段用于測序,1~2為不同的克隆

    為觀察紡錘體,將質(zhì)粒pRS305:GFP-TUB1轉(zhuǎn)化到Y(jié)T125細(xì)胞中,獲得GAL1p-3HA-SIK1GFP-TUB1菌株,命名為YT139.

    2.2 SIK1基因過表達(dá)菌株的雙核比率及紡錘體定位分析

    為了比較過表達(dá)SIK1的菌株YT139 (GAL1p-3HA-SIK1GFP-TUB1 ),缺失NUM1的菌株YT151 (num1ΔGFP-TUB1),以及野生型菌株YWL1993 (GFP-TUB1 )中的紡錘體定位及核分裂,細(xì)胞于12 ℃培養(yǎng)16 h以促進(jìn)雙核細(xì)胞的產(chǎn)生. 一部分細(xì)胞用于提取總蛋白進(jìn)行Western blot分析確認(rèn)蛋白的表達(dá),另一部分細(xì)胞用70%酒精固定后用于DAPI染色觀察細(xì)胞核,或者用熒光顯微鏡觀察紡錘體. 如圖2所示,Western blot分析確認(rèn)了3個菌株中GFP-Tub1以及YT139菌株中GAL1p-3HA-Sik1的表達(dá).

    1)num1Δ GFP-TUB1(YT151);2)GAL1p-3HA-SIK1 GFP-TUB1 (YT139);3)GFP-TUB1(YWL1993).圖2 Western blot分析確認(rèn)菌株的蛋白表達(dá)Fig.2 Western blot analysis to confirm protein expression in strains indicated

    在芽殖酵母的有絲分裂中,紡錘體在從母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到子細(xì)胞之前,先要與母-子細(xì)胞極軸平行排列極軸示意圖見圖3(a). 為了檢測過表達(dá)SIK1對此階段紡錘體定位的影響,在熒光顯微鏡下觀察了細(xì)胞中的GFP-TUB1信號(圖4,中間列),然后用Image J對位于母細(xì)胞中的短紡錘體偏離極軸的角度β進(jìn)行了測量(圖3(a)). 3個菌株中β角的測量結(jié)果如圖3(b)所示,其中野生型細(xì)胞中紡錘體偏離角度的平均值為32.4°[(32.4±24.5),圖3(b),n=80],num1Δ細(xì)胞為41.1°[(41.1±24.5),圖3(b),n=40],而GAL1p-3HA-SIK1細(xì)胞為48.0°[(48.0±29.7°),圖3(b),n=59]. 獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果表明,GAL1p-3HA-SIK1細(xì)胞與野生型細(xì)胞存在極顯著差異(P<0.001),而GAL1p-3HA-SIK1與num1Δ細(xì)胞間,以及num1Δ與野生型細(xì)胞間的差異不顯著(P>0.01). 此結(jié)果說明過表達(dá)SIK1干擾紡錘體在有絲分裂前期沿母-子細(xì)胞軸的排布,與相關(guān)報(bào)道一致[11].

    圖3 過表達(dá)Sik1影響紡錘體沿母-子極軸的排布Fig.3 Overexpressing Sik1 affects the spindle alignmentalong the mother-bud axis of polarization(a)紡錘體偏離極軸示意圖;(b) 不同菌株母細(xì)胞中的紡錘體偏離極軸的角度, 箱線圖中的“x”表示平均值位置

    觀察各突變體細(xì)胞中的核分裂,num1Δ菌株顯示了大量的雙核細(xì)胞,這些細(xì)胞的母細(xì)胞中含有兩個細(xì)胞核(圖4(c)),其雙核細(xì)胞的比率為16.4%(n=159). 野生型菌株中沒有觀察到雙核細(xì)胞(圖4(a),n=133). 在GAL1p-3HA-SIK1菌株中,從193個細(xì)胞中僅發(fā)現(xiàn)1個雙核細(xì)胞(未顯示),雙核細(xì)胞比率為0.5%(注:圖4b所示非雙核細(xì)胞,右下角白色箭頭所指細(xì)胞核為鄰近細(xì)胞的細(xì)胞核). 此外,觀察到num1Δ的雙核細(xì)胞中母細(xì)胞體積變大,呈延長的橢圓形,且紡錘體在母細(xì)胞內(nèi)部延長(圖4(c)),而GAL1p-3HA-SIK1和野生型菌株中鮮有此形態(tài)的細(xì)胞,進(jìn)一步證實(shí)這兩個菌株沒有或極少產(chǎn)生雙核細(xì)胞. 上述結(jié)果表明,過表達(dá)SIK1導(dǎo)致紡錘體定位出現(xiàn)一定程度的缺陷,但不足以導(dǎo)致雙核細(xì)胞的形成.

    圖4 各菌株中的紡錘體定位及核分裂Fig.4 Spindle orientation and nuclear division in the indicated strains(a) GFP-TUB1 (YWL1993 );(b) GAL1p-3HA-SIK1 GFP-TUB1 (YT139 );(c) num1Δ GFP-TUB1 (YT151)

    2.3 Sik1蛋白與Kar9和Dynein通路的功能關(guān)系探索

    在芽殖酵母中,控制紡錘體定位的兩條通路(即Kar9和Dynein)如果同時缺失或異常,將導(dǎo)致細(xì)胞生長緩慢或不能生長[5,16]. 由于Sik1蛋白過表達(dá)對紡錘體定位有一定程度的干擾,為明確Sik1參與了哪一條通路,檢測了過表達(dá)SIK1對NUM1缺失突變體或KAR9缺失突變體細(xì)胞生長的影響.

    首先分別將kar9Δ或num1Δ單倍體菌株與GAL1p-3HA-SIK1單倍體菌株雜交,得到同時過表達(dá)SIK1和缺失NUM1(或KAR9)的菌株.

    接下來將野生型、GAL1p-3HA-SIK1、num1Δ、GAL1p-3HA-SIK1num1Δ、kar9Δ、GAL1p-3HA-SIK1kar9Δ菌株分別培養(yǎng)至對數(shù)期,然后按濃度梯度滴種在含有半乳糖的培養(yǎng)基上以誘導(dǎo)GAL1p-3HA-SIK1的表達(dá). 從圖5(a)可以看出,培養(yǎng)于30 ℃時,這些菌株的生長狀況相似,GAL1p-3HA-SIK1和num1Δ(或kar9Δ)的雙突變體與各自的單突變體生長狀況也相似,說明在正常生長溫度條件(30 ℃)下,SIK1的過表達(dá)不影響kar9Δ和num1Δ細(xì)胞的生長.

    最后,為了研究溫度脅迫條件下過表達(dá)SIK1對kar9Δ和num1Δ細(xì)胞生長的影響,分別比較了各菌株在16 ℃和37 ℃的生長. 如圖5(c) 所示,各菌株在37 ℃時的生長狀態(tài)無明顯差別. 但在16 ℃低溫條件下,kar9Δ細(xì)胞的生長狀況優(yōu)于野生型及其他各組細(xì)胞(圖5(b), 第5行).kar9ΔGAL1p-SIK1 雙突變體的生長不及kar9Δ菌株(圖5(b),第6和第5行),而num1ΔGAL1p-SIK1 雙突變體的生長則略好于num1Δ單突變體(圖5(b),第4和3行). 因此,在低溫脅迫下,SIK1的過表達(dá)降低了kar9Δ細(xì)胞的活力,但卻能使num1Δ細(xì)胞恢復(fù)部分活力. 這些結(jié)果表明,Sik1可能在Dynein/Num1通路中扮演角色.

    圖5 各菌株在不同溫度下的生長Fig.5 Growth of indicated strains at different temperatures(a) 梯度稀釋的細(xì)胞在30 ℃培養(yǎng);(b) 梯度稀釋的細(xì)胞在16 ℃培養(yǎng);(c) 梯度稀釋的細(xì)胞在37 ℃培養(yǎng)

    3 討論

    Sik1蛋白是本實(shí)驗(yàn)室前期通過體外蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜分析鑒定出的控制紡錘體定位的關(guān)鍵蛋白Num1的互作蛋白[12]. 已有報(bào)道和本研究均發(fā)現(xiàn),過表達(dá)Sik1干擾紡錘體定位. 但本研究未能在過表達(dá)Sik1的菌株中檢測到大量雙核細(xì)胞. 可能有如下兩個可能性:(1)過表達(dá)Sik1雖然導(dǎo)致紡錘體異常,但細(xì)胞由于某種原因(例如存在其他功能重疊的因子)得以在后期修復(fù)該異常,因而避免了雙核細(xì)胞的產(chǎn)生;(2)Sik1蛋白過表達(dá)的水平不夠高,不足以導(dǎo)致雙核細(xì)胞的產(chǎn)生,本實(shí)驗(yàn)Western分析的結(jié)果支持這一可能性(圖2). 后續(xù)研究中可能考慮相反的策略,即條件性限期滅活或降解Sik1蛋白檢測其對核遷移的影響,以評價Sik1在核遷移中的作用.

    過表達(dá)Sik1一定程度拯救了num1Δ細(xì)胞在16 ℃的生長,但卻使kar9Δ細(xì)胞的生長變差. 這個結(jié)果進(jìn)一步證明Sik1在紡錘體定位中扮演了一定角色,且有可能與Num1具有協(xié)作功能,更詳細(xì)的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究.

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