鹽度和營(yíng)養(yǎng)鹽脅迫對(duì)線(xiàn)形硬毛藻生長(zhǎng)的影響

孫遠(yuǎn)遠(yuǎn) 史德杰 王磊 豐愛(ài)秀 馬克波

摘 要：測(cè)定了在水溫20和25 ℃條件下不同鹽度（41.9‰、31.8‰、24.8‰、15.9‰、11.5‰和9.7‰）和極端營(yíng)養(yǎng)鹽（富含氮、磷和去除氮、磷）分別脅迫12 d后線(xiàn)形硬毛藻（Chaetomorpha linum）的生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明，在水溫20和25 ℃時(shí)，鹽度對(duì)線(xiàn)形硬毛藻特定生長(zhǎng)率（SGR）均有顯著影響，且該影響在兩個(gè)溫度組間沒(méi)有顯著差異（P<0.05）。在鹽度為31.8‰時(shí)，SGR達(dá)到最大值24.93%/d～25.14%/d。當(dāng)鹽度升高至41.9‰，SGR下降不顯著。隨著鹽度降低，SGR下降。當(dāng)鹽度降至11.5‰時(shí)，SGR下降顯著。當(dāng)鹽度≤15.9‰時(shí)，藻體在培養(yǎng)至第9天發(fā)生質(zhì)壁分離。在水溫20 ℃時(shí)極端營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)SGR具有顯著影響，而在水溫25 ℃時(shí)影響不顯著。相對(duì)于氮、磷濃度，鹽度可能是線(xiàn)形硬毛藻生長(zhǎng)的限制因子。

關(guān)鍵詞：鹽度;營(yíng)養(yǎng)鹽;線(xiàn)形硬毛藻（Chaetomorpha linum）;生長(zhǎng)

硬毛藻屬（Chaetomorpha）綠藻是我國(guó)南北方海域常見(jiàn)的種類(lèi)。近幾十年來(lái)，隨著海水水域富營(yíng)養(yǎng)化的加劇，硬毛藻、剛毛藻出現(xiàn)大量繁殖，引發(fā)“綠潮”，其對(duì)海水養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重危害[1]。山東半島沿岸海珍品的養(yǎng)殖過(guò)程中，都存在養(yǎng)殖池底生長(zhǎng)硬毛藻或剛毛藻的現(xiàn)象。這些藻類(lèi)對(duì)于養(yǎng)殖動(dòng)物來(lái)講，適口性較差，餌料價(jià)值低，而且其大量繁殖會(huì)導(dǎo)致水產(chǎn)苗種死亡;而其大量繁殖和生長(zhǎng)會(huì)吸收海水中的氮、磷等營(yíng)養(yǎng)鹽，抑制單細(xì)胞藻的生長(zhǎng)，造成水質(zhì)惡化等現(xiàn)象[2]。目前，采用人工方法減少其生物量，耗時(shí)費(fèi)工，且不能徹底清除。另外，硬毛藻因具有生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)鹽吸收高效，及其對(duì)水體中低溶氧、低pH值和高濃度營(yíng)養(yǎng)鹽的耐受性強(qiáng)等特點(diǎn)，也是潛在的修復(fù)富營(yíng)養(yǎng)化水體的對(duì)象，可加以利用[3-5]。

線(xiàn)形硬毛藻（Chaetomorpha linum）是硬毛藻屬的一種，通常其藻體呈淺黃褐色至暗綠色，多糾纏呈團(tuán)狀，漂浮或纏繞在其他基質(zhì)上，也是常見(jiàn)爆發(fā)的一種綠藻。由于該藻常見(jiàn)于海、淡水交匯處，鹽度對(duì)其生長(zhǎng)的影響則較突出[6]，該藻的絲狀藻體生長(zhǎng)與環(huán)境條件密切相關(guān)[7]。Xu等[8]曾研究了鹽度對(duì)線(xiàn)形硬毛藻生長(zhǎng)的影響，得出適宜鹽度在30‰～35‰，其最大生長(zhǎng)率均低于6%/d。

據(jù)此，我們認(rèn)為短時(shí)間（8 d）培養(yǎng)和未換水造成營(yíng)養(yǎng)鹽供給不足，可以限制其生長(zhǎng)。本研究通過(guò)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，采用室內(nèi)培養(yǎng)方法，通過(guò)對(duì)6個(gè)鹽度（41.9‰、31.8‰、24.8‰、15.9‰、11.5‰和9.7‰）和2個(gè)營(yíng)養(yǎng)鹽濃度（富含氮磷和去除氮磷）下培養(yǎng)結(jié)果的分析，探討其對(duì)線(xiàn)形硬毛藻特定生長(zhǎng)速率的變化，分析其對(duì)鹽度的耐受性和對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽的需求，為探討線(xiàn)形硬毛藻的營(yíng)養(yǎng)需求和爆發(fā)機(jī)制提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

線(xiàn)形硬毛藻于2018年3月采自山東省榮成市天鵝湖（37°21′N(xiāo)，122°34′E），采集地水溫為7.3 ℃，鹽度為30.8‰。采集后帶回實(shí)驗(yàn)室，除去表面的附著物，置于室內(nèi)流水系統(tǒng)中進(jìn)行保種培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為青島市太平角沿岸當(dāng)月的海水溫度，光照強(qiáng)度為5.0×103 lx，光照周期為12 L/12 D。保種培養(yǎng)用海水采自青島市太平角沿岸，采集后進(jìn)行過(guò)濾并消毒處理，每2周更換一次。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)液的配置

1.2.1.1 不同鹽度培養(yǎng)液的配制 用移液槍取6.25 mL PESI原液[9]注入裝有一定比例的滅菌過(guò)濾海水和蒸餾水的錐形瓶中，搖勻，配制成N、P含量相同（NH+4-N 723 μg/L±29 μg/L、NO-3-N 69 μg/L±16 μg/L、PO3-4-P 16 μg/L±3 μg/L）而鹽度不同（41.9‰、31.8‰、24.8‰、15.9‰、11.5‰和9.7‰）的5種培養(yǎng)液，用于鹽度對(duì)線(xiàn)形硬毛藻生長(zhǎng)影響的研究。具體配制方法見(jiàn)表1。培養(yǎng)液配制后用鹽度計(jì)（HWYDA-1，天津海為科技發(fā)展有限公司）測(cè)量實(shí)際鹽度，并置于黑暗處密封保存。

1.2.1.2 去除氮磷培養(yǎng)液的配置 采用ASS2人工海水培養(yǎng)液的配方[10]，配制過(guò)程中將其中含N、P的試劑去除，得到去除N、P的ASS2人工海水培養(yǎng)液（鹽度41.9‰），與鹽度脅迫試驗(yàn)中鹽度41.9‰培養(yǎng)液（NH+4-N 723 μg/L±29 μg/L、NO-3N 69 μg/L±16 μg/L、PO3-4-P 16 μg/L±3 μg/L）形成營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)照，開(kāi)展極端營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)線(xiàn)形硬毛藻的生長(zhǎng)脅迫實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 藻體培養(yǎng) 稱(chēng)?。?.200 0±0.000 8）g鮮重的線(xiàn)形硬毛藻藻體，放入裝有500 mL培養(yǎng)液的通氣培養(yǎng)瓶中。將培養(yǎng)瓶放置在光照培養(yǎng)箱（CXZ型，寧波江南儀器廠(chǎng)）中進(jìn)行12 d的充氣培養(yǎng)。光照強(qiáng)度為1.0×104 lx，光周期為12 L∶12 D。用氣泵向培養(yǎng)瓶充氣，讓藻體在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)緩慢移動(dòng)。每3天更換一次培養(yǎng)液。培養(yǎng)期間每天早晚觀察兩次，保證各充氣瓶氣流通暢，及時(shí)將浮出水面的藻體搖入培養(yǎng)液，以免藻體因長(zhǎng)時(shí)間離水而死，同時(shí)觀察藻體損傷狀況。鹽度脅迫試驗(yàn)和營(yíng)養(yǎng)鹽脅迫試驗(yàn)在培養(yǎng)溫度為20 ℃和25 ℃下各開(kāi)展一組，每組設(shè)3個(gè)平行。試驗(yàn)結(jié)束后，稱(chēng)取各培養(yǎng)瓶中試驗(yàn)海藻的鮮重，根據(jù)以下公式求出特定生長(zhǎng)速率（SGR，%/d）[11]：

特定生長(zhǎng)速率SGR=（lnWt-lnW0）/t×100%

式中：W0為初始重量，g;Wt為t時(shí)的重量，g;t為培養(yǎng)時(shí)間，d。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS13.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)于鹽度脅迫試驗(yàn)，由于部分?jǐn)?shù)據(jù)不具有正態(tài)分布或者方差齊性，所以同一溫度下不同鹽度間的藻體特定生長(zhǎng)速率的顯著差異用非參數(shù)檢驗(yàn)法Kruskal-Wallis test進(jìn)行檢驗(yàn)。確認(rèn)具有顯著差異后，再用Schffés multiple comparison test進(jìn)行多重比較。而同一鹽度下兩個(gè)溫度間的藻體特定生長(zhǎng)速率的顯著差異用非參數(shù)檢驗(yàn)法Mann-Whitney U test進(jìn)行檢驗(yàn)。對(duì)于營(yíng)養(yǎng)鹽脅迫試驗(yàn)，由于所有數(shù)據(jù)具有正態(tài)分布和方差齊性，所以同一溫度下不同營(yíng)養(yǎng)鹽濃度間的藻體特定生長(zhǎng)速率的顯著差異用t-test進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 鹽度對(duì)線(xiàn)形硬毛藻生長(zhǎng)的影響

不同鹽度處理組的藻體在培養(yǎng)前后的生長(zhǎng)和外觀狀態(tài)存在很大差別。線(xiàn)形硬毛藻在不同鹽度條件下的特定生長(zhǎng)速率如圖1所示。不同鹽度間藻體的特定生長(zhǎng)速率存在顯著差異。在20 ℃下，鹽度為31.8‰時(shí)，線(xiàn)形硬毛藻顯示出最大特定生長(zhǎng)率24.93%/d。當(dāng)鹽度升高至41.9‰時(shí)，其特定生長(zhǎng)速率為23.71%/d，與最大生長(zhǎng)率沒(méi)有顯著差異。隨著鹽度的降低，特定生長(zhǎng)速率下降。當(dāng)鹽度為15.9‰和9.7‰時(shí)，特定生長(zhǎng)速率降至11.26%/d和5.19%/d，顯著低于最大生長(zhǎng)率（P<0.05）。在25 ℃下，線(xiàn)形硬毛藻在不同鹽度條件下的特定生長(zhǎng)速率與20 ℃下的特定生長(zhǎng)速率之間無(wú)顯著差異。鹽度≥24.8‰處理組的線(xiàn)形硬毛藻在12 d的培養(yǎng)中細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，藻體健全，未發(fā)生質(zhì)壁分離和藻體腐爛現(xiàn)象，而鹽度≤15.9‰處理組的線(xiàn)形硬毛藻在培養(yǎng)至第9 d后均觀察到部分藻體變白，出現(xiàn)質(zhì)壁分離現(xiàn)象，鹽度越低發(fā)生質(zhì)壁分離的藻段越多，長(zhǎng)度越長(zhǎng)，腐爛越嚴(yán)重（圖2）。

2.2 營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)線(xiàn)形硬毛藻生長(zhǎng)的影響

線(xiàn)形硬毛藻在富含氮磷的培養(yǎng)液和去除氮磷的ASS2人工海水培養(yǎng)液培養(yǎng)下的特定生長(zhǎng)速率如圖3所示。與富含氮磷的處理組相比，用去除氮磷的培養(yǎng)液培養(yǎng)的藻體其特定生長(zhǎng)速率在20 ℃時(shí)顯著降低（P<0.05），而在25 ℃時(shí)下降不顯著。在20 ℃時(shí)，去除氮磷培養(yǎng)下的藻體特定生長(zhǎng)速率為19.05%/d，顯著低于富含氮磷培養(yǎng)下的藻體特定生長(zhǎng)速率23.71%/d。在25 ℃時(shí)，去除氮磷培養(yǎng)下的藻體特定生長(zhǎng)速率為20.02%/d，與富含氮磷培養(yǎng)下的特定生長(zhǎng)速率23.32%/d無(wú)顯著差異。在20 ℃和25 ℃下培養(yǎng)12 d后，兩個(gè)營(yíng)養(yǎng)鹽處理組的藻體細(xì)胞結(jié)構(gòu)均正常，沒(méi)有發(fā)生質(zhì)壁分離和腐爛現(xiàn)象（圖4）。

3 討論

3.1 鹽度脅迫對(duì)線(xiàn)形硬毛藻生長(zhǎng)的影響

線(xiàn)形硬毛藻在20 ℃和25 ℃下，生長(zhǎng)的鹽度耐受范圍為9.7‰～41.9‰，而最適生長(zhǎng)的鹽度范圍為15.9‰～41.9‰。相對(duì)于高鹽度處理組（鹽度41.9‰），低鹽度處理組（鹽度≤11.5‰）的生長(zhǎng)率下降明顯，說(shuō)明線(xiàn)形硬毛藻對(duì)低鹽度的耐受性較弱。Xu等[8]曾報(bào)道當(dāng)鹽度小于15‰時(shí)線(xiàn)形硬毛藻死亡，而在本研究中當(dāng)鹽度為9.7‰時(shí)，盡管部分藻體出現(xiàn)發(fā)白和細(xì)胞質(zhì)壁分離的現(xiàn)象，但藻體仍能保持5.38%/d的生長(zhǎng)率。另外，本研究中線(xiàn)形硬毛藻在鹽度31.8‰時(shí)獲得最大生長(zhǎng)率24.93%/d～25.14%/d，遠(yuǎn)高于Xu等報(bào)道的在鹽度30‰～35‰范圍內(nèi)的最大生長(zhǎng)率5.66%/d。本研究也未發(fā)現(xiàn)Xu等[8]報(bào)道的藻體嚴(yán)重卷曲、出現(xiàn)黑點(diǎn)等鹽度脅迫反應(yīng)。作者分析，本研究與Xu等在線(xiàn)形硬毛藻的鹽度耐受范圍、最大生長(zhǎng)率和鹽度脅迫反應(yīng)等方面的差異，可能源于培養(yǎng)方法和天數(shù)的不同。Xu等的實(shí)驗(yàn)采用1 L燒杯（裝有800 mL培養(yǎng)液）和f/2培養(yǎng)液，培養(yǎng)周期為8 d，中途不更換培養(yǎng)液，每天手動(dòng)震蕩培養(yǎng)容器4～6次。本研究采用500 mL通氣培養(yǎng)瓶（裝有500 mL培養(yǎng)液）和PESI培養(yǎng)液，培養(yǎng)周期12 d，中途每3 d更換一次培養(yǎng)液，24 h充氣培養(yǎng)。充足的營(yíng)養(yǎng)供給和充氣攪拌更有利于線(xiàn)形硬毛藻對(duì)N、P的吸收，而吸收的N、P在藻體內(nèi)的積累可能對(duì)提高藻體對(duì)抗環(huán)境脅迫的能力起到一定的作用。

在鹽度低至9.7‰時(shí)線(xiàn)形硬毛藻雖然在部分藻段發(fā)生了質(zhì)壁分離和白化現(xiàn)象，但仍保持正的生長(zhǎng)率，而Xu等[8]研究認(rèn)為鹽度低于15‰時(shí)線(xiàn)形硬毛藻不能存活，Caputo等[12]則報(bào)道了生活在淡水中的線(xiàn)形硬毛藻。由此可見(jiàn)，不同線(xiàn)形硬毛藻種群對(duì)低鹽脅迫的耐受性存在一定差異，這可能與不同種群所生活的環(huán)境以及種群對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性有關(guān)。線(xiàn)形硬毛藻對(duì)鹽度的耐受范圍較廣，使其能夠適應(yīng)從鹵水到淡水的大幅度鹽度變化。

3.2 營(yíng)養(yǎng)鹽脅迫對(duì)線(xiàn)形硬毛藻生長(zhǎng)的影響

氮磷充足時(shí)，線(xiàn)形硬毛藻可以保持23.52%/d的生長(zhǎng)率，而無(wú)氮磷時(shí)，線(xiàn)形硬毛藻的生長(zhǎng)率雖有所降低，但仍保持在20%/d的水平，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于低鹽度（9.7‰～11.5‰）處理組的生長(zhǎng)率（5.38%/d～10.55%/d），說(shuō)明營(yíng)養(yǎng)鹽脅迫的影響比鹽度脅迫的影響小得多。由此看來(lái)，線(xiàn)形硬毛藻生長(zhǎng)的限制因子是鹽度而非營(yíng)養(yǎng)鹽。Silva等[13]曾報(bào)道印度硬毛藻在鹽度15‰～45‰范圍內(nèi)，隨著總氨氮量在7～700 μmol/L范圍內(nèi)的增加，其生長(zhǎng)率在3%/d～15%/d的范圍呈上升趨勢(shì)。而在本研究中，即使完全去除N、P，藻體仍能維持20%/d的生長(zhǎng)率。這種差異可能與試驗(yàn)海藻的種類(lèi)以及試驗(yàn)方法有關(guān)。線(xiàn)形硬毛藻對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽饑餓的耐受性較強(qiáng)。在營(yíng)養(yǎng)鹽充足時(shí)保持旺盛生長(zhǎng)，在無(wú)營(yíng)養(yǎng)鹽時(shí)短期之內(nèi)仍維持較高的生長(zhǎng)率。這可能是該藻在養(yǎng)殖水域或養(yǎng)殖池塘中巧妙地利用營(yíng)養(yǎng)鹽脅迫環(huán)境戰(zhàn)勝其它藻類(lèi)，實(shí)現(xiàn)種群擴(kuò)張的一種生存戰(zhàn)略。

4 結(jié)論

鹽度對(duì)線(xiàn)形硬毛藻生長(zhǎng)的影響在水溫20 ℃和25 ℃時(shí)均顯著，且該影響在兩個(gè)溫度組間無(wú)顯著差異。鹽度為31.8‰時(shí)，線(xiàn)形硬毛藻的特定生長(zhǎng)速率達(dá)到最大值24.93%/d～25.14%/d。隨著鹽度的降低，線(xiàn)形硬毛藻特定生長(zhǎng)速率急劇下降，當(dāng)鹽度為9.7‰時(shí)，特定生長(zhǎng)速率顯著降至5.38%/d。當(dāng)鹽度降至15.9‰時(shí)，藻體在脅迫第9 d出現(xiàn)質(zhì)壁分離現(xiàn)象，鹽度越低發(fā)生質(zhì)壁分離的藻段越多，長(zhǎng)度越長(zhǎng)，腐爛越嚴(yán)重。營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)線(xiàn)形硬毛藻的影響在20 ℃時(shí)顯著而在25 ℃時(shí)不顯著。在20 ℃下，用去除氮磷ASS2培養(yǎng)液培養(yǎng)的線(xiàn)形硬毛藻特定生長(zhǎng)速率為19.05%/d，高于低鹽處理下的特定生長(zhǎng)速率5.38%/d～10.55%/d。相比營(yíng)養(yǎng)鹽，鹽度對(duì)線(xiàn)形硬毛藻生長(zhǎng)的影響更顯著，鹽度可能是線(xiàn)形硬毛藻生長(zhǎng)的關(guān)鍵限制因子。

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Abstract：The Growth of Chaetomorpha linum exposed to different salinity levels（41.9‰，31.8‰，24.8‰，15.9‰，11.5‰ and 9.7‰） and extreme nutrient concentration （N，P-enriched and N，P-removed） for 12 d at 20 ℃ and 25 ℃ respectively were examined.Results showed that significant effects of salinity on the specific growth rate（SGR）of C.linum were found both at 20 ℃ and 25 ℃，and no obvious difference among these two temperature treatments.The maximum SGR 24.93%/d～25.14%/d was reached at salinity 31.8‰.When salinity ascended to 41.9‰，SGR decreased indistinctively.With the reduction of the salinity，the SGR decreased.When salinity reduced to 11.5‰，SGR decreased obviously.When salinity reduced to less than 15.9‰，plasmolysis phenomenon occurred in parts of alga at the 9th day.Significant effects of nutrient on the growth of C.linum were found at 20 ℃ but not at 25 ℃.Salinity，not nutrient，may be the limiting factor for the growth of C.linum.

Key words：salinity; nutrient; Chaetomorpha linum; growth

（收稿日期：2021-08-05）