急進(jìn)高原胃動力紊亂大鼠胃電起搏區(qū)Cajal間質(zhì)細(xì)胞及P物質(zhì)表達(dá)的變化

朱　琳， 賀　巍， 范興愛， 楊生岳， 劉睿年， 魏廷青

(解放軍第四醫(yī)院消化內(nèi)科，西寧　810007； *通迅作者，E-mail：hewei.1971@163.com)

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急進(jìn)高原胃動力紊亂大鼠胃電起搏區(qū)Cajal間質(zhì)細(xì)胞及P物質(zhì)表達(dá)的變化

朱琳， 賀巍*， 范興愛， 楊生岳， 劉睿年， 魏廷青

(解放軍第四醫(yī)院消化內(nèi)科，西寧810007；*通迅作者，E-mail：hewei.1971@163.com)

目的探討急進(jìn)高原胃動力紊亂大鼠Cajal間質(zhì)細(xì)胞及P物質(zhì)(substance P, SP)的表達(dá)及其機(jī)制。 方法50只SD大鼠以低海拔地區(qū)(海拔400 m)為對照組，并以進(jìn)入高原地區(qū)(海拔4 300 m)后的時間節(jié)點依次分為1 d,3 d,7 d和14 d組，每組10只。測定各組大鼠胃電活動數(shù)據(jù)，應(yīng)用電子顯微鏡觀察胃電起搏區(qū)ICC的微觀結(jié)構(gòu)變化，應(yīng)用雙重免疫熒光組織化學(xué)染色法觀察同區(qū)域ICC的功能與P物質(zhì)表達(dá)變化。 結(jié)果大鼠胃電波幅及波頻在進(jìn)入高原地區(qū)后快速下降，于1 d組即可觀察到明顯變化(P<0.05)，并于3 d下行到最低點(P<0.05)，波頻于7 d時恢復(fù)正常。電鏡下可觀察到其胃電起搏區(qū)ICC的縫隙連接減少、細(xì)胞器減少并出現(xiàn)凋亡小體等，并以高海拔地區(qū)3 d組最顯著。使用雙重免疫熒光組織化學(xué)染色法同步標(biāo)記胃電起搏區(qū)ICC細(xì)胞和P物質(zhì)，所得免疫熒光強(qiáng)度同樣在高原區(qū)3 d組表達(dá)下降到最低點(P<0.05)。 結(jié)論ICC細(xì)胞在急進(jìn)高原胃腸動力紊亂發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，而SP則可能通過調(diào)節(jié)ICC細(xì)胞功能的方式，在此過程中扮演重要角色。

高原??；高海拔；胃動力；Cajal間質(zhì)細(xì)胞；P物質(zhì)；大鼠

急進(jìn)高原胃腸動力紊亂是高原胃腸應(yīng)激反應(yīng)的主要表現(xiàn)之一，其多以惡心、腹脹、食欲減退等消化道癥狀最為突出，通常經(jīng)7-10 d的高原適應(yīng)后可逐漸緩解或消失[1]，但目前有關(guān)急進(jìn)高原胃腸動力紊亂的發(fā)生機(jī)制尚不完全清楚。ICC不但是胃腸基本電節(jié)律(basic electric rhythm)的起始點[2,3]，同時又發(fā)揮傳導(dǎo)者的作用[4]，是胃腸道壁內(nèi)神經(jīng)與平滑肌間的信息傳導(dǎo)中介，對P物質(zhì)、內(nèi)源性NO、血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)等多種胃腸道活性物質(zhì)有反應(yīng)[5]，在胃腸動力調(diào)控中發(fā)揮重要作用。P物質(zhì)則在胃腸運動調(diào)節(jié)中起重要的興奮性作用，在胃腸道內(nèi)廣泛分布。本實驗將使用雙重免疫熒光組織化學(xué)標(biāo)記的方法觀察大鼠胃電起搏區(qū)ICC和P物質(zhì)的表達(dá)變化，以探討急進(jìn)高原胃動力紊亂過程中ICC的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1主要儀器及試劑

RM6280B生物信號采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)，超低溫冰箱(-80 ℃)及超低溫切片機(jī)(美國NUAIR公司)，F(xiàn)V1000激光共聚焦顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，Tecnai G2分析透射電鏡(美國FEI公司)，兔抗大鼠多克隆c-kit抗體(美國LifeSpan BioSciences公司)，小鼠抗大鼠單克隆SP抗體(美國Santa Cruz Biotechnology公司)，驢抗兔FITC標(biāo)記單克隆抗體(英國Abcom公司)，驢抗小鼠alexa fluor單克隆抗體(英國Abcom公司)。

1.2實驗動物與分組

雄性SD大鼠50只，6周齡，SPF級，許可證號：SCXK(陜)2012-003，體重(200±20)g，全部購自西安交通大學(xué)實驗動物中心。以低海拔地區(qū)(西安，海拔400 m)為對照組，另以大鼠起運后3 d內(nèi)進(jìn)駐實驗現(xiàn)場模擬急進(jìn)高原狀態(tài)，并以進(jìn)入高海拔地區(qū)(瑪多，海拔4 300 m)后的時間節(jié)為依據(jù)，根據(jù)達(dá)到實驗地區(qū)后的時間順序依次分為1 d,3 d,7 d和14 d組，每組10只大鼠。

1.3胃電生理活動檢測

SD大鼠術(shù)前12 h禁食，術(shù)前6 h禁水，戊巴比妥鈉腹腔注射(40 mg/kg)麻醉，在大鼠腹部正中切開，選擇胃電起搏區(qū)的胃體中部上1/3處漿膜層埋置引導(dǎo)電極[6]，測量胃電活動變化，參數(shù)設(shè)定為：生物電，500 mV，直流，30 Hz，記錄波形并分析。

1.4實驗標(biāo)本的采集與固定

電生理測定完成后，剪開胸腔，經(jīng)升主動脈插管，快速灌入生理鹽水沖洗血液，并沿胃大彎側(cè)剪開，于胃體中部上1/3處取0.2 cm×0.1 cm大小組織，3%戊二醛固定，用于電鏡染色，后繼續(xù)經(jīng)升主動脈先快后慢灌注冷的(4 ℃)4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸緩沖液(PB，pH7.4)500 ml，注畢立即取全胃置于20%的蔗糖溶液中過夜沉底。

1.5電鏡觀察胃電起搏區(qū)ICC細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)變化

取3 %戊二醛固定組織用0.2 mol/L蔗糖磷酸緩沖液漂洗，再用2 %的四氧化鋨后固定1 h，丙酮中梯度脫水，在1 %醋酸雙氧鈾中停滯染色1 h，再通過環(huán)氧丙烷與環(huán)氧樹脂。1 mm切片用亞甲藍(lán)染色，在光鏡下觀察，確定黏膜層、環(huán)形肌層、縱行肌層，再次經(jīng)70 nm超薄切片后用酒精醋酸雙氧鈾、再用檸檬酸鹽后染色，保留縱行肌層、環(huán)形肌層、黏膜下層、部分黏膜層，用透射電鏡觀察。

1.6雙重免疫熒光化學(xué)法標(biāo)記ICC和P物質(zhì)及圖像分析

取固定后胃體中部上1/3處0.4 cm×0.2 cm組織用超低溫切片機(jī)切片10 μm，使用0.01 mol/L PBS漂洗3次，置入含0.3% Triton X-100的0.01 mol/L PBS中浸泡30 min(室溫)，經(jīng)0.01 mol/L PBS液漂洗，進(jìn)行免疫組織化學(xué)熒光染色(以c-kit抗體標(biāo)記ICC細(xì)胞)：分別加入兔抗大鼠多克隆c-kit抗體(1 ∶150)及小鼠抗大鼠單克隆SP抗體(1 ∶200)，室溫孵育24 h，經(jīng)0.01 mol/L PBS液漂洗3次后，分別加入熒光二抗，驢抗兔FITC標(biāo)記單克隆抗體(1 ∶400)及驢抗小鼠alexa fluor 594單克隆抗體(1 ∶400)，避光室溫孵育2 h。經(jīng)0.01 mol/L PBS洗3次，80%甘油封片，以上過程均需避光操作。各組切片各取10張，在FV1000激光共聚焦顯微鏡下采用20倍及40倍視野觀察，觀察每一張切片取6-8個視野，并將數(shù)字化圖像儲存。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1急進(jìn)高海拔地區(qū)后大鼠胃電生理變化

急進(jìn)高海拔地區(qū)后，大鼠胃電的波頻及波幅均受損明顯，1 d組即可觀察到明顯變化(P<0.05)，至3 d組下降到最低點(P<0.05)，此后緩慢恢復(fù)，其中波頻恢復(fù)相對較快，7 d組即基本恢復(fù)正常，與低海拔組對比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，而波幅恢復(fù)相對較慢，14 d組胃電波幅仍明顯低于低海拔對照組(P<0.05，見表1，圖1)。

組別 波幅(mV)波頻(Hz)低海拔對照組1829.51±627.2349.67±0.62高海拔1d組254.38±40.07*48.27±1.63*高海拔3d組169.21±29.36#44.55±0.93#高海拔7d組271.55±151.24*49.71±1.28高海拔14d組520.63±109.34*49.87±0.77

與低海拔組比較，*P<0.05；與1 d組及7 d組比較，#P<0.05

2.2急進(jìn)高原后大鼠胃電起搏區(qū)的ICC的微觀結(jié)構(gòu)變化

低海拔地區(qū)對照組ICC在電鏡下觀察可見：細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，縫隙連接緊密，核周細(xì)胞質(zhì)充盈，細(xì)胞器數(shù)量較多，細(xì)胞內(nèi)部罕見空泡樣改變，無凋亡小體。急進(jìn)高原地區(qū)后，1 d組即可明顯觀察到ICC細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)受外界環(huán)境影響、受損，細(xì)胞縫隙連接變得明顯松散；細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器數(shù)量明顯減少，線粒體可見空泡樣腫脹、變性，部分可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張等。而在高海拔地區(qū)3 d組中這種受損表現(xiàn)最為明顯，除上述改變外，還可見ICC核周細(xì)胞質(zhì)空泡樣改變加重，甚至部分ICC基膜不完整形成空洞；可見核固縮形成，核內(nèi)可見異染色質(zhì)，凋亡小體顯著增多(見圖2)。

A.低海拔對照組；B.高海拔1 d組；C.高海拔3 d組；D.高海拔7 d組；E.高海拔14 d組圖1　大鼠快速進(jìn)入高海拔地區(qū)后胃電活動時程變化Figure 1　Effects of ascending to high altitude on gastric electrical activity in the rats

2.3急進(jìn)高原后大鼠胃電起搏區(qū)的c-kit及P物質(zhì)表達(dá)的變化

實驗結(jié)果表明，進(jìn)入高海拔地區(qū)后，大鼠胃電起搏區(qū)c-kit表達(dá)明顯下降，1 d組即出現(xiàn)明顯變化(P<0.05)，并于于3 d組下行到最低點(P<0.05)，而后緩慢恢復(fù)。本試驗中免疫熒光染色可見其表達(dá)和ICC細(xì)胞呈網(wǎng)絡(luò)樣分布，彼此緊密相鄰，表達(dá)變化與ICC表達(dá)改變同步，均于1 d組即出現(xiàn)改變(P<0.05)，于3 d組表達(dá)減少到最低(P<0.05)，而后緩慢恢復(fù)(見表2，圖3)。

A.低海拔對照組;B.高海拔1 d組;C1，C2.高海拔3 d組;D.高海拔7 d組;E.高海拔14 d組(A，B，E×6 000;C，D×20 500)圖2　大鼠快速進(jìn)入高海拔地區(qū)后對胃電起搏區(qū)ICC細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的影響Figure 2　Effects of ascending to high altitude on ultrastructure of ICC in the rats’ gastric pacing location

組別 c-kitP物質(zhì)c-kit/P物質(zhì)低海拔對照組45.30±4.2545.30±4.25 52.24±6.80高海拔1d組33.32±4.13*33.27±4.05* 46.70±4.67*高海拔3d組30.95±3.74*#31.00±3.62*# 36.10±4.13*#高海拔7d組33.14±2.95*32.94±2.84*39.09±4.13*高海拔14d組35.09±3.90*35.09±3.90*42.57±5.23*

與低海拔對照組比較，*P<0.05；與1 d組及7 d組比較，#P<0.05

3　討論

急進(jìn)高原的人會因外界氣壓快速減低引起全身低張性缺氧，引發(fā)高原胃腸應(yīng)激反應(yīng)。本研究前期實驗結(jié)果已表明急進(jìn)高原狀態(tài)下，進(jìn)入地區(qū)的海拔高度越高，大鼠胃動力下行速度越快，恢復(fù)越慢，在海拔4 300 m狀態(tài)下，于3 d組下行到最低點，且ICC在其中廣泛參與，并發(fā)揮重要作用[7]。而作為胃腸動力基本功能單位(basical functional unit GI motility, BFUGM)重要組成部分的ICC[8]，在胃內(nèi)依據(jù)功能和部位的不同可劃分為肌間ICC(ICC-MY)、肌內(nèi)ICC(ICC-IM)及黏膜下ICC(ICC-SM)三種[9]。前兩種在胃腸運動調(diào)控中發(fā)揮重要作用，ICC-MY是導(dǎo)致起搏的主要細(xì)胞，能自動產(chǎn)生節(jié)律性的去極化產(chǎn)生慢波[10,11], 而ICC-IM則能夠?qū)CC-MY產(chǎn)生的起搏信號向下傳遞給與其形成緊密連接平滑肌，并對神經(jīng)信號的傳遞過程進(jìn)行調(diào)節(jié)[12,13]。已知的研究表明，腸神經(jīng)系統(tǒng)(enteric nervous system，ENS)的調(diào)控，除了直接作用于平滑肌系統(tǒng)外，主要通過ICC發(fā)揮作用，其對乙酰膽堿、SP、NO、VIP等多種神經(jīng)遞質(zhì)均有反應(yīng)[5]。P物質(zhì)在胃部主要可見于肌間神經(jīng)叢、肌內(nèi)神經(jīng)叢及黏膜下神經(jīng)叢[9]，其作為一種重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)廣泛存在于整個胃腸道及ENS[14]，并對胃腸運動調(diào)控廣泛發(fā)揮作用，是研究胃腸動力學(xué)領(lǐng)域重要的一種神經(jīng)遞質(zhì)[15]。

A-E.c-kit表達(dá)；A1-E1.SP表達(dá)；A2-E2. c-kit/SP;A.低海拔對照組；B.高海拔1 d組；C.高海拔3 d組；D.高海拔7 d組；E.高海拔14 d組圖3　大鼠快速進(jìn)入高海拔地區(qū)后對胃電起搏區(qū)c-kit及P物質(zhì)表達(dá)的影響Figure 3　Expression of c-kit and substance P(SP) in ICC of gastric pacing region after ascending to high altitude

通過本實驗結(jié)果可知，急進(jìn)高原后，伴隨著海拔高度的提升，大鼠胃電活動明顯受損，在進(jìn)入實驗地域的第1天即發(fā)生明顯變化，不論是波幅還是波頻均明顯下行，尤其是波幅更加顯著，并于第3天下行到最低點，此后緩慢恢復(fù)，波頻恢復(fù)較快，波幅相對恢復(fù)緩慢，與本研究前期試驗結(jié)果相一致[8]。使用電子顯微鏡觀察各組大鼠胃電起搏區(qū)ICC細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的變化，也發(fā)現(xiàn)類似的損傷變化規(guī)律，進(jìn)入高原后第1天即可發(fā)現(xiàn)ICC細(xì)胞縫隙連接變得明顯松散、細(xì)胞器數(shù)量減少等現(xiàn)象，至第3天達(dá)到頂峰，凋亡小體顯著曾多，甚至可見核固縮。而雙重免疫熒光組織化學(xué)染色結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，SP的表達(dá)變化與ICC的表達(dá)改變同步，均于第1天即出現(xiàn)改變(P<0.05)，于第3天表達(dá)減少到最低(P<0.05)，而后緩慢恢復(fù)。其表達(dá)陽性的神經(jīng)叢與ICC細(xì)胞呈網(wǎng)絡(luò)樣分布，彼此緊密相鄰并與平滑肌毗鄰，提示大鼠胃電起搏區(qū)P物質(zhì)的表達(dá)量減低，與胃壁內(nèi)神經(jīng)元的興奮性、胃電基礎(chǔ)及平滑肌活動下降存在明顯關(guān)聯(lián)性。可見ICC在急進(jìn)高原胃動力紊亂發(fā)生過程中廣泛參與，并可能發(fā)揮重要作用。而P物質(zhì)作為一種重要的興奮性胃腸神經(jīng)遞質(zhì)，在此過程中可能是通過調(diào)節(jié)ICC細(xì)胞功能的方式發(fā)揮作用，并扮演重要角色的。

綜上所述，急進(jìn)高原所致胃動力紊亂的產(chǎn)生，可能與大鼠胃電起搏區(qū)ICC細(xì)胞功能，及其與P物質(zhì)的表達(dá)變化有關(guān)。

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Effects of expression of interstitial cell of Cajal and substance P in gastric electrical pacing region of rats after ascending to high altitude

ZHU Lin, HE Wei*, FAN Xing’ai, YANG Shengyue, LIU Ruinian, WEI Tingqing

(DepartmentofGastroenterology,FourthHospitalofPLA,Xining810007,China;*Correspondingauthor,E-mail:hewei.1971@163.com)

ObjectiveTo explore the substance P expression and the function of interstitial cell of Cajal(ICC) in gastric motility disorders in rats after ascending to high altitude.MethodsFifty SD male rats were divided into five groups(n=10 in each group): low altitude group(Xi’an, 400 m), high altitude(4 300 m) 1 d group, high altitude 3 d group, high altitude 7 d group, high altitude 14 d group. The gastric electrical activity was measured in different groups. Electron microscope was applied to observe the physiological ultrastructure of ICC cells, and the immunofluorescence staining was applied to observe the expression of ICC cells and substance P in gastric electrical pacing region.ResultsThe amplitude and frequency of gastric electrical activity were significantly decreased in high altitude 1 d group(P<0.05), decreased to the lowest in high altitude 3 d group(P<0.05), and the frequency increased to the normal in high altitude 7 d group. The gap junctions and organelles of ICC cells were reduced, and apoptotic bodies were observed in 3 d group under electron microscope. The expression of ICC cells and substance P were also the lowest in high altitude 3 d group(P<0.05).ConclusionThe results indicate that the ICC cells may play an important role in gastric motility disorders in high altitude exposed rats, and substance P may also play an important role to regulate the function of ICC cells in this process.Key words:mountain sickness；high altitude；gastric motility；interstitial cell of Cajal;substance P；rats

青海省(應(yīng)用)基礎(chǔ)研究基金資助項目(2013-Z-760)

朱琳，男，1979-11生，碩士，主治醫(yī)師，E-mail:298567115@qq.com

2016-08-08

R573

A

1007-6611(2016)10-0890-05DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.10.003