磁共振組織追蹤成像對(duì)早期左心室心肌肥厚大鼠模型的評(píng)估

鄭嬌鳳，王磊，胡英，郜發(fā)寶

四川大學(xué)華西醫(yī)院放射科，四川 成都 610041；*通信作者 郜發(fā)寶 gaofabao@wchscu.cn

心肌肥厚分為生理性肥厚和病理性肥厚，生理性心肌肥厚是無(wú)害的，甚至是有益的；病理性心肌肥厚可以由多種因素引起，如肥厚性心肌病[1]、高血壓[2]、心肌淀粉樣變[3]等。病理性心肌肥厚在心臟重構(gòu)中具有關(guān)鍵作用，并且是心律失常、心肌纖維化、心力衰竭等不良心血管事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[4-5]，其特征是收縮和舒張功能受損，與心肌細(xì)胞凋亡和纖維化增加有關(guān)。因此，對(duì)于病理性心肌肥厚，積極診斷并采取有效的治療措施，延緩甚至終止疾病進(jìn)展惡化至心臟重構(gòu)及心力衰竭，減少并發(fā)癥、改善預(yù)后非常重要。

心臟磁共振（cardiac magnetic resonance，CMR）是一種非侵入性檢查，具有超高的時(shí)間、空間分辨力和極高的圖像對(duì)比度、清晰度，已成為評(píng)估心臟結(jié)構(gòu)及功能的影像學(xué)“金標(biāo)準(zhǔn)”[6-7]。CMR后處理技術(shù)，磁共振組織追蹤成像（magnetic resonance tissue tracking，MR-TT）能夠通過(guò)評(píng)估徑向應(yīng)變（radial strain，RS）、周向應(yīng)變（circumferential strain，CS）及縱向應(yīng)變（longitudinal strain，LS）等主要功能參數(shù)，反映心肌的收縮功能狀況[8-10]。當(dāng)發(fā)生病理性心肌肥厚時(shí)，通過(guò)心肌應(yīng)力分析可以發(fā)現(xiàn)心肌應(yīng)力減低[3,11]。

異丙腎上腺素可作用于β腎上腺素能受體，引起病理性心肌肥厚[12-13]，是誘導(dǎo)左心室心肌肥厚動(dòng)物模型的理想選擇。因此，本研究利用異丙腎上腺素構(gòu)建大鼠早期左心室心肌肥厚動(dòng)物模型，利用CMR檢查及其后處理技術(shù)MR-TT，得到心臟結(jié)構(gòu)、心功能及心肌形變參數(shù)，探討MR-TT在左心室心肌肥厚評(píng)估中的潛在價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 左心室心肌肥厚動(dòng)物模型建立 共納入30只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組10只和實(shí)驗(yàn)組20只，體質(zhì)量200～220 g，SD大鼠購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于四川大學(xué)華西科技園SPF級(jí)動(dòng)物房，按國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。本研究獲得四川大學(xué)華西科技園動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理認(rèn)證。

異丙腎上腺素干粉（大連美侖生物公司）采用現(xiàn)配現(xiàn)用的方式，配成2.5 mg/ml異丙腎上腺素溶液。自大鼠背部皮下注射給藥，劑量5 mg/kg，連續(xù)注射7 d，建立左心室心肌肥厚大鼠病理模型。

1.2 CMR檢查 采用7.0T小動(dòng)物MR掃描儀（Bruker BioSpec 70/30，Ettlingen）對(duì)大鼠進(jìn)行CMR掃描。掃描前用含有異氟烷和氧氣的混合氣體（異氟烷濃度為2.5%，氧流量為0.9 L/min）對(duì)大鼠進(jìn)行氣體麻醉。使用大鼠心臟專用體表線圈，大鼠取俯臥位放置于掃描床上，頭先進(jìn)，將大鼠心臟置于線圈的正中心處。將呼吸門控觸發(fā)墊置于大鼠腹部呼吸動(dòng)度最明顯處，將心電監(jiān)護(hù)儀的3個(gè)電極分別插入大鼠雙前肢及左后肢皮下，用膠帶固定。調(diào)整麻醉濃度，持續(xù)麻醉濃度范圍一般為2%～2.5%，掃描過(guò)程中可根據(jù)大鼠呼吸狀態(tài)進(jìn)行調(diào)節(jié)，以保證掃描期間大鼠呼吸基本穩(wěn)定，掃描期間大鼠呼吸頻率一般為35～45次/分。待大鼠心率及呼吸平穩(wěn)后開始掃描。

定位像：無(wú)門控成像，迅速獲得橫斷面、矢狀面及冠狀面定位圖像。初步確定大鼠心臟是否位于線圈中心，為后續(xù)掃描做好準(zhǔn)備。掃描參數(shù)：TE 1.7 ms，TR 15 ms，翻轉(zhuǎn)角（FA）16°，視野（FOV）50 mm×50 mm；矩陣256×256，層厚1.0 mm；激勵(lì)次數(shù)6。

FLASH-cine：定位掃描獲得標(biāo)準(zhǔn)的左心室長(zhǎng)軸二腔心圖像和長(zhǎng)軸四腔心圖像。從左心室心底二尖瓣水平至心尖方向逐層掃描獲得標(biāo)準(zhǔn)的左心室短軸二腔心圖像。掃描參數(shù)：TE 2.5 ms，TR 8 ms，F(xiàn)A 20°，F(xiàn)OV 60 mm×60 mm；矩陣192×192；層厚1.0 mm，層間距0 mm，激勵(lì)次數(shù)6。

1.3 血生化檢測(cè) 掃描結(jié)束后，采用10%水合氯醛（3 ml/kg）腹腔注射麻醉大鼠，用碘伏消毒皮膚。沿腹正中線向上剪開皮膚，提起劍突，沿肋骨下緣剪開膈肌，于腋中線處剪斷雙側(cè)肋骨，將胸骨向頭端掀起，充分暴露胸腔。采集右心房靜脈血并離心，分離血清，檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、高敏度肌鈣蛋白T（high-sensitivity cardiac troponin T，hs-cTnT）。

1.4 組織病理學(xué)檢查 自大鼠右心房注射1.5 ml飽和氯化鉀溶液，處死大鼠。迅速取出心臟于生理鹽水中沖洗，用吸水紙吸干、稱重，計(jì)算心臟體重比，離體心臟固定于4%多聚甲醛中靜止約1周。將固定好的心臟沿左心室短軸方向切成厚約1.5 mm的組織切片，石蠟包埋，脫水，行HE染色及Massion染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5 數(shù)據(jù)分析

1.5.1 MR常規(guī)心功能參數(shù)分析 在心臟專用分析軟件CVI42.0上進(jìn)行圖像分析。手動(dòng)勾畫短軸二腔心圖像的左心室舒張末期與收縮末期心內(nèi)膜與心外膜輪廓，選擇室間隔插入點(diǎn)，剔除乳頭肌部分。軟件自動(dòng)計(jì)算心功能參數(shù)，包括左心室舒張末期容積（left ventricular end-diastolic volume，LVEDV）、左心室收縮末期容積（left ventricular end-systolic volume，LVESV）、左心室每搏輸出量（left ventricular stroke volume，LVSV）、左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左心室心肌質(zhì)量（left ventricular mass，LVmass）、左心室舒張末期最大室壁厚度（left ventricular end-diastolic maximum wall thickness，LVEDTHmax）。

1.5.2 心肌應(yīng)力分析 將左心室短軸二腔心、長(zhǎng)軸二腔心及長(zhǎng)軸四腔心的電影序列導(dǎo)入CVI42.0的組織追蹤（tissue tracking，TT）模塊，手動(dòng)勾畫左心室舒張末期心內(nèi)膜及心外膜（圖1），由軟件自動(dòng)計(jì)算出左心室各向應(yīng)力參數(shù)，包括整體徑向應(yīng)力（global radial strain，GRS）、整體周向應(yīng)力（global circumferential strain，GCS）、整體縱向應(yīng)力（global longitudinal strain，GLS）。

圖1 組織特征追蹤（CVI42.0軟件）分析。手動(dòng)勾畫電影圖像左心室舒張末期短軸二腔心（A）、長(zhǎng)軸二腔心（B）和長(zhǎng)軸四腔心（C）的心內(nèi)膜（紅色圈）及心外膜（綠色圈）輪廓，選擇并標(biāo)記上室間隔（藍(lán)色+）及下室間隔（紅色+）插入點(diǎn)，由軟件自動(dòng)計(jì)算左心室心肌形變參數(shù)

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad Prism 8.0軟件，計(jì)量資料以±s表示。方差齊性采用F檢驗(yàn)，兩變量比較采用t檢驗(yàn)或Welch t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠心臟質(zhì)量及心臟體質(zhì)量比增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)表1。

2.2 血生化指標(biāo) 與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠AST及hs-cTnT明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；兩組ALT差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表1。

2.3 影像學(xué)表現(xiàn) 實(shí)驗(yàn)組大鼠心臟增大，心肌增厚，心肌收縮力增強(qiáng)，未見(jiàn)心包積液。對(duì)照組心臟未見(jiàn)異常，未見(jiàn)心包積液（圖2）。

圖2 異丙腎上腺素（皮下注射5 mg?kg，1次/天，7 d）造模后，對(duì)照組（A、C）和實(shí)驗(yàn)組（B、D）左心室短軸二腔心（A、B）和長(zhǎng)軸二腔心（C、D）的MRI圖像。A、C示對(duì)照組大鼠左心室形態(tài)、大小及信號(hào)未見(jiàn)異常，心室壁未見(jiàn)增厚，左心室壁最大厚度為1.83 cm（A中黃色線段）未見(jiàn)心包積液；B、D示實(shí)驗(yàn)組大鼠左心室增大，左心室壁彌漫性增厚，左心室壁最大厚度為2.54 cm（B中黃色線段），心肌信號(hào)未見(jiàn)明顯異常，心包未見(jiàn)積液

2.4 常規(guī)心功能參數(shù) 與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠LVESV減低，LVEDTHmax、LVSV、LVmass及LVEF增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。兩組LVEDV差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組大鼠MR參數(shù)及基礎(chǔ)資料比較（±s）

表1 兩組大鼠MR參數(shù)及基礎(chǔ)資料比較（±s）

注：LVEDTHmax為左心室舒張末期最大室壁厚度，LVEDV為左心室舒張末期容積，LVESV為左心室收縮末期容積，LVSV為左心室每搏輸出量，LVEF為左心室射血分?jǐn)?shù)，LVmass為左心室心肌質(zhì)量，ALT為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，AST為天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，hs-cTnT為高敏度肌鈣蛋白T。括號(hào)內(nèi)為大鼠只數(shù)

指標(biāo)對(duì)照組（n=10）實(shí)驗(yàn)組（n=20）t值P值體質(zhì)量（g） 282.70±4.62（10） 277.70±3.74（20） 0.846 >0.05<0.01心臟體質(zhì)量比（mg/g） 2.98±0.06（10） 4.11±0.06（20） 11.690 <0.01心臟質(zhì)量（mg）837.10±20.13（10）1 130.00±17.08（20）10.830<0.01 LVEDV（ml） 0.40±0.01（10） 0.39±0.01（20） 1.047 >0.05 LVEDTHmax（mm）2.00±0.04（10）2.44±0.04（20）7.339<0.01 LVSV（ml） 0.26±0.00（10） 0.28±0.00（20） 3.430 <0.01 LVESV（ml）0.14±0.00（10）0.11±0.01（20）3.401<0.01 LVEF（%） 64.55±0.57（10） 69.88±1.51（20） 3.300 <0.01 LVmass（g）0.40±0.01（10）0.50±0.01（20）6.223<0.05 ALT（U/L） 36.50±2.37（8） 40.75±4.46（12） 0.918 >0.05 AST（U/L）102.60±5.78（8）158.50±21.81（12）2.482 hs-cTnT（ng/L）947.80±319.60（8）2 526.00±457.70（12）2.921<0.01

2.5 組織病理學(xué)結(jié)果 HE及Massion染色結(jié)果顯示：顯微鏡下觀察，實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)心肌細(xì)胞體積增大，排列稍亂，可見(jiàn)心肌纖維化，心肌纖維化主要以心內(nèi)膜面為主，為彌漫性。對(duì)照組心肌未見(jiàn)異常（圖3～5）。

圖3 異丙腎上腺素（皮下注射5 mg?kg，1次/天，7 d）造模后，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組心臟切片HE染色。實(shí)驗(yàn)組心臟切片橫切面（B，×200；F，×400）和縱切面（D，×200；H，×400）觀：心肌細(xì)胞增大，排列稍紊亂，未見(jiàn)心肌水腫。對(duì)照組心臟切片橫切面（A，×200；E，×400）和縱切面（C，×200；G，×400）觀：心肌細(xì)胞形態(tài)、大小及排列未見(jiàn)異常，未見(jiàn)心肌水腫

2.6 心肌應(yīng)力分析 與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組左心室整體心肌應(yīng)力GRS、GCS及GLS減低，以GRS和GCS減低更為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表2。

表2 兩組大鼠左心室整體心肌應(yīng)變參數(shù)（%，±s）

表2 兩組大鼠左心室整體心肌應(yīng)變參數(shù)（%，±s）

注：GRS為整體徑向應(yīng)力，GCS為整體周向應(yīng)力，GLS為整體縱向應(yīng)力

指標(biāo)對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組（n=10）（n=20）t值P值GRS 54.23±1.21 40.44±2.17 4.305 <0.01<0.01 GLS -22.34±0.83 -18.86±1.01 2.239 <0.05 GCS -25.02±0.28-20.95±0.73 3.831

圖4 異丙腎上腺素（皮下注射5 mg?kg，1次/天，7 d）造模后，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組心臟Massion染色切片掃描圖。對(duì)照組大鼠心臟輪廓正常，左心室壁未見(jiàn)增厚，無(wú)心肌纖維化（×5，A）；實(shí)驗(yàn)組大鼠心臟輪廓增大，心腔變小，左心室壁明顯增厚，左心室心內(nèi)膜側(cè)出現(xiàn)心肌纖維化（圖中藍(lán)色代表纖維化，×5，B）

圖5 異丙腎上腺素（皮下注射5 mg?kg，1次/天，7 d）造模后，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組心臟切片Massion染色。對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)、大小正常，排列規(guī)律、有序，無(wú)心肌纖維化（×200，A）；實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌細(xì)胞增大，排列欠規(guī)律，可見(jiàn)網(wǎng)格狀心肌纖維化（圖中藍(lán)色代表纖維化，×200，B）

3 討論

病理性心肌肥厚是心臟重構(gòu)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是導(dǎo)致各種不良心血管事件的危險(xiǎn)因素，深入了解該病理狀態(tài)，采取有效的干預(yù)治療方法，對(duì)于延緩甚至逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)展，防止其惡化發(fā)展為頑固性心律失常、心力衰竭甚至心源性猝死等嚴(yán)重心血管事件至關(guān)重要。因此，左心室心肌肥厚動(dòng)物模型的建立對(duì)于研究病理性左心室心肌肥厚的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸、預(yù)后及特效藥物等相關(guān)研究意義重大。

參考既往研究[14-15]，本研究連續(xù)7 d皮下注射異丙腎上腺素5 mg/kg建立左心室心肌肥厚動(dòng)物模型，影像學(xué)、形態(tài)學(xué)、組織病理學(xué)研究結(jié)果表明成功建立了異丙腎上腺素介導(dǎo)的左心室心肌肥厚模型，該模型與主動(dòng)脈縮窄[16]比較更簡(jiǎn)單、方便。主動(dòng)脈縮窄需要開胸，感染風(fēng)險(xiǎn)高，縮窄手術(shù)操作時(shí)可因手術(shù)結(jié)扎程度過(guò)大，提高了動(dòng)物死亡概率。此外，對(duì)于非外科專業(yè)的研究者采用該方法構(gòu)建左心室心肌肥厚動(dòng)物模型可能具有一定的難度，導(dǎo)致進(jìn)一步研究受阻。而異丙腎上腺素皮下注射建模非常便捷，5 mg/kg的給藥劑量下幾乎0死亡率，建模效率高，節(jié)約時(shí)間成本及勞動(dòng)成本。此外，本研究結(jié)果顯示，異丙腎上腺素皮下注射7 d后，不僅出現(xiàn)病理性早期左心室心肌肥厚，同時(shí)出現(xiàn)心肌纖維化。因此，異丙腎上腺素皮下注射也是心肌纖維化動(dòng)物模型造模的有效方法，已經(jīng)用于很多與心肌纖維化相關(guān)的研究[17-19]。

本研究采用MR-TT對(duì)異丙腎上腺素介導(dǎo)的大鼠早期左心室心肌肥厚進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠左心室心肌應(yīng)力GRS、GCS、GLS減低，提示心室舒縮功能受損。由于心肌纖維分為3層結(jié)構(gòu)，纖維走向?yàn)閮?nèi)縱、中環(huán)、外斜，內(nèi)側(cè)纖維主要產(chǎn)生縱向應(yīng)變，中層纖維主要產(chǎn)生周向應(yīng)變，而外層纖維主要產(chǎn)生縱向應(yīng)變和周向應(yīng)變，徑向應(yīng)變則由3層纖維共同作用而產(chǎn)生[20]，因此，GRS與GCS、GLS的改變或許可以間接反映心肌纖維基層受累情況。本研究模型中的心肌肥厚累及心肌各層，因此各基層心肌形變能力均減低。然而，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠LVEF升高，與Hinojar等[21]及Xu等[22]的研究結(jié)果一致，上述兩項(xiàng)研究表明，當(dāng)左心室心肌肥厚時(shí)，盡管射血分?jǐn)?shù)保留（正常或升高），但左心室心肌應(yīng)力已經(jīng)降低。LVEF是反映心肌舒縮功能的一個(gè)相對(duì)指標(biāo)，而非絕對(duì)指標(biāo)，根據(jù)LVEF的計(jì)算公式：LVEF=（左心室舒張末期容積－左心室收縮末期容積）÷左心室舒張末期容積，即心臟每搏輸出量除以左心室舒張末期容積，因此，LVEF可以隨著左心室舒張末期容積或左心室收縮末期容積任意1項(xiàng)的改變或者兩者同時(shí)改變而發(fā)生相應(yīng)的變化。而MR-TT所測(cè)得的心肌應(yīng)力反映心肌形變能力的絕對(duì)值，能夠直接反映心肌舒縮功能狀況，因此，MR-TT所測(cè)得的心肌應(yīng)力比LVEF對(duì)于病理性心肌肥厚所致心肌收縮功能異常的鑒別更加敏感，故MR-TT所測(cè)得的心肌應(yīng)力可作為評(píng)估心肌收縮功能狀態(tài)的早期指標(biāo)。

除MR-TT技術(shù)以外，還存在其他可用于分析心肌形變的技術(shù)，其中以心肌標(biāo)記[23]和超聲斑點(diǎn)追蹤[24]應(yīng)用最為廣泛。然而，超聲斑點(diǎn)追蹤易受透聲窗影響，具有角度依賴性，也易受操作者主觀因素的影響。MR心肌標(biāo)記是影像學(xué)分析心肌應(yīng)變的“金標(biāo)準(zhǔn)”[25]，但需要特定的成像序列及后處理，增加了時(shí)間和勞動(dòng)成本，操作者依賴性也大；另外，由于部分容積效應(yīng)干擾，導(dǎo)致心外膜和心內(nèi)膜表面的應(yīng)力測(cè)量偏倚。值得關(guān)注的是，MR-TT與超聲斑點(diǎn)追蹤及MR心肌標(biāo)記在評(píng)估心肌形變能力上具有較好的一致性[23,26]。MR-TT基于常規(guī)電影序列，無(wú)需增加特定成像序列，節(jié)約時(shí)間及勞動(dòng)成本，手動(dòng)標(biāo)記心臟輪廓很大程度地降低血池及乳頭肌引起的部分容積效應(yīng)。因此，MR-TT在評(píng)估心肌應(yīng)力方面的價(jià)值越來(lái)越受重視，目前已廣泛應(yīng)用于各種病理性心肌肥厚相關(guān)疾病的研究，如肥厚性心肌病[27]、高血壓性心肌病[28]、心肌淀粉樣變[29]及糖尿病性心肌病[30]等，并且取得了很大進(jìn)展。

本研究的局限性：本研究探究MR-TT評(píng)估異丙腎上腺素介導(dǎo)的早期心肌肥厚的心肌收縮功能的價(jià)值，因此僅行CMR電影序列掃描，未進(jìn)行釓對(duì)比劑延遲強(qiáng)化、T1Mapping、T1ρMapping等序列掃描，以分析動(dòng)物模型中的心肌纖維化，需要注意的是，本研究模型中的心肌纖維化以心內(nèi)膜下為主，為彌漫性，釓對(duì)比劑延遲強(qiáng)化對(duì)鑒別此模型的心肌纖維化作用不大。CMR的定量成像技術(shù)如T1Mapping[31]、細(xì)胞外間質(zhì)容積分?jǐn)?shù)[32]、T1ρMapping[33]等將有助于彌漫性心肌纖維化的定性及定量研究。此外，本研究?jī)H涉及左心室整體心肌應(yīng)力，徑向、周向及縱向應(yīng)力，反映一個(gè)左心室心肌整體的形變趨勢(shì)，未對(duì)心肌局部及節(jié)段性應(yīng)力進(jìn)行研究，因此無(wú)法獲得更多的細(xì)節(jié)信息。

總之，異丙腎上腺素建立早期左心室心肌肥厚動(dòng)物模型方便、有效，是病理性心肌肥厚相關(guān)基礎(chǔ)研究的理想模型。MR-TT可用于早期病理性心肌肥厚心肌收縮功能的評(píng)估，可望輔助或替代LVEF用于評(píng)價(jià)臨床心功能，尤其是對(duì)于射血分?jǐn)?shù)保留患者的心功能評(píng)價(jià)方面，MR-TT將比LVEF更具有優(yōu)勢(shì)。