溶藻細菌HSY-03對赤潮異彎藻抗氧化系統的影響

傅麗君，林瀟雨，楊磊，黃靖，李婷

1. 福建省新型污染物生態(tài)毒理效應與控制重點實驗室，莆田 351100 2. 莆田學院環(huán)境與生物工程學院，莆田 351100 3. 福建農林大學生命科學學院，福州 350002

有害赤潮已成為當今全球性的海洋災害，嚴重制約沿海經濟的發(fā)展，破壞海洋生態(tài)環(huán)境，威脅人類健康。赤潮異彎藻(Heterosigmaakashiwo)屬于針胞藻類(Raphidophyceae)，為近岸海域廣布類型藻之一，能產生溶血性魚毒素，對水產養(yǎng)殖業(yè)危害嚴重[1-2]。微生物治理赤潮因具有操作簡單、高效、不會帶來環(huán)境二次污染等優(yōu)勢，被認為是最具前途的赤潮防治方法之一[3-4]。溶藻細菌(algicidal bacteria)通過接觸細胞及侵入細胞等直接方式，或者通過分泌胞外活性物質等間接方式抑制藻細胞生長，因種類多、分布廣泛、功能強大等特點，成為目前最常用的微生物控藻細菌[5-6]。由于細菌分泌的殺藻物質濃度較低、難以純化且殺藻活性不穩(wěn)定，使得細菌殺藻作用的機制和過程未能得到詳盡的闡釋。

國內外已有研究表明，殺藻物質或殺藻菌作用藻細胞后，藻細胞結構被破壞，光合、呼吸作用受到抑制[7-8]。藻細胞在進化過程中形成了一系列適應外界脅迫的生理生態(tài)響應體系，但當這種脅迫到一定程度，細胞啟動的防御機制不足以應對脅迫對機體造成的損傷，藻細胞內活性氧(ROS)過度積累，降低光合作用效率，進而會導致藻細胞抗氧化防御系統崩潰，膜脂過氧化程度加劇[9-10]。為減輕氧化脅迫造成的傷害，藻類體內衍生出一套抗氧化防御系統(包括酶促抗氧化系統和非酶促抗氧化系統)，使ROS含量處于平衡狀態(tài)。目前，關于抑藻細菌脅迫下微藻非酶促抗氧化系統的報道相對較少，但是氧化應激啟動后，細胞酶類和非酶促抗氧化系統通常同時啟動，以避免機體受到氧化損傷，同時也有研究表明，過量的ROS極有可能作為信號分子來介導藻細胞程序性死亡(PCD)[11-12]。

本課題組前期從福建省云霄紅樹林區(qū)泥樣中分離出對赤潮異彎藻具殺藻作用的芽孢桿菌屬溶藻細菌HSY-03，其溶藻方式為分泌胞外代謝產物進行間接殺藻[13]，本研究通過開展溶藻菌HSY-03胞外代謝產物對赤潮異彎藻藻細胞光合系統和抗氧化系統的影響，為探討溶藻細菌對赤潮異彎藻溶藻機制和溶藻制劑開發(fā)提供理論依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

1.1.1 供試菌株和藻種

實驗所用菌株HSY-03屬芽孢桿菌屬(Bacillussp.)，分離自中國福建省云霄紅樹林區(qū)。供試藻種為單細胞赤潮異彎藻(Heterosigmaakashiwo)，由暨南大學水生生態(tài)研究所提供，經廈門大學應用環(huán)境微生物研究所采用無菌藻除菌技術純化獲得無菌菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

菌株HSY-03培養(yǎng)基為本課題組前期優(yōu)化所得配方：蛋白胨4.8 g·L-1，酵母粉4.1 g·L-1，NaCl 2.0 g·L-1，葡萄糖0.75 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.3 g·L-1，KCl 0.06 g·L-1，KBr 0.2 g·L-1，KH2PO40.08 g·L-1，CaCl20.8 g·L-1，Fe2(SO4)30.0375 g·L-1，pH=7.5，于28 ℃、150 r·min-1，培養(yǎng)48 h至對數生長期。

赤潮異彎藻所用培養(yǎng)液為f/2培養(yǎng)基[14]，采用三角瓶置于20 ℃±1 ℃光照生化培養(yǎng)箱，光暗周期12 h L∶12 h D，光照強度為3 000 lx。

1.2 主要化學試劑與儀器

酶標儀(BIO-RAD，深圳市科力易翔儀器設備有限公司，中國)，紫外可見光光度計(TU-1900，北京普析通用儀器有限責任公司，中國)，光照培養(yǎng)箱(GTOP-310C，寧波海曙賽福實驗儀器廠，中國)，超聲波細胞粉碎機(SCIENTZ-IID，寧波新芝生物科技股份有限公司，中國)，高級浮游植物熒光儀(PHYTO-PAM，Walz公司，德國)等。

總超氧化物歧化酶(T-SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和抗壞血酸(AsA)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所(中國)。

1.3 試驗方法

1.3.1 HSY-03對赤潮異彎藻光合色素和光合效率的影響

將培養(yǎng)至對數生長期的HSY-03發(fā)酵培養(yǎng)液在10 000×g條件下離心10 min，去除菌體，制得發(fā)酵上清液，以HSY-03上清液和添加藻液的體積比計算處理終濃度。不同終濃度(0.5%、1.5%和3.0%)HSY-03上清液處理組，以2216E培養(yǎng)基處理作為對照組，分別取處理組和對照組藻液各50 mL，95%乙醇萃取細胞中色素，4 ℃避光靜置24 h，萃取液3×103×g離心5 min，取上清液分別于664、630和480 nm處測定吸收值，實驗設置3組平行。葉綠素a含量計算采用Jeffrey和Humphrey[15]的公式：

Chla(μg·cell-1)=11.47×A664-0.40×A630

類胡蘿卜素含量計算采用Strickland和Parsons[16]的公式：Carotenoids (μg·mL-1)=4×A480

式中：A664、A630和A480分別為上清液在波長為664、630和480 nm條件下的吸收值。

室溫下用高級浮游植物熒光儀測定葉綠素熒光，激發(fā)光強為最大光強3 000 μmol·(m2·s)-1，藻液暗處理15～30 min，記錄時間5 s，每隔24 h測定一次，用可變熒光(Fv)與最大熒光(Fm)的比值Fv/Fm表示光合效能活性的大小。

1.3.2 HSY-03對赤潮異彎藻細胞生理生化指標的影響

將HSY-03無菌上清液以1.5%終濃度加入到100 mL赤潮異彎藻中，于培養(yǎng)12、24、36、48和72 h后取20 mL藻液，4 ℃、3 000×g離心10 min收集藻細胞，加入經4 ℃預冷的0.05 mol·L-1H3PO4緩沖液(pH為7.5)5 mL，冰浴條件下超聲破碎(工作3 s，間隙3 s，共20次)，破碎液于4 ℃、1.2×104×g離心15 min，取上清液即制得粗酶液。采用南京建成生物工程公司生產的試劑盒測定酶促抗氧化系統CAT、SOD、POD活性和非酶促抗氧化系統GSH、AsA含量。以2216E培養(yǎng)基處理作為對照組，每處理設置3組平行。

藻細胞內部ROS強度測定采用熒光染料DCFH-DA進行[17]，DCFH-DA主要針對過氧化物伴隨下的H2O2及·OH。取0.5 mL終濃度為10 μg·mL-1的DCFH-DA，加入到上述處理藻細胞中，避光置于37 ℃下溫浴1 h，間隔3 min搖勻一次，之后用f/2藻培養(yǎng)基洗滌藻細胞3次。在485 nm下激發(fā)，525 nm下采用酶標儀測定藻細胞熒光強度。

2 結果與分析(Results and analysis)

2.1 對光合色素含量和熒光效率的影響

葉綠素a是藻類初始光捕獲色蛋白之一，與藻細胞的生物量密切相關，能反映殺藻物質對藻細胞生長狀況的影響。由圖1可知，經溶藻細菌HSY-03無菌上清液處理后，赤潮異彎藻葉綠素a含量降低，并表現出明顯的時間和劑量效應，高濃度處理組抑制現象極為明顯。低濃度(0.5%)HSY-03上清液處理前24 h，藻細胞葉綠素a含量與對照組在同一水平，48 h開始葉綠素a含量即顯著低于對照組(P<0.05)。整個處理時期，中高濃度(1.5%和3.0%)處理組藻細胞葉綠素a含量均顯著低于對照組(P<0.01)。0.5%、1.5%濃度處理96 h后，藻細胞葉綠素a含量分別下降了46.0%(P<0.05)、68.4%(P<0.01)，3.0%濃度處理96 h后藻細胞葉綠素a含量幾乎為0。這說明，HSY-03胞外活性物質對葉綠素a造成破壞，葉綠素a的分解使得為藻細胞提供有機物及能量的光合系統被破壞，導致能量運輸被阻斷，從而引起藻細胞死亡。

不同濃度HSY-03上清液處理下，赤潮異彎藻類胡蘿卜素含量變化如圖2所示，結果表明，對照組藻細胞類胡蘿卜素含量總體變化幅度較小，低濃度(0.5%)HSY-03上清液處理24 h，藻細胞類胡蘿卜素含量為對照組1.07倍(P<0.01)，之后藻細胞類胡蘿卜素含量接近對照水平。1.5%上清液處理24 h，藻細胞類胡蘿卜素含量上升，為對照組的1.09倍(P<0.01)，處理48 h后藻細胞類胡蘿卜素含量逐漸開始下降，顯著低于對照組(P<0.01)。而高濃度處理組藻細胞類胡蘿卜素始終低于對照組(P<0.01)，24、48和72 h分別下降了18.3%、43.1%和74.5%，處理96 h，藻細胞類胡蘿卜素基本降為0。這表明，HSY-03無菌上清液的加入可能造成了藻細胞的氧化脅迫，低濃度上清液在一定程度上能夠刺激藻細胞產生類胡蘿卜素來削弱氧化脅迫的危害，但隨著脅迫的持續(xù)增長，藻細胞功能代謝受損，間接影響了藻細胞類胡蘿卜素的合成，從而表現出類胡蘿卜素含量的下降。

圖2 HSY-03上清液對赤潮異彎藻細胞類胡蘿卜素含量影響Fig. 2 Effects of HSY-03 cell-free filtrate on carotenoids contents of Heterosigma akashiwo

藻細胞的Fv/Fm可代表光系統Ⅱ(PSⅡ)的光化學效率，能準確反映藻細胞PSII反應中心開放狀態(tài)的量子產量，是衡量藻細胞光合作用能力的重要參數之一。利用葉綠素熒光動力學可以快速、靈敏、無損傷地探測逆境對藻類光合作用的影響[18]。由圖3可知，HSY-03上清液處理后，藻細胞Fv/Fm值均呈下降趨勢，且呈劑量-效應關系。處理24 h，低濃度(0.5%)處理組Fv/Fm值即表現出降低的趨勢，1.5%和3.0%濃度處理組Fv/Fm值明顯低于對照(P<0.01、P<0.05)，隨著處理時間的延長，各處理組Fv/Fm值均顯著低于對照組(P<0.01)。處理96 h，0.5%、1.5%和3.0%濃度處理組Fv/Fm比值比對照分別下降了37.9%、51.5%和80.3%(P<0.01)。這表明，HSY-03無菌上清液的加入降低了PSⅡ活性，抑制藻類光合系統，導致光合作用效率下降。

圖3 HSY-03上清液對赤潮異彎藻細胞葉綠素a 熒光Fv/Fm的影響注：Fv/Fm表示藻細胞可變熒光(Fv)強度與最大熒光(Fm)強度之比。Fig. 3 Effects of HSY-03 cell-free filtrate on chlorophyll a fluorescence Fv/Fm of Heterosigma akashiwoNote: Fv/Fm represents the ratio of variable fluorescence (Fv) intensity to maximum fluorescence (Fm) intensity of algal cells.

2.2 藻細胞胞內ROS含量變化

藻細胞受到脅迫時，胞內會產生大量的ROS，為了表征HSY-03上清液對藻細胞的脅迫作用，對藻細胞內的ROS含量變化進行了測定。由圖4可知，在殺藻菌作用下，藻細胞內的ROS含量表現出先升高后降低的趨勢。3%濃度HSY-03上清液作用2 h后，藻細胞內ROS含量即顯著上升(P<0.01)，為對照組1.6倍，至第6小時ROS含量達到峰值，為初始階段的2.61倍(P<0.01)。隨著處理時間延長，藻細胞內ROS含量開始下降，10 h后ROS含量低于初始水平，12 h后ROS含量為初始階段的66.7%(P<0.01)。

圖4 HSY-03上清液對赤潮異彎藻細胞 活性氧(ROS)含量影響注：**表示與對照組相比差異顯著(P<0.01)。Fig. 4 Effects of HSY-03 cell-free filtrate on reactive oxygen species (ROS) of Heterosigma akashiwoNote: **means significant differences compared with the control (P<0.01).

2.3 藻細胞抗氧化系統活性響應

由圖5(a)可知，經HSY-03上清液處理12 h，各處理組SOD活性即開始升高，表明藻細胞防御機制啟動。但藻細胞的防御能力有限，藻細胞無法產生更多的SOD以抵抗傷害，至處理36 h，SOD活性開始下降接近對照水平。為了維持對藻細胞內部ROS的持續(xù)清除作用，隨著脅迫時間的延長，藻細胞SOD活性又開始上升，至處理48 h達峰值，各處理組SOD活性分別是對照組1.69倍(P<0.01)、2.10倍(P<0.01)和2.55倍(P<0.01)，隨后SOD活性又逐漸下降，但始終高于對照組(P<0.01)。由圖5(b)和圖5(c)可知，藻細胞內CAT活性與SOD活性表現出相似的變化趨勢。處理至48 h時CAT活性達峰值，分別是對照組CAT活性的2.06倍(P<0.01)、3.95倍(P<0.01)和4.90倍(P<0.01)，隨后CAT活性開始下降。SOD和CAT活性的增高有助于清除細胞內部的ROS，但當細胞內ROS超出了抗氧化酶的清除能力時，依然會導致細胞死亡。由圖5(c)可知，POD活性變化趨勢與SOD活性類似，但低濃度(0.5%)處理組POD活性變化較為不明顯，至處理48 h，1.5%和3.0%處理組POD活性分別是對照組1.81倍(P<0.01)和2.16倍(P<0.01)，隨著處理時間延長，各處理組POD活性呈下降趨勢，接近初始階段。這表明，高濃度處理組POD可用于緩解過量的ROS，從而造成自身含量下降。在HSY-03上清液脅迫下，CAT和POD均發(fā)揮酶活特性，清除胞內H2O2，使機體氧自由基含量平衡。這也進一步證實了氧化脅迫是誘導藻細胞死亡的作用機理之一。

圖5 HSY-03上清液對赤潮異彎藻細胞超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)活性的影響注：*、**表示與對照組相比差異顯著(P<0.05、P<0.01)；下同。Fig. 5 Effects of HSY-03 cell-free filtrate on the activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and peroxidase (POD) of Heterosigma akashiwoNote: *, **mean significant differences compared with the control (P<0.05, P<0.01); the same below.

由圖6可知，MDA含量與HSY-03上清液濃度呈正相關型劑量-效應關系。處理12 h，0.5%、1.5%和3.0%處理組MDA含量分別是對照組的1.15倍(P<0.05)、1.35倍(P<0.01)和1.73倍(P<0.01)。隨著處理時間的增加，各處理組的MDA含量繼續(xù)上升，在48 h時達到各自的最高水平，分別為對照組的1.40倍(P<0.05)、1.76倍(P<0.01)和2.28倍(P<0.01)。在處理60 h時，各處理組的MDA含量相對于48 h有所下降，但是仍顯著高于對照組。這說明，在細菌HSY-03胞外活性物質的脅迫下，藻細胞內ROS不斷積累，造成藻細胞膜脂過氧化程度增強，MDA含量上升。但持續(xù)的脅迫環(huán)境，致使藻細胞自身抗氧化系統的啟動或者膜脂損傷加劇，MDA含量則開始逐漸下降。

圖6 HSY-03上清液對赤潮異彎藻丙二醛(MDA)含量的影響Fig. 6 Effects of HSY-03 cell-free filtrate on themalondialdehyde (MDA) content of Heterosigma akashiwo

藻細胞的非酶促抗氧化系統包括GSG和AsA，HSY-03上清液對赤潮異彎藻細胞GSH和AsA含量影響結果如圖7所示。由圖7(a)可知，在整個處理過程中，對照組GSH水平基本保持不變；在處理12 h時，各處理組藻細胞GSH含量顯著上升，分別為對照組1.63倍、1.85倍(P<0.01)和2.72倍(P<0.01)；隨著處理時間延長，GSH含量繼續(xù)增大，以清除過量的ROS，在處理36 h時，各處理組GSH含量分別達到峰值，分別是對照組的2.33倍(P<0.01)、2.80倍(P<0.01)和3.36倍(P<0.01)；從48 h開始，處理組的GSH含量逐漸下降至接近對照水平，這可能是GSH在清除ROS的同時，自身轉換成了氧化型谷胱甘肽(GSSGs)，因此GSH含量降低到低水平。由圖7(b)可知，低濃度(0.5%)處理組藻細胞內AsA含量與對照相比無顯著差異，中高濃度(1.5%和3.0%)處理12 h后AsA含量則顯著高于對照(P<0.01)，處理36 h時達到峰值，為對照組的1.70倍(P<0.01)和2.0倍(P<0.01)；隨后各處理組AsA含量開始下降，但仍顯著高于對照(P<0.01)。AsA通過與GSSG反應以清除部分ROS，但過多的ROS消耗了大量的AsA，導致處理后期AsA含量開始下降。

圖7 HSY-03上清液對赤潮異彎藻細胞谷胱甘肽(GSH)和抗壞血酸(AsA)含量的影響Fig. 7 Effects of HSY-03 cell-free filtrate on the glutathione (GSH) and ascorbic acid (ASA) contents of Heterosigma akashiwo

3 討論(Discussion)

ROS在細胞信號傳導方面有著重要的作用，同時也會對細胞內蛋白質、脂質和核酸等造成不可逆的損傷，并引起細胞死亡[23]。本研究采用DCFH-DA法測定ROS含量變化，經3% HSY-03無菌上清液處理后，赤潮異彎藻細胞H2O2/·OH水平顯著上升到一定水平后逐漸下降。由于·OH是ROS中活性最強的基團，其半衰期<1 μs，對其產生位點附近的生物大分子有非常強的親合力，反應速率極快(K>109mol-1·L·s-1)，因此對生物體危害極大[24]。H2O2/·OH水平上升表明HSY-03誘導藻細胞產生ROS，預示了HSY-03無菌上清液可能介導了藻細胞的氧化損傷，研究結果與張化俊等的[25]一致。

非酶促抗氧化系統的GSH和AsA，二者常共同作用以清除過量ROS。GSH是一種由谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸組成的三肽，其分子結構含有巰基，巰基自身氧化后能將ROS清除，同時巰基變成GSSG；AsA作為GSH的輔助，通過自身的氧化將GSSG轉化成GSH，再次用于ROS的清除[29]，保護細胞免受氧化損傷。在HSY-03上清液作用下，藻細胞GSH含量上升，用于清除過量ROS，在清除ROS的同時，自身轉換成了GSSG，故含量開始下降。在HSY-03脅迫下，AsA含量上升，通過與GSSG反應含量逐漸下降。在GSH和AsA共同作用下繼續(xù)清除過量的ROS。雖然ROS的含量在藻細胞自身抵抗作用下開始下降，但是其作用效果沒有被完全緩解，同時大量的抗氧化系統的響應過度消耗了藻自身的能量，造成了藻細胞的氧化損傷。

以上結果表明，溶藻細菌HSY-03溶藻機制主要是通過胞外活性物質抑制藻細胞光合作用，引起藻細胞內部氧化損傷，當胞內產生的過量ROS得不到及時清除時，ROS引發(fā)含有膜結構的細胞器發(fā)生脂質過氧化，并通過引發(fā)一定的級聯反應造成藻細胞死亡。但關于菌株HSY-03分泌的溶藻活性物質的特性和結構確認，赤潮異彎藻藻遺傳信息的解析和抑藻物質作用下藻細胞關鍵功能基因的響應有待于進一步探討。