FTIR在環(huán)境毒理學(xué)研究中的應(yīng)用

胡立新，熊倩，陳曉雯，趙佳慧，趙建亮，劉有勝，應(yīng)光國(guó),*

1. 華南師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院，廣州 510006 2. 廣東省化學(xué)品污染與環(huán)境安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&環(huán)境理論化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華南師范大學(xué)，廣州 510006 3. 國(guó)家環(huán)境保護(hù)環(huán)境污染健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生態(tài)環(huán)境部華南環(huán)境科學(xué)研究所，廣州 510655

環(huán)境毒理學(xué)是研究環(huán)境污染物對(duì)生物的毒性效應(yīng)及作用機(jī)制的一門(mén)學(xué)科，其主要內(nèi)容是研究環(huán)境污染物毒性效應(yīng)的監(jiān)測(cè)、毒性作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)、生物標(biāo)志物的提取及污染物的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)。環(huán)境污染物在一定劑量下對(duì)生態(tài)環(huán)境中的生物都存在著直接或間接的毒害作用?；趩我恍?yīng)終點(diǎn)的傳統(tǒng)毒性測(cè)試方法很難準(zhǔn)確地評(píng)估污染物的毒性效應(yīng)。因此，發(fā)展多指標(biāo)、高綜合性的毒性測(cè)試方法對(duì)研究污染物的毒性效應(yīng)、評(píng)估化學(xué)物質(zhì)的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)具有重要的意義。

紅外光譜是通過(guò)研究分子內(nèi)部原子之間振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)信息來(lái)確定化合物結(jié)構(gòu)的技術(shù)。對(duì)于正常細(xì)胞而言，生物體內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸和糖類(lèi)等生物大分子的含量始終保持在平衡狀態(tài)。當(dāng)生物受到外界刺激時(shí)，污染物作用于不同的生物大分子或者因污染物的存在使得某些生物大分子在構(gòu)型和構(gòu)象等方面發(fā)生變化，進(jìn)而引起相應(yīng)的紅外光譜吸收峰的改變。通過(guò)對(duì)特征峰的分析，可以更加準(zhǔn)確地得到污染物介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)生物大分子的變化情況，從而在生物大分子水平對(duì)污染物的毒性效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。相比于傳統(tǒng)的毒性測(cè)試方法，基于光譜手段的毒性測(cè)試方法不僅技術(shù)便捷、靈敏，而且能夠提供更加豐富的生物大分子變化的信息，為進(jìn)一步的毒性機(jī)制和毒性通路研究提供新的思路。

1 紅外光譜概述(Overview of infrared spectroscopy)

紅外光譜是將分子中在振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)過(guò)程中引起的偶極矩變化信息轉(zhuǎn)化為可視化的透射和吸收形式的譜圖，從而用以分析化學(xué)物質(zhì)以及生物大分子(脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及核酸等)在構(gòu)型和構(gòu)象上變化的技術(shù)[1-2]。由于紅外光譜在樣品檢測(cè)方面具有樣品無(wú)損、非標(biāo)記性等優(yōu)勢(shì)，該技術(shù)已經(jīng)成為生物大分子結(jié)構(gòu)研究的重要手段之一，在醫(yī)學(xué)、法醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[3]。

紅外光譜作為生物大分子結(jié)構(gòu)分析中的常用技術(shù)，在毒理學(xué)研究中也被廣泛應(yīng)用。通過(guò)對(duì)受試生物在生物大分子水平上結(jié)構(gòu)變化情況，來(lái)表征環(huán)境污染物對(duì)細(xì)胞、組織或者器官等的毒性效應(yīng)，一方面可以靈敏、有效地評(píng)估污染物的毒性效應(yīng)，另一方面還可以基于大分子水平推斷其毒理機(jī)制。紅外光譜應(yīng)用于環(huán)境毒理學(xué)研究中的優(yōu)勢(shì)主要包括；能夠用以分析環(huán)境濃度污染物介導(dǎo)的毒性損傷作用；樣品分析用時(shí)較短；樣品無(wú)需復(fù)雜的前處理過(guò)程，且不會(huì)引起二次污染的問(wèn)題；光譜信息具有很強(qiáng)的特征性，同時(shí)還能提供豐富的生物分子的變化信息；光譜檢測(cè)對(duì)樣品的形態(tài)要求不高，適用于多種生物(細(xì)菌、細(xì)胞、植物和動(dòng)物等)的檢測(cè)分析[2]。

2 生物大分子的光譜特征峰識(shí)別(Characteristic recognition of biological macromolecules)

生物樣本主要由蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸和糖類(lèi)等生物大分子組成，而這些大分子在結(jié)構(gòu)組成上因具有獨(dú)特的化學(xué)鍵而呈現(xiàn)出具有特征性的紅外光譜振動(dòng)峰[5]。因此，可以用生物樣本的光譜振動(dòng)信息來(lái)表征細(xì)胞內(nèi)生物大分子的變化情況[2]。通過(guò)對(duì)生物大分子的變化情況進(jìn)行進(jìn)一步的分析，可以從分子水平揭示污染物脅迫對(duì)受試生物的影響[4]。

2.1 蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)是生物的重要組成，其結(jié)構(gòu)信息與活性及功能密切相關(guān)。結(jié)構(gòu)穩(wěn)定是蛋白質(zhì)發(fā)揮正常功能的前提條件。當(dāng)受試生物受到來(lái)自外界環(huán)境的脅迫或刺激時(shí)，會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上發(fā)生改變[6]。在基于紅外光譜的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究中，與蛋白質(zhì)相關(guān)的振動(dòng)區(qū)域主要有酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ和酰胺Ⅲ。酰胺Ⅰ的振動(dòng)信息主要發(fā)生在1 650 cm-1左右，該區(qū)域的振動(dòng)峰主要是由碳氧雙鍵和少量的碳氮單鍵貢獻(xiàn)[7]。酰胺Ⅱ主要由碳氮鍵的面內(nèi)彎曲和碳?xì)涞纳炜s振動(dòng)貢獻(xiàn)，振動(dòng)峰在1 550 cm-1左右[8]。酰胺Ⅲ主要在1 400～1 200 cm-1區(qū)域，是由氮?dú)鋸澢吞嫉炜s振動(dòng)構(gòu)成[9]。

基于紅外光譜的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析主要以酰胺Ⅰ為主。該區(qū)域的的振動(dòng)峰出現(xiàn)在1 700～1 600 cm-1范圍內(nèi)，通過(guò)二級(jí)倒數(shù)和解卷積算法，可以得到8～11個(gè)與蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)相關(guān)的振動(dòng)峰(表1)。其中，β折疊結(jié)構(gòu)主要在較低的波數(shù)(1 620～1 640 cm-1)、其次為無(wú)規(guī)則卷曲(1 640～1 648 cm-1)、α螺旋(1 650～1 658 cm-1)、310螺旋(1 663 cm-1)、β轉(zhuǎn)角(1 666～1 690 cm-1)以及反平行β折疊(1 690～1 695 cm-1)[6]。由于紅外光譜可以準(zhǔn)確、靈敏地反映蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)信息的變化，使得光譜技術(shù)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析領(lǐng)域快速發(fā)展[10]。在環(huán)境毒理學(xué)研究中，當(dāng)受試生物受到污染物脅迫，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中折疊結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，酰胺Ⅰ振動(dòng)峰主要表現(xiàn)為窄峰；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)比較松散，呈現(xiàn)出無(wú)序結(jié)構(gòu)的特征時(shí)，酰胺Ⅰ以寬峰為主[11]。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中另外一種構(gòu)象形式為α螺旋結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)的變化情況與谷氨酸、甘氨酸和脯氨酸有關(guān)。甘氨酸和脯氨酸含量的增加往往會(huì)導(dǎo)致螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生強(qiáng)烈改變[12]。與β折疊結(jié)構(gòu)關(guān)系較為密切的是纈氨酸和谷氨酸，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的錯(cuò)誤折疊會(huì)引起細(xì)胞功能發(fā)生紊亂、蛋白質(zhì)聚集等[13]。甘氨酸和脯氨酸的含量變化與β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)有關(guān)，而β轉(zhuǎn)角的變化可以用來(lái)表征球形蛋白的形成以及磷酸化和糖基化的氨基酸側(cè)鏈修飾[14]。無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)一般與折疊、螺旋和轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)一起用于說(shuō)明蛋白質(zhì)變性情況[15]。

在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究中，由于紅外光譜對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)非常敏感，因此也被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)聚集的研究中。Miller等[10]綜述了蛋白質(zhì)聚集的紅外光譜檢測(cè)表征技術(shù)，發(fā)現(xiàn)具有高信噪比的同步輻射光源的光譜儀可以對(duì)蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊和聚集進(jìn)行檢測(cè)；在阿爾茨海默癥、帕金森等疾病的病變組織進(jìn)行光譜分析發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)聚集與α螺旋和β折疊之間的轉(zhuǎn)換存在相關(guān)性，這一結(jié)論與圓二色光譜和核磁共振結(jié)果相一致。此外，紅外光譜還可以用于蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究。Zhang等[16]運(yùn)用紅外光譜研究曲古霉素A介導(dǎo)的Hela細(xì)胞在蛋白質(zhì)乙?；缴系淖兓闆r，發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)A(CH3)/A(CH2)和α-螺旋的含量來(lái)定量分析蛋白質(zhì)乙?；?。此外，紅外光譜還可以用于蛋白質(zhì)磷酸化的研究中，以970 cm-1的變化情況來(lái)表征磷酸化水平。這是因?yàn)楫?dāng)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)中的羥基被磷酸根離子取代后，維持分子內(nèi)層構(gòu)象的氫鍵被打破，使得β折疊含量出現(xiàn)明顯的下降，因此可以用磷酸基團(tuán)的振動(dòng)信息與酰胺Ⅰ的振動(dòng)信息綜合反映蛋白質(zhì)磷酸化水平[17]。

總的來(lái)說(shuō)，紅外光譜能夠很便捷地對(duì)生物大分子中官能團(tuán)的變化進(jìn)行表征。通過(guò)對(duì)與蛋白質(zhì)相關(guān)的紅外光譜振動(dòng)信息的變化來(lái)闡釋生化過(guò)程中蛋白質(zhì)分子在結(jié)構(gòu)上的差異性；通過(guò)對(duì)酰胺Ⅰ中各二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析，對(duì)污染物介導(dǎo)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行評(píng)估。因此，基于紅外光譜的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究，有助于揭示環(huán)境污染物與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)之間的動(dòng)態(tài)關(guān)系，為污染物毒理機(jī)制的研究提供新的思路。

2.2 脂質(zhì)

脂質(zhì)是細(xì)胞膜的重要組成部分，主要由磷酸基和磷酸膽堿基的極性親水頭部和以長(zhǎng)鏈脂肪酸為主的中性脂分子的疏水尾部?jī)刹糠纸M成。脂質(zhì)分子中不飽和雙鍵的數(shù)目以及脂肪酸烷基鏈長(zhǎng)度的變化均會(huì)引起細(xì)胞膜在結(jié)構(gòu)與功能上的改變[18]?；诩t外光譜的細(xì)胞膜脂質(zhì)研究，一方面可以說(shuō)明磷脂分子在結(jié)構(gòu)上的變化，另外一方面還可以分析細(xì)胞膜上蛋白和脂質(zhì)過(guò)氧化等現(xiàn)象[19]。在脂質(zhì)分子的紅外光譜圖來(lái)看，脂質(zhì)分子的紅外吸收峰主要分布在碳?xì)渖炜s振動(dòng)區(qū)域以及部分生化指紋區(qū)域。在碳?xì)渖炜s振動(dòng)區(qū)域，主要包括與不飽和碳?xì)滏I相關(guān)的振動(dòng)峰(～3 010 cm-1)、CH3的對(duì)稱(chēng)和反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)(～2 870 cm-1和～2 960 cm-1)以及CH2的對(duì)稱(chēng)和反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)(～2 850 cm-1和～2 920 cm-1)。通過(guò)對(duì)該區(qū)域與碳?xì)湎嚓P(guān)的振動(dòng)信息分析，可以獲得不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸之間的變化情況[20]。通過(guò)對(duì)CH2基團(tuán)的振動(dòng)峰進(jìn)行分析，可以得到與脂質(zhì)分子亞甲基的堆積、烷基鏈的長(zhǎng)度以及烷基鏈的無(wú)序化信息等[21]。通過(guò)對(duì)甲基和亞甲基的含量進(jìn)行分析，可以用亞甲基的含量總和來(lái)表征總脂肪酸的量[22]，用不飽和碳?xì)渑c總脂的比值來(lái)說(shuō)明脂肪酸的不飽和程度，用甲基和亞甲基的比值來(lái)說(shuō)明膜脂的流動(dòng)性[23]。

在生物指紋區(qū)，與脂質(zhì)相關(guān)的振動(dòng)峰主要出現(xiàn)在1 800～1 700 cm-1范圍內(nèi)。當(dāng)振動(dòng)信息出現(xiàn)在低波數(shù)(1 705 cm-1)時(shí)，可以表征氫鍵化的羰基基團(tuán)；而在高波數(shù)(1 740 cm-1)表征的是非氫鍵化的羰基基團(tuán)；在1 710 cm-1左右的振動(dòng)峰表征的是羧基。羰基基團(tuán)與亞甲基基團(tuán)的比值，可以用以分析脂質(zhì)過(guò)氧化程度[24]。綜合2個(gè)振動(dòng)區(qū)域的光譜信息，可以從結(jié)構(gòu)和功能上對(duì)細(xì)胞膜的損傷作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。

綜上所述，細(xì)胞膜上脂質(zhì)分子在結(jié)構(gòu)上發(fā)生微小的變化，都可以在光譜振動(dòng)信息上得到明顯的表征。細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性決定其功能的完整性[25]。細(xì)胞膜上烷基鏈長(zhǎng)度、膜的流動(dòng)性、脂肪酸不飽和度以及過(guò)氧化程度都可以作為指示環(huán)境污染物脅迫的生物標(biāo)志物[26]?；诩t外光譜的細(xì)胞膜脂研究，可以為污染物介導(dǎo)的膜損傷機(jī)制研究提供便利。

2.3 核酸

核酸是生命體存儲(chǔ)遺傳信息的重要組成。核酸分子結(jié)構(gòu)的變化往往會(huì)影響生物體的生長(zhǎng)發(fā)育。基于紅外光譜的核酸分子研究中，DNA/RNA的特征振動(dòng)信息在1 300～860 cm-1區(qū)域，主要用以說(shuō)明DNA分子的構(gòu)型信息[27]。與DNA分子相關(guān)的振動(dòng)信息主要包括基于DNA骨架結(jié)構(gòu)在1 300～1 000 cm-1的振動(dòng)信息，以及900～800 cm-1的五碳糖的振動(dòng)信息。DNA在結(jié)構(gòu)上主要由具有剛性特點(diǎn)的A-DNA、柔性特點(diǎn)的B-DNA以及左手Z-DAN組成。其中，B-DNA的振動(dòng)峰主要在1 225 cm-1和1 080 cm-1左右，>1 225 cm-1的振動(dòng)峰歸屬于A-DNA，1 025 cm-1歸屬于Z-DNA[28]。當(dāng)DNA分子受到外界環(huán)境的刺激和脅迫時(shí)(如高鹽度環(huán)境下)，左手Z-DNA容易形成，而A-DNA和B-DNA容易發(fā)生相互的轉(zhuǎn)化[29]。因此，可以通過(guò)DNA分子結(jié)構(gòu)變化信息反映DNA損傷程度。

3 在環(huán)境毒理學(xué)研究中的應(yīng)用(Application in environmental toxicology research)

截至目前，紅外光譜在毒理學(xué)研究中主要應(yīng)用于環(huán)境污染物的快速毒性檢測(cè)以及在生物大分子水平上的毒性機(jī)制的研究。但是該領(lǐng)域的發(fā)展很大程度上依賴(lài)于生物信息學(xué)方面的支持?？偠灾t外光譜結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)的手段，以環(huán)境中常見(jiàn)的生物，如細(xì)菌、細(xì)胞、綠藻、浮萍、斑馬魚(yú)和小鼠等為研究對(duì)象，對(duì)環(huán)境污染物的毒性效應(yīng)進(jìn)行識(shí)別和分析，在污染物毒性篩查以及毒性機(jī)制研究中起到很重要的作用。

3.1 紅外光譜在重金屬毒性研究中的應(yīng)用

在重金屬的毒性研究中，Palaniappan和Vijayasundaram[30]基于紅外光譜研究了砷對(duì)南亞野鯪(Labeorohita)腎臟毒性，發(fā)現(xiàn)砷會(huì)對(duì)腎臟組織產(chǎn)生損傷作用。通過(guò)對(duì)腎臟光譜信息解析發(fā)現(xiàn)，砷中毒會(huì)引起腎臟組織中脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等生化組成發(fā)生顯著性改變，并在分子水平引起腎臟組織的組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。Senthamilselvan等[31]研究鎳和汞對(duì)尖吻鱸(Latescalcarifer)組織的毒性作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)鎳和汞中毒的肌肉組織的光譜差異主要集中在與脂類(lèi)、蛋白質(zhì)和核酸相關(guān)的振動(dòng)信息。且在亞致死濃度下，2種重金屬均會(huì)引起蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，表現(xiàn)為α螺旋結(jié)構(gòu)的減少和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的增加。Kardas等[32]研究發(fā)現(xiàn)，鈷會(huì)引起細(xì)菌細(xì)胞膜和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的改變，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)構(gòu)象自由度降低。Llabjani等[33]利用不同濃度的砷、銅和硒處理MCF-7細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)3種重金屬的關(guān)鍵靶分子是脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，但是不同重金屬的指紋特征又存在特異性。同時(shí)，光譜數(shù)據(jù)表明3種重金屬均會(huì)引起活性氧(ROS)的產(chǎn)生，可對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)起到刺激或損傷作用。在對(duì)鎳和鉻的細(xì)菌毒性研究中，發(fā)現(xiàn)鎳和鉻聯(lián)合暴露存在協(xié)同效應(yīng)[34]。Hu等[35]研究銅離子暴露對(duì)大腸桿菌(Escherichiacoli)的毒性，發(fā)現(xiàn)紅外光譜在細(xì)菌膜脂、核酸、肽聚糖和蛋白質(zhì)等的檢測(cè)中靈敏度高，并且能夠檢測(cè)到短時(shí)間暴露引起的磷脂組成的變化。Dao等[36]運(yùn)用紅外光譜研究鉛對(duì)綠藻(Chlorellasp.FleB1和ScenedesmusacutusYaA6)毒性，發(fā)現(xiàn)鉛會(huì)引起碳水化合物和脂質(zhì)含量增加，蛋白質(zhì)和磷酸化分子含量下降；且光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法能從分子水平快速揭示污染物毒性特征，還可以通過(guò)細(xì)胞內(nèi)分子損傷水平預(yù)測(cè)污染物的暴露水平。

3.2 紅外光譜在有機(jī)化合物毒性研究中的應(yīng)用

紅外光譜在有機(jī)物的毒性研究中應(yīng)用較為廣泛。在持久性有機(jī)污染物毒理學(xué)研究方面，Barber等[37]研究低劑量多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)，包括PBDEs同系物47、99、153、183和209對(duì)MCF-7的毒性時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)暴露濃度<10-9mol·L-1時(shí)，PBDEs引起的細(xì)胞內(nèi)生物分子的變化可以被光譜信息捕獲。Llabjani等[38]研究了PBDEs(同系物47、153、183和209)、苯并(a)芘(B[a]P)、雜環(huán)胺(PHIP)、雌二醇(E2)及林丹對(duì)MCF-7細(xì)胞的毒性作用，結(jié)果表明，即使在極低的暴露濃度(10-12mol·L-1)，PBDE處理組與對(duì)照組之間光譜信息仍然具有顯著性差異，且主要出現(xiàn)在與脂質(zhì)和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)相關(guān)的振動(dòng)區(qū)域。Llabjani等[39]運(yùn)用紅外光譜進(jìn)一步研究了PBDEs(同系物47、153、183和209)和多氯聯(lián)苯(PCBs)(同系物126和153)的聯(lián)合毒性作用，發(fā)現(xiàn)PCB126與PBDEs的聯(lián)合作用表現(xiàn)為拮抗作用，而PCB153與PBDEs的聯(lián)合作用表現(xiàn)為協(xié)同作用。Pang等[40]研究了B[a]P對(duì)不同周期(S期和G0/G1期)細(xì)胞的毒性作用，結(jié)果表明，B[a]P對(duì)S期和G0/G1期細(xì)胞的影響均呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系，主要影響的是DNA/RNA、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和脂質(zhì)。Gorrochategui等[41]運(yùn)用紅外光譜研究全氟辛酸化合物對(duì)非洲爪蟾A6腎上皮細(xì)胞的毒性效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)全氟及多氟烷基化合物(PFASs)類(lèi)化合物主要影響細(xì)胞DNA/RNA，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和脂肪酸等。

在激素類(lèi)物質(zhì)的毒性研究中，Cakmak等[42]運(yùn)用紅外光譜研究17β-雌二醇對(duì)虹鱒魚(yú)(rainbow trout)肝臟的毒性作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，處理組肝臟組織中糖原和蛋白質(zhì)水平降低，甘油三脂和核酸的含量增加，還發(fā)現(xiàn)肝臟細(xì)胞膜流動(dòng)性下降，膜脂結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；研究者同時(shí)對(duì)比了17β-雌二醇和壬基酚處理組中肝臟組織的光譜差異，證實(shí)二者對(duì)未發(fā)育成熟虹鱒魚(yú)具有類(lèi)似的作用。Johnson等[43]開(kāi)展了17β-雌二醇介導(dǎo)雌激素效應(yīng)的研究，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的E-screen方法和紅外光譜方法檢測(cè)17β-雌二醇的半數(shù)抑制濃度(EC50)分別為2.29 ng·L-1和2.56 ng·L-1，說(shuō)明光譜技術(shù)是一種快速、靈敏的雌激素篩查方法。Duan等[8]運(yùn)用紅外光譜研究了壬基酚(4-NP)對(duì)大鼠睪丸組織和睪丸支持細(xì)胞的毒性效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)4-NP主要影響的光譜振動(dòng)區(qū)域?yàn)轷０?、脂質(zhì)和DNA/RNA，其中處理組多肽聚集水平、酰胺Ⅰ與酰胺Ⅱ的比值，以及磷酸基團(tuán)和碳水化合物的比值出現(xiàn)明顯的下降，說(shuō)明光譜手段可以用于睪丸組織生物分子損傷的研究中。

在農(nóng)藥和殺菌劑類(lèi)物質(zhì)的毒性研究中，Dakhakhni等[44]在2,4-二氯苯酚(2,4-D)的肝毒性研究中，發(fā)現(xiàn)2,4-D能夠顯著降低大鼠肝臟蛋白質(zhì)含量，引起脂質(zhì)碳鏈?zhǔn)杷梢约爸|(zhì)極性改變，證明紅外光譜在細(xì)胞毒性檢測(cè)和毒物介導(dǎo)生物膜和蛋白質(zhì)損傷監(jiān)測(cè)方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)。Strong等[45]運(yùn)用紅外光譜研究多菌靈和氟喹唑?qū)Ψ侵拮窤6細(xì)胞的單一毒性和聯(lián)合毒性，結(jié)果表明，2種化合物單一暴露均會(huì)影響細(xì)胞的蛋白質(zhì)和磷脂分子，并且二者的聯(lián)合暴露還會(huì)對(duì)DNA和碳水化合物產(chǎn)生影響，說(shuō)明紅外光譜是一項(xiàng)研究細(xì)胞水平上環(huán)境濃度殺菌劑毒性效應(yīng)的靈敏度較高的技術(shù)。Xin等[46]運(yùn)用紅外光譜從分子水平揭示三氯生和卡馬西平對(duì)淡水綠藻(Chlorococcumsp.)的毒性效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)三氯生對(duì)淡水綠藻的毒性效應(yīng)遠(yuǎn)大于卡馬西平，三氯生主要通過(guò)抑制綠藻的脂肪酸合成以及引起蛋白質(zhì)聚集從而產(chǎn)生毒性，而卡馬西平主要通過(guò)與磷脂雙分子層相互作用破壞細(xì)胞膜而產(chǎn)生毒性。

3.3 紅外光譜在納米材料毒性研究中的應(yīng)用

在對(duì)納米材料的毒性研究中，Palaniappan和Pramod[47]運(yùn)用紅外光譜研究了納米二氧化鈦(nTiO2)對(duì)斑馬魚(yú)鰓組織的毒性作用，發(fā)現(xiàn)nTiO2暴露會(huì)引起鰓組織中蛋白質(zhì)和脂質(zhì)組成之間的變化，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)nTiO2暴露還會(huì)增加蛋白質(zhì)的α螺旋結(jié)構(gòu)，減少β折疊結(jié)構(gòu)。在碳納米顆粒毒性研究中，結(jié)果表明，光譜信息的變化情況與納米顆粒的濃度之間呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)多壁碳納米管和富勒烯主要影響細(xì)菌的脂質(zhì)、酰胺Ⅱ和DNA，并且碳納米顆粒的毒性大小與其尺寸相關(guān)[48]。Li等[49]也運(yùn)用紅外光譜研究了碳納米顆粒的毒性效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法可以檢測(cè)到μg·L-1級(jí)別的碳納米顆粒對(duì)細(xì)胞的毒性效應(yīng)。Novak等[50]在研究氧化鎢納米纖維對(duì)鼠婦(Porcellioscaber)的毒性時(shí)，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的毒性測(cè)試方法沒(méi)有檢測(cè)到氧化鎢納米纖維的毒性效應(yīng)，而紅外光譜卻檢測(cè)到了脂質(zhì)過(guò)氧化以及DNA結(jié)構(gòu)的變化。Rhiem等[51]研究多壁納米管對(duì)綠藻細(xì)胞的毒性時(shí)發(fā)現(xiàn)，多壁納米管會(huì)影響綠藻細(xì)胞的生物組成。Li等[52]研究銀離子和納米銀對(duì)大腸桿菌的殺菌作用，發(fā)現(xiàn)銀離子和納米銀均會(huì)影響巰基基團(tuán)、蛋白質(zhì)、脂多糖和DNA的振動(dòng)信息，但是二者呈現(xiàn)出不同的動(dòng)力學(xué)特征。

4 展望(Prospects)

隨著光譜技術(shù)的不斷進(jìn)步，紅外光譜在毒理學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。紅外光譜因其具有樣品無(wú)損、非標(biāo)記和樣品前處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，有望成為一種新的毒理學(xué)研究工具。但是，紅外光譜在毒理學(xué)研究中目前處于起步階段，各項(xiàng)基礎(chǔ)性工作還需要進(jìn)一步完善。從儀器平臺(tái)來(lái)說(shuō)，高分辨的紅外光譜和具有成像功能光譜儀的應(yīng)用將豐富生物光譜信息，提高我們對(duì)生物樣本分子層面的認(rèn)識(shí)；從數(shù)據(jù)分析來(lái)說(shuō)，更加準(zhǔn)確和便捷的統(tǒng)計(jì)模型以及模式識(shí)別方法、特征提取手段等的應(yīng)用可以輔助我們進(jìn)一步深入理解生物大分子構(gòu)型構(gòu)象等的變化；從峰值指認(rèn)來(lái)說(shuō)，各個(gè)紅外吸收峰對(duì)應(yīng)的化學(xué)鍵的振動(dòng)信息以及歸屬問(wèn)題的解決，將對(duì)我們的光譜解析與分析給予關(guān)鍵支持，并且使我們對(duì)疾病診斷和毒性機(jī)理的認(rèn)識(shí)更加準(zhǔn)確；除此之外，紅外光譜數(shù)據(jù)庫(kù)的建設(shè)，基于分子構(gòu)型構(gòu)象變化的生物信息數(shù)據(jù)與基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等的結(jié)合將是未來(lái)光譜技術(shù)發(fā)展的一個(gè)重要方向。