定量有害結(jié)局路徑(qAOPs)評(píng)估環(huán)境化學(xué)物質(zhì)毒性的研究進(jìn)展Ⅰ：模型構(gòu)建與應(yīng)用案例

彭穎，張瀚心，張效偉

1. 流域環(huán)境生態(tài)工程研發(fā)中心，北京師范大學(xué)自然科學(xué)高等研究院，珠海 519087 2. 污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，南京 210023 3. 生態(tài)環(huán)境部固體廢物與化學(xué)品管理技術(shù)中心化學(xué)品部，北京100029

全球化學(xué)工業(yè)的快速發(fā)展導(dǎo)致化學(xué)品潛在的環(huán)境和健康風(fēng)險(xiǎn)不斷增加，這對(duì)化學(xué)品的風(fēng)險(xiǎn)管理提出更高要求。據(jù)聯(lián)合國(guó)環(huán)境規(guī)劃署(UN Environment Programme, UNEP)《全球化學(xué)品展望Ⅱ》(GlobalChemicalsOutlookⅡ)的最新數(shù)據(jù)，2017年全球包括藥品在內(nèi)的化學(xué)品銷售額合計(jì)達(dá)到5.68萬(wàn)億美元，預(yù)計(jì)2017—2030年期間銷售額將翻一番，中國(guó)將占全球銷售額的近50%[1]。2018年全球商業(yè)流通中的工業(yè)化學(xué)品約4～6萬(wàn)種[2]，歐洲現(xiàn)有的注冊(cè)商業(yè)化學(xué)物質(zhì)清單下使用的化學(xué)品約有14萬(wàn)種[3]，美國(guó)環(huán)境保護(hù)局(United States Environmental Protection Agency, US EPA)《有毒物質(zhì)控制法清單》[4]上列出的化學(xué)品有8.5萬(wàn)種，我國(guó)《中國(guó)現(xiàn)有化學(xué)物質(zhì)名錄》統(tǒng)計(jì)的現(xiàn)有化學(xué)物質(zhì)約4.5萬(wàn)種[5]。與此同時(shí)，新化學(xué)物質(zhì)數(shù)量逐年遞增，化學(xué)品潛在風(fēng)險(xiǎn)仍然不斷增加。傳統(tǒng)的化學(xué)品毒性測(cè)試如依靠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的體內(nèi)毒性測(cè)試方法周期長(zhǎng)、成本高，已不能滿足現(xiàn)階段化學(xué)品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的需求，亟需更經(jīng)濟(jì)有效、具有物種特異性與基于毒性機(jī)制的毒性測(cè)試方法，如人類體外檢測(cè)方法和其他新興技術(shù)[6]。2007年，美國(guó)國(guó)家研究委員會(huì)(National Research Council, NRC)發(fā)表報(bào)告《21世紀(jì)毒性測(cè)試：愿景與策略》(ToxicityTestinginthe21stCentury:AVisionandaStrategy, TT21C)，概述了21世紀(jì)毒性測(cè)試的未來(lái)方向和發(fā)展戰(zhàn)略，提出將由以動(dòng)物個(gè)體為基礎(chǔ)的毒性測(cè)試體系轉(zhuǎn)為基于人體細(xì)胞為主的體外測(cè)試體系，關(guān)注化學(xué)物質(zhì)與特定分子靶點(diǎn)間相互作用探究化學(xué)品對(duì)生物學(xué)基本過(guò)程影響的“毒性通路”，從而預(yù)測(cè)化學(xué)品對(duì)生物的影響、評(píng)估化學(xué)品的安全[7]。歐盟委員會(huì)科學(xué)委員會(huì)(European Commission Scientific Committee)發(fā)表的指導(dǎo)文件《應(yīng)對(duì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的新挑戰(zhàn)》(AddressingtheNewChallengesforRiskAssessment)，強(qiáng)調(diào)了利用分子和細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程的數(shù)據(jù)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的優(yōu)勢(shì)和挑戰(zhàn)[8]，但還缺乏統(tǒng)一的將分子水平的毒性測(cè)試方法納入到生態(tài)或人類健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的方法[9]。

1 AOP框架概述(Overview of AOP framework)

在上述背景和基礎(chǔ)上，2010年，Ankley等[10]提出了有害結(jié)局路徑(adverse outcome pathway, AOP)的概念框架。一個(gè)AOP代表了化學(xué)物質(zhì)干擾下各種生物水平上的聯(lián)系，化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入生物體內(nèi)，首先和特定靶向分子發(fā)生相互作用，即激活分子啟動(dòng)事件(molecular initiating event, MIE)，進(jìn)而通過(guò)關(guān)鍵事件(key event, KE)等誘導(dǎo)生理變化，最終導(dǎo)致與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估相關(guān)的有害結(jié)局(adverse outcome, AO)。AOP基于化學(xué)品的性質(zhì)，從系統(tǒng)生物學(xué)的角度概括了化學(xué)品所誘導(dǎo)的分子水平響應(yīng)，以及在該分子響應(yīng)水平上細(xì)胞、組織和器官的毒性效應(yīng)，進(jìn)而推導(dǎo)出在個(gè)體、種群上的有害結(jié)局。近10年來(lái)，AOP框架逐漸發(fā)展成熟，被認(rèn)為是將生物信息組織成一種可用于評(píng)估化學(xué)品對(duì)人體健康和生態(tài)環(huán)境生物毒性的新方法，其開(kāi)發(fā)的目的是用于化學(xué)品的評(píng)估和監(jiān)管工作，包括優(yōu)先級(jí)評(píng)估和危害性預(yù)測(cè)，最終實(shí)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估并應(yīng)用于管理決策。

1.1 AOP數(shù)據(jù)庫(kù)(AOP Knowledge Base, AOP-KB)

2012年經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(Organization for Economic Cooperation and Development, OECD)在本身已有的數(shù)據(jù)和準(zhǔn)則的基礎(chǔ)上開(kāi)始發(fā)展AOP項(xiàng)目，用于指導(dǎo)化學(xué)品及其他潛在毒害物質(zhì)的毒性測(cè)試。2014年，AOP數(shù)據(jù)庫(kù)(AOP Knowledge Base, AOP-KB) (https://aopkb.oecd.org/index.html)發(fā)布，該數(shù)據(jù)庫(kù)由OECD、US EPA、歐洲委員會(huì)聯(lián)合研究中心(European Commission’s Joint Research Centre, JRC)、美國(guó)陸軍研究工程師研究和發(fā)展中心(Engineer Research and Development Center, ERDC)共同參與研發(fā)。

AOP-KB包括不同的模塊，是一個(gè)不斷發(fā)展和改進(jìn)的網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)工具，旨在將關(guān)于化學(xué)品如何引起有害結(jié)局的所有知識(shí)集合在一起，為AOP的開(kāi)發(fā)和傳播提供服務(wù)，圖1為AOP的開(kāi)發(fā)的全過(guò)程示意圖(http://www.oecd.org/chemicalsafety/testing/adverse-outcome-pathways-molecular-screening-and-toxicogenomics.htm)。AOP-KB的主要構(gòu)成包括AOP門(mén)戶(AOP potrol, https://aopkb.oecd.org/search.ashx)、AOP維基百科(AOP wiki, https://aopwiki.org/)和圖形界面Effectopedia(https://www.effectopedia.org/)等。另外，AOP Xpolorer、AOP-DB和Intermediate Effects DB等第三方模塊正在開(kāi)發(fā)。截至2020年12月共有367個(gè)AOPs被提交到AOP wiki(其中有36個(gè)處于OECD審查、批準(zhǔn)或認(rèn)可的狀態(tài))。

圖1 有害結(jié)局路徑(adverse outcome pathway, AOP)開(kāi)發(fā)的全過(guò)程示意圖 (http://www.oecd.org/chemicalsafety/testing/adverse-outcome-pathways-molecular-screening-and-toxicogenomics.htm)Fig. 1 Representation of the adverse outcome pathway (AOP) development process (Source from: http://www.oecd.org/chemicalsafety/testing/adverse-outcome-pathways-molecular-screening-and-toxicogenomics.htm)

1.2 定性AOPs與定量AOPs

定性AOPs(qualitative AOPs)系統(tǒng)地構(gòu)建了化學(xué)物質(zhì)與受體、酶或其他生物分子間的相互作用(分子啟動(dòng)事件)到有害結(jié)局的關(guān)鍵事件關(guān)聯(lián)的知識(shí)，從而使其能用于危害評(píng)估[11]。盡管定性AOPs適用于危害評(píng)估，但從固有的描述性AOP中并不能直接推斷出化學(xué)品的潛在風(fēng)險(xiǎn)，難以提供準(zhǔn)確的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。因此，亟需擴(kuò)展AOP框架以預(yù)測(cè)可能在個(gè)體和種群水平上導(dǎo)致有害結(jié)局的化學(xué)劑量或濃度[12-13]。這種擴(kuò)展需要對(duì)分子啟動(dòng)事件、關(guān)鍵事件和有害結(jié)局之間的關(guān)系進(jìn)行詳細(xì)的定量描述[14]。定量AOPs(quantitative AOPs, qAOPs)由一個(gè)或多個(gè)基于生物學(xué)的計(jì)算模型組成，模型描述了分子啟動(dòng)事件與有害結(jié)局之間的關(guān)鍵事件的關(guān)聯(lián)，并提供定量的劑量-響應(yīng)和時(shí)間-響應(yīng)信息，能為毒害污染物的健康和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)管控提供有效的決策依據(jù)[11]。

定性和定量AOPs都可以通過(guò)識(shí)別、構(gòu)建和整合現(xiàn)有的化學(xué)危害證據(jù)，用于風(fēng)險(xiǎn)表征(圖2)。然而風(fēng)險(xiǎn)表征需要?jiǎng)┝?響應(yīng)評(píng)估與暴露評(píng)估相結(jié)合，只有qAOPs能將暴露與導(dǎo)致AOP中起始點(diǎn)(point of departure, POD)所需的化學(xué)物質(zhì)的量聯(lián)系起來(lái)。當(dāng)有足夠的定量信息可描述劑量-響應(yīng)和/或響應(yīng)-響應(yīng)分子發(fā)起的事件之間的關(guān)系、關(guān)鍵事件和有害結(jié)局時(shí)，通過(guò)qAOPs可以確定導(dǎo)致劑量-效應(yīng)評(píng)估中產(chǎn)生有害結(jié)局所需的外部劑量。qAOPs作為一種預(yù)測(cè)計(jì)算模型，通過(guò)了解上游KE的擾動(dòng)程度預(yù)測(cè)下游AO的發(fā)生情況。OECD在開(kāi)發(fā)基于綜合測(cè)試與評(píng)估方法(integrated approaches to testing and assessment, IATA)中使用AOPs的指南中指出，qAOPs可以幫助研究者以KE為目標(biāo)，并為測(cè)試指南的開(kāi)發(fā)或修改選擇適當(dāng)?shù)臏y(cè)定方法來(lái)預(yù)測(cè)AO。因此，qAOPs的發(fā)展對(duì)AOP框架應(yīng)用于化學(xué)品風(fēng)險(xiǎn)管控至關(guān)重要。本文第2節(jié)將重點(diǎn)介紹qAOPs構(gòu)建的基本框架、方法模型、研究案例及應(yīng)用。

圖2 化學(xué)品危害與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的定性與定量有害結(jié)局路徑[11]注：定量的AOPs(qAOPs)是由定性的AOPs發(fā)展而來(lái)的，但對(duì)關(guān)鍵事件(KE)關(guān)系(KERs)有定量的描述符(f(x))； 定性AOPs與qAOPs均可用于危害與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，f(x)代表一個(gè)數(shù)值或者統(tǒng)計(jì)函數(shù)。Fig. 2 Qualitative AOPs and quantitative AOPs (qAOPs) models in chemical hazard and risk assessment [11]Note: quantitative AOPs (qAOPs) are developed from qualitative AOPs but have quantitative descriptors (f(x)) for key event (KE) relationships (KERs); both qualitative AOPs and qAOPs can be used in hazard identification and assessment, in which f(x) may represent a mathematical or statistical function; MIE stands for molecular initiating event.

2 定量AOPs的研究進(jìn)展(Research advance of quantitative AOPs)

21世紀(jì)毒理學(xué)的目標(biāo)是在利用更少的資源(時(shí)間、金錢(qián)和動(dòng)物)的同時(shí)，在更大范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)化學(xué)品風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估。為實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)，關(guān)鍵是要具備準(zhǔn)確預(yù)測(cè)未經(jīng)檢測(cè)化學(xué)品對(duì)生物個(gè)體、或種群水平的潛在危害的能力，可利用來(lái)自計(jì)算模型、體外測(cè)試或具有特定效應(yīng)終點(diǎn)的個(gè)體短期測(cè)試，快速評(píng)估化學(xué)品與生物系統(tǒng)間的相互作用。AOP框架則以一種因果關(guān)聯(lián)的方式將對(duì)化學(xué)物質(zhì)的活性評(píng)估轉(zhuǎn)換成與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估相關(guān)的響應(yīng)。在對(duì)AO進(jìn)行定量預(yù)測(cè)的背景下，qAOPs是這一過(guò)程自然演變的產(chǎn)物，從理論上講，不需要任何長(zhǎng)期的動(dòng)物試驗(yàn)就可以實(shí)現(xiàn)化學(xué)物質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。Perkins等[11]認(rèn)為qAOPs可用于2類主要問(wèn)題：(1)理解和評(píng)估新的、未經(jīng)測(cè)試的化學(xué)品對(duì)特定物種的風(fēng)險(xiǎn)；(2)了解和評(píng)估某一特定(組)化學(xué)品對(duì)未經(jīng)檢驗(yàn)的新物種的風(fēng)險(xiǎn)。

2.1 qAOPs構(gòu)建的基本框架與步驟

目前國(guó)際上尚無(wú)構(gòu)建qAOPs的標(biāo)準(zhǔn)化流程和方法，但歐洲食品安全局(European Food Safety Authority)用于化學(xué)品生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的機(jī)制效應(yīng)模型的評(píng)估框架(transparent and comprehensive ecological modeling documentation, TRACE)為qAOPs建模提供示范和指導(dǎo)，主要包括模型驗(yàn)證、敏感性分析、驗(yàn)證和不確定性分析等主要步驟。在TRACE框架的基礎(chǔ)上，Perkins等[11]提出了qAOPs建模的基本步驟，包括(1)定義問(wèn)題；(2)使用建模方法組裝概念模型，并將其轉(zhuǎn)換為計(jì)算代碼；(3)數(shù)據(jù)裝配和模型參數(shù)化；(4)模型測(cè)試，包括敏感性和不確定性分析；(5)最后利用該模型支持管理決策。

構(gòu)建qAOP模型首先明確其將要解決的問(wèn)題。qAOP模型所需的結(jié)構(gòu)、細(xì)節(jié)程度和可信度在很大程度上取決于需要解決的具體問(wèn)題以及與決策相關(guān)的內(nèi)容[15]，比如將采取何種監(jiān)管行動(dòng)或作出何種決定，或保護(hù)哪些目標(biāo)。因此，開(kāi)發(fā)qAOP模型的第一步是確定研究需要解決的目標(biāo)問(wèn)題是什么，預(yù)估所需的生物學(xué)精確度水平，并評(píng)估是否有足夠多的信息來(lái)進(jìn)行建模。

完整的qAOP模型從數(shù)學(xué)上描述了關(guān)鍵事件之間的聯(lián)系，將MIE激活的劑量-響應(yīng)與KER的響應(yīng)-響應(yīng)動(dòng)力學(xué)以及有害結(jié)局的表現(xiàn)聯(lián)系起來(lái)。qAOP模型的原始結(jié)構(gòu)(MIE、KE與KER等)可以基于科學(xué)證據(jù)從頭構(gòu)建，也可以從AOP數(shù)據(jù)庫(kù)中的定性AOP中獲得，其可提供較為完整的生物學(xué)和毒理學(xué)信息，而不需要額外收集新的數(shù)據(jù)。本綜述中討論的qAOP構(gòu)建案例是基于AOP數(shù)據(jù)庫(kù)開(kāi)發(fā)得到的。

在qAOP模型的開(kāi)發(fā)中，最重要的是保證合適數(shù)據(jù)的可用性，需要MIE、KE和AO的定量數(shù)據(jù)對(duì)KER進(jìn)行建模和參數(shù)化。AOP數(shù)據(jù)庫(kù)、US EPA開(kāi)發(fā)的綜合計(jì)算毒理學(xué)在線資源庫(kù)(aggregated computational toxicology resource, ACToR)等可提供qAOP建模所需要的基本信息[16]。值得注意的是，開(kāi)發(fā)描述多個(gè)KER的高精度模型需要詳細(xì)的濃度/劑量-響應(yīng)和響應(yīng)-響應(yīng)間關(guān)系的數(shù)據(jù)[11]，理想情況下至少需要5組以建立劑量/響應(yīng)-響應(yīng)關(guān)系。若構(gòu)建的目標(biāo)模型的重點(diǎn)是與時(shí)間變化相關(guān)的事件，則用于時(shí)間序列分析的統(tǒng)計(jì)/建模方法至少需要10個(gè)時(shí)間點(diǎn)。若開(kāi)發(fā)非模式物種或?yàn)l危物種的qAOP模型，則需要從模式物種與相關(guān)物種的理論關(guān)系推斷、量化特定目標(biāo)物種的qAOP模型。

模型測(cè)試也是模型構(gòu)建的重要步驟，包括模型的敏感性和不確定性分析。Perkins等[11]指出敏感性分析需要測(cè)試定量模型是否充分描述了MIE、KE和AO之間的關(guān)系，可使用建模以外的其他化學(xué)物質(zhì)或獨(dú)立數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。不確定性分析需要通過(guò)與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，計(jì)算偏差，識(shí)別數(shù)據(jù)的差異，將參數(shù)和結(jié)構(gòu)的不確定性納入預(yù)測(cè)中，判斷置信度是否足夠。

2.2 qAOP模型的構(gòu)建方法

qAOP模型可以為危害和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供從描述性知識(shí)到預(yù)測(cè)有害結(jié)局的橋梁，從描述性AOP到qAOP的變化標(biāo)志著響應(yīng)-響應(yīng)關(guān)系的生物學(xué)或動(dòng)力學(xué)在統(tǒng)計(jì)上的描述，或者在KER中通過(guò)一個(gè)數(shù)學(xué)方程進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。AOP模型可以使用不同層級(jí)的KER參數(shù)規(guī)范，從等級(jí)權(quán)重到具有函數(shù)關(guān)系(包括概率關(guān)系)，再到具體相鄰的關(guān)鍵事件如何交互作用的整個(gè)模型。根據(jù)已有數(shù)據(jù)的可用性以及對(duì)KER機(jī)制的了解程度，可以選擇使用不同的方法構(gòu)建qAOP模型，目前常用的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)模型包括以下幾種[11]。

(1)貝葉斯網(wǎng)絡(luò)模型(Bayesian network models)：構(gòu)建的響應(yīng)-響應(yīng)關(guān)系可以從簡(jiǎn)單的二進(jìn)制關(guān)系(激活與不激活)到多種級(jí)別(效力等級(jí))[17-18]。該模型可用于包含多個(gè)相互作用AOPs的大型網(wǎng)絡(luò)模型的開(kāi)發(fā)，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)中其他KE的狀態(tài)來(lái)預(yù)測(cè)下游公共KE或AO發(fā)生的可能性。

(2)回歸模型(regression models)：是一類用于評(píng)估可測(cè)量的變量之間關(guān)系的統(tǒng)計(jì)模型，在AOP上下游中，用于預(yù)測(cè)的變量可以是特定KE的測(cè)量值，可用來(lái)預(yù)測(cè)下游KE或AO。構(gòu)建回歸模型的數(shù)據(jù)要求來(lái)自于響應(yīng)-響應(yīng)關(guān)系范圍內(nèi)、從同一實(shí)驗(yàn)中收集的至少2個(gè)不同KEA的測(cè)量值[11]。

(3)常微分方程模型(ordinary differential equation models, ODEs)：當(dāng)需要構(gòu)建的qAOPs的關(guān)鍵事件之間的關(guān)系涉及到時(shí)間維度，則可以選擇使用常微分方程模型方法進(jìn)行構(gòu)建。該qAOP模型可以應(yīng)用于生物組織的任何水平，從生物分子相互作用，如類固醇生成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[19-20]，到細(xì)胞動(dòng)力學(xué)，如T細(xì)胞增殖[21]；到種群動(dòng)力學(xué)，如生態(tài)建模[22]。

(4)基于個(gè)體的模型(individual or agent based models, IBMs)：基于個(gè)體的模型可以追蹤個(gè)體隨時(shí)間變化的行為，通過(guò)匯集描述種群的關(guān)鍵統(tǒng)計(jì)指標(biāo)，如生存、繁殖和運(yùn)動(dòng)等[23]，對(duì)象可以是分子、組織中的細(xì)胞和群體中的個(gè)體[11]。

(5)動(dòng)態(tài)能量平衡模型(dynamic energy budget models, DEB)：DEB將生物體視為一個(gè)將能量和質(zhì)量吸收到體內(nèi)的系統(tǒng)，并描述了這些能量和質(zhì)量是如何用于維持或執(zhí)行各種生理功能。DEB模型是基于常微分方程(ODEs)描述隨時(shí)間變化的生長(zhǎng)、繁殖和維持等生理功能，以及環(huán)境壓力的潛在影響[24-25]，它適用于不同生活史的物種。qAOP和DEB模型之間的交互比對(duì)將提高qAOP模型的預(yù)測(cè)能力，并將KE置于一個(gè)框架中，該框架將通過(guò)將其嵌入到IBMs中來(lái)進(jìn)行種群水平效應(yīng)的外推[26]。

(6)種群模型(population models)：種群水平上的危害是化學(xué)物質(zhì)監(jiān)管和決策的最終目標(biāo)。qAOP模型需要納入合適的種群模型，通過(guò)對(duì)個(gè)體生存和繁殖的影響來(lái)評(píng)估個(gè)體表現(xiàn)對(duì)種群動(dòng)態(tài)和結(jié)構(gòu)的影響[27]。種群模型有多種類型，非結(jié)構(gòu)化的有序-微分方程模型如邏輯斯蒂(logistic)種群增長(zhǎng)模型[28]、結(jié)構(gòu)化種群模型如矩陣投影模型[29]和基于個(gè)體的模型[30]。

2.3 qAOPs案例及其應(yīng)用

目前構(gòu)建的qAOPs較少，本文基于AOP數(shù)據(jù)庫(kù)匯總了9種構(gòu)建了定量關(guān)系的AOP(表1)。涉及的AO涵蓋了不同生物水平上的有害效應(yīng)，包括與生物個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育、生殖、皮膚致敏、肝臟損傷、神經(jīng)毒性和腎臟損傷相關(guān)的毒理學(xué)終點(diǎn)。

其中有害結(jié)局與生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估相關(guān)的qAOPs有4條(表1)。研究較為全面的是芳香化酶(aromatase)抑制導(dǎo)致魚(yú)類卵黃蛋白原(vitellogenin, VTG)酶活下降，最終導(dǎo)致魚(yú)類繁殖力下降的AOP(AOP ID: 25)，構(gòu)建的qAOP模型涵蓋了黑頭軟口鰷不同水平的生物效應(yīng)及計(jì)算模型[14]，為未經(jīng)測(cè)試過(guò)的化學(xué)物質(zhì)危害預(yù)測(cè)提供了示范案例[14]，并研究了該qAOP模型在其他魚(yú)類物種如日本青鳉魚(yú)(Oryziaslatipes)、斑馬魚(yú)(Daniorerio)的適用性[31]。芳香化酶抑制的qAOP中的3個(gè)模型分別如下。(1)雌性黑頭軟口鰷的下丘腦-垂體-性腺(hypothalamic-pitutitary-gonada, HPG軸)內(nèi)分泌軸模型：在芳香化酶的抑制作用下，睪酮到17β-estradiol(E2)的轉(zhuǎn)換受到抑制，導(dǎo)致依賴E2的卵黃蛋白的合成減少，該模型通過(guò)測(cè)定芳香化酶活性預(yù)測(cè)血漿中VTG的濃度水平。(2)依賴VTG的卵細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型：描述了血漿中VTG濃度水平與卵細(xì)胞發(fā)育、產(chǎn)卵(繁殖力)之間的關(guān)系。(3)種群模型：應(yīng)用了Miller和Ankley開(kāi)發(fā)的密度相關(guān)的logistic矩陣模型[32]，通過(guò)輸入對(duì)生命率影響的估算值(例如，發(fā)生在特定年齡的繁殖力的變化)、用于構(gòu)建萊斯利(Leslie)投影矩陣的生命周期表和承載力估算值，輸出與密度相關(guān)的種群軌跡。將上述3個(gè)模型耦合在一起，可對(duì)具有芳香化酶抑制作用的化學(xué)品效力(相對(duì)于陽(yáng)性參考物質(zhì))進(jìn)行測(cè)量，并對(duì)指定的暴露場(chǎng)景模擬劑量響應(yīng)和時(shí)間過(guò)程。Wittwehr等[15]基于芳香化酶抑制劑參考物質(zhì)法屈唑(fadrozole)構(gòu)建的qAOP模型(HPG模型部分)，使用毒性當(dāng)量法計(jì)算一種未經(jīng)測(cè)試的化學(xué)物質(zhì)異菌脲(iprodione)的效應(yīng)基準(zhǔn)值，成功預(yù)測(cè)了黑頭軟口鰷暴露于異菌脲時(shí)對(duì)血漿中E2水平的影響。同時(shí)，Conolly等[14]還利用響應(yīng)-響應(yīng)關(guān)系和交互參照(read-across)的方法對(duì)生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)管控相關(guān)的毒性效應(yīng)終點(diǎn)(魚(yú)類種群數(shù)量)進(jìn)行半定量計(jì)算，預(yù)測(cè)出黑頭軟口鰷在該物質(zhì)低于33 μg·L-1濃度下的持續(xù)暴露會(huì)造成20%魚(yú)類種群數(shù)量減少的危害。到目前為止，大約2 000種化學(xué)物質(zhì)在ToxCast的一種核心毒素(NVS ADME hCYP19A1)體外測(cè)試中被評(píng)估為可抑制芳香化酶活性，共有168種化學(xué)物質(zhì)確認(rèn)為具有芳香化酶抑制效力(EC50值范圍為0.3 ng·L-1～16.3μg·L-1)，未來(lái)可進(jìn)一步測(cè)試或驗(yàn)證該芳香化酶抑制的qAOP對(duì)其他芳香化酶抑制劑生態(tài)毒性的預(yù)測(cè)能力，促進(jìn)該qAOP在化學(xué)品的危害篩查方面的實(shí)際應(yīng)用。

在對(duì)典型的二噁英及類二噁英物質(zhì)(dioxins-like compounds, DLCs)通過(guò)AhR激活致毒機(jī)制了解的基礎(chǔ)上，Doering等[33-35]針對(duì)DLCs構(gòu)建了AhR激活(MIE)導(dǎo)致鳥(niǎo)類和魚(yú)類生命早期階段死亡(AO)的qAOP(AOP ID: 21)。并根據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)中DLCs暴露濃度和胚胎死亡率的實(shí)際劑量-響應(yīng)曲線構(gòu)建了MIE與目標(biāo)AO間的定量關(guān)系，還評(píng)估了基于體外AhR活性測(cè)試對(duì)鳥(niǎo)類和魚(yú)類生命早期階段死亡的預(yù)測(cè)能力，qAOP的預(yù)測(cè)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)的胚胎毒性測(cè)試結(jié)果的平均差異為2.2。盡管現(xiàn)有研究表明該qAOP可拓展至不同的生物物種，但該qAOP對(duì)其他潛在的DLCs的危害識(shí)別能力還需要進(jìn)一步研究。

另外2個(gè)最新開(kāi)發(fā)的qAOP分別是光合磷酸化解耦聯(lián)劑(DCP)抑制水生植物浮萍(Lemnaminor)[36]生長(zhǎng)(AOP ID: 245)和納米銀顆粒通過(guò)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)秀麗隱桿線蟲(chóng)的生殖毒性[37](AOP ID: 207)，兩者均使用了貝葉斯網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建MIE、KE與AO之間的定量關(guān)系，但兩者均屬于初步構(gòu)建階段，模型的驗(yàn)證和不確定性分析還需要進(jìn)一步的研究。

與人體健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估相關(guān)的qAOP有5條(表1)。其中皮膚致敏是個(gè)人護(hù)理品安全性評(píng)估的一個(gè)重要毒理學(xué)指標(biāo)。Jaworska等[17]和Pirone等[38]使用貝葉斯網(wǎng)絡(luò)分析方法，通過(guò)整合體外試驗(yàn)和計(jì)算模型的事件測(cè)量值，來(lái)評(píng)估一種化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致皮膚敏化的效力，可用于篩選可能導(dǎo)致皮膚敏化的化學(xué)物質(zhì)。OECD建立的皮膚致敏AOP框架也是首個(gè)成功應(yīng)用于法規(guī)的案例?；谠揂OP框架的直接多肽結(jié)合測(cè)試、抗氧化反應(yīng)轉(zhuǎn)錄元件-核因子E2相關(guān)因子(ARE-Nrf2)熒光素酶檢測(cè)法和人類細(xì)胞系活化測(cè)試被化學(xué)品注冊(cè)、評(píng)估、許可和限制(Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals, REACH)法規(guī)納入認(rèn)可的皮膚致敏檢測(cè)方法范疇。

表1 基于AOP數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建的qAOPs及其應(yīng)用Table 1 Developed qAOPs based on AOP wiki and its application

Burgoon等[39]通過(guò)貝葉斯網(wǎng)絡(luò)方法構(gòu)建了脂肪酸氧化抑制導(dǎo)致脂肪變性的qAOP(AOP ID: 213)，被用來(lái)預(yù)測(cè)化學(xué)混合物的危害。該研究使用了過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptorγ, PPAR-γ)完全激動(dòng)劑(藥物羅格列酮)和部分PPAR-γ激動(dòng)劑、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(PPAR-α)完全激動(dòng)劑全氟類有機(jī)污染物(perfluorooctanoic acid, POFA)為對(duì)象，通過(guò)qAOP預(yù)測(cè)的兩者共同作用導(dǎo)致脂肪變性的概率與羅格列酮對(duì)肥胖患者影響的臨床研究中的結(jié)果一致[40]，也與高脂飲食聯(lián)合羅格列酮喂養(yǎng)小鼠的脂肪變性的結(jié)果一致[41]。該研究為解決化學(xué)混合物的危害評(píng)估提供了很好的示范。AOP貝葉斯網(wǎng)絡(luò)模型能夠?qū)瘜W(xué)混合物通過(guò)相同與不同的MIE而導(dǎo)致的潛在危害進(jìn)行有效的預(yù)測(cè)，可用于化學(xué)品和化學(xué)混合物的危害篩查與化學(xué)物質(zhì)優(yōu)先排序研究。

Zgheib等[42]以簡(jiǎn)化的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的慢性腎臟疾病qAOP(AOP ID: 284)為例，根據(jù)RPTEC/TERT1細(xì)胞暴露于溴酸鉀獲得的體外數(shù)據(jù)，比較了3種構(gòu)建qAOP方法的優(yōu)劣(基于經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)的劑量-反應(yīng)模型、貝葉斯網(wǎng)絡(luò)模型和系統(tǒng)生物學(xué)模型)，建議至少采取2種建模方法同時(shí)進(jìn)行研究，以避開(kāi)qAOP開(kāi)發(fā)過(guò)程中的陷阱。

在已有AOP“谷氨酸激動(dòng)劑與成人大腦中的離子性谷氨酸受體結(jié)合導(dǎo)致興奮性毒性，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡，最終導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶障礙”[43](AOP ID: 48)的基礎(chǔ)上，F(xiàn)oran等[44]通過(guò)一種模塊化組裝的方法簡(jiǎn)單快速地構(gòu)建了用于評(píng)估人暴露于軟骨藻酸后導(dǎo)致的潛在記憶損失的qAOP，該方法要求表征每個(gè)KER間的響應(yīng)-響應(yīng)關(guān)系函數(shù)。相比其他方法，該方法在發(fā)展KE之間的響應(yīng)-響應(yīng)關(guān)系方面需要的時(shí)間和數(shù)據(jù)更少，但模型的不確定性更高，較為適合化學(xué)品危害的初級(jí)篩查階段。

Hassan等[45]在嚙齒類動(dòng)物模型中構(gòu)建了根據(jù)經(jīng)驗(yàn)推導(dǎo)的qAOP。該qAOP以大腦神經(jīng)元皮質(zhì)異位(甲狀腺依賴的神經(jīng)發(fā)育毒性)為AO，通過(guò)試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)對(duì)甲狀腺AOP(AOP ID: 42)中的幾個(gè)KE(甲狀腺過(guò)氧化物酶抑制、甲狀腺素合成障礙、血清和腦甲狀腺素缺陷和子代大腦結(jié)構(gòu)畸形)進(jìn)行定量描述，預(yù)測(cè)了血清中甲狀腺素(thyroxine, T4)的變化，評(píng)估甲狀腺干擾物對(duì)大腦發(fā)育的潛在影響。但是該qAOP目前僅適用于甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體(thyroid peroxidase, TPO)抑制劑的模式化學(xué)物質(zhì)丙基硫氧嘧啶(6-propyl-2-sulfanylidene-1H-pyrimidin-4-one, PTU)，最近用于篩選1 074種體外抑制TPO的外源性藥物，其中超過(guò)300種化學(xué)物質(zhì)在體外被確定為T(mén)PO抑制劑，后期需要進(jìn)一步確定該定量關(guān)系的程度和分析預(yù)測(cè)模型的不確定性，未來(lái)可用于評(píng)估其他潛在甲狀腺抑制劑的危害。

3 總結(jié)與展望(Conclusions and perspectives)

3.1 qAOPs發(fā)展中的問(wèn)題

雖然上述的研究案例展現(xiàn)了qAOPs在化學(xué)物質(zhì)危害預(yù)測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)管理方面的應(yīng)用潛力，如預(yù)測(cè)單一化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致的與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估監(jiān)管有關(guān)的危害、外推至未經(jīng)測(cè)試的化學(xué)物質(zhì)和其他物種、化學(xué)品優(yōu)先排序與篩查等，但是大部分qAOPs的開(kāi)發(fā)處于模型構(gòu)建的初步階段，仍存在一些亟需解決的問(wèn)題。

(1)已構(gòu)建的qAOP模型預(yù)測(cè)能力的可信度亟需提高，需要進(jìn)一步的驗(yàn)證、優(yōu)化與完善，包括加大對(duì)潛在毒害化學(xué)物質(zhì)、本土物種(或?qū)嶋H管理中所關(guān)心的特定物種)的適用性研究、不確定性的定量分析等工作，才能促進(jìn)它們?cè)诨瘜W(xué)物質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與管理決策方面的應(yīng)用。qAOPs對(duì)其他潛在毒害化學(xué)物質(zhì)的預(yù)測(cè)能力的提升，可通過(guò)開(kāi)發(fā)和選擇合適的體外測(cè)試方法測(cè)量生物學(xué)效應(yīng)，為化學(xué)適用性研究提供足夠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。另外可通過(guò)對(duì)模式物種與特定目標(biāo)物種(本土物種或?yàn)l危物種)間特定劑量-效應(yīng)關(guān)系中參數(shù)(如受體的激活與結(jié)合的親和力)的研究，拓展qAOPs對(duì)其他生態(tài)物種的適用性研究[14]。

(2)qAOP模型的完善和新qAOPs的開(kāi)發(fā)受到毒性機(jī)制信息及相關(guān)數(shù)據(jù)嚴(yán)重缺乏的限制。qAOPs的各個(gè)關(guān)鍵要素的識(shí)別與驗(yàn)證，均需要投入大量的時(shí)間、精力等資源才能獲得。其中包括分子水平上的MIE、KE，中間多個(gè)KE間的關(guān)聯(lián)信息，以及個(gè)體或種群水平的AO等信息。針對(duì)這一問(wèn)題，有研究人員建議未來(lái)qAOPs的開(kāi)發(fā)工作可優(yōu)先考慮現(xiàn)階段已有完整信息的定性AOP[14]。

(3)化學(xué)物質(zhì)致毒機(jī)制信息缺乏中，最關(guān)鍵的問(wèn)題是大多數(shù)化學(xué)物質(zhì)的MIE仍然未知，這嚴(yán)重限制了AOPs在化學(xué)物質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的應(yīng)用。解決這一問(wèn)題可通過(guò)組學(xué)方法了解生物學(xué)通路的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)識(shí)別分子水平變化。組學(xué)技術(shù)如轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)能在單個(gè)樣本中評(píng)估數(shù)萬(wàn)個(gè)基因及其產(chǎn)物的反應(yīng)，提供測(cè)得的基因、蛋白質(zhì)和/或代謝物的高含量數(shù)據(jù)集[46]，結(jié)合計(jì)算生物學(xué)的方法將這些數(shù)據(jù)集納入AOPs的分析和應(yīng)用中，能幫助識(shí)別和理解MIE和早期KE[47]。在AOP框架下利用組學(xué)數(shù)據(jù)識(shí)別新的MIE與KE、理解其如何導(dǎo)致AO，并提供定量信息，這將會(huì)極大促進(jìn)qAOPs的發(fā)展。

(4)現(xiàn)有qAOPs尚未考慮到化學(xué)物質(zhì)的暴露過(guò)程，獲得生物體內(nèi)靶位點(diǎn)(target site)的化學(xué)暴露濃度對(duì)于使用qAOP模型準(zhǔn)確預(yù)測(cè)有害效應(yīng)/結(jié)局的程度是至關(guān)重要的[48]。體內(nèi)和體外的毒代動(dòng)力學(xué)的不確定性和差異是重要的參數(shù)，如暴露條件、生物可利用性、吸附、分布、代謝或排泄等，將會(huì)影響通過(guò)外暴露濃度的預(yù)測(cè)危害的結(jié)果[11]。

(5)現(xiàn)有qAOPs的模型構(gòu)建步驟與方法還未形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范。在發(fā)展過(guò)程中使用規(guī)范的建模方法，將模型預(yù)測(cè)的結(jié)果和對(duì)解決化學(xué)品監(jiān)管問(wèn)題的能力進(jìn)行測(cè)試和記錄，能夠有效并及時(shí)了解qAOP模型存在的問(wèn)題，幫助提高預(yù)測(cè)的可靠性。

3.2 未來(lái)展望

AOPs不僅僅是一種能識(shí)別出有毒化學(xué)物質(zhì)的潛在健康風(fēng)險(xiǎn)的工具，也會(huì)為化學(xué)物質(zhì)的健康與環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)管控提供重要支持。除了應(yīng)用于單一化學(xué)物質(zhì)的危害預(yù)測(cè)外，針對(duì)真實(shí)環(huán)境中混合暴露的生態(tài)健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估難題[49-51]，未來(lái)可探索基于qAOPs預(yù)測(cè)化學(xué)混合物暴露導(dǎo)致的生態(tài)危害。隨著qAOPs與AOP網(wǎng)絡(luò)(AOP network)的進(jìn)一步發(fā)展和完善，還可采用基于生物效應(yīng)的測(cè)試方法(effect-based methods, EBMs)[52]與AOP網(wǎng)絡(luò)分析相結(jié)合的方法，評(píng)估環(huán)境混合物暴露導(dǎo)致的生態(tài)危害，如根據(jù)水質(zhì)保護(hù)目標(biāo)確定生物類群、敏感物種(優(yōu)先關(guān)注物種)及可能發(fā)生的有害結(jié)局(毒性類型、毒性終點(diǎn))，然后根據(jù)優(yōu)先關(guān)注的敏感生態(tài)物種的有害結(jié)局，確定關(guān)鍵的目標(biāo)AOP，再選擇相應(yīng)的生物測(cè)試方法，進(jìn)而對(duì)復(fù)合水環(huán)境中的毒害物質(zhì)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)與管理[53]。

將qAOPs拓展到更高層次的生物組織，可促進(jìn)對(duì)環(huán)境影響的實(shí)地評(píng)估和診斷，有助于實(shí)現(xiàn)對(duì)個(gè)體、種群和群落水平危害預(yù)測(cè)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。如結(jié)合環(huán)境DNA(environmental DNA)技術(shù)對(duì)水生態(tài)群落進(jìn)行生物多樣性監(jiān)測(cè)，構(gòu)建生物多樣性-生態(tài)系統(tǒng)模型，從而將有害結(jié)局從化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致個(gè)體效應(yīng)終點(diǎn)(如死亡率、發(fā)育和繁殖)擴(kuò)展到對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)健康評(píng)價(jià)和管理更重要的效應(yīng)終點(diǎn)(生物多樣性和生態(tài)系統(tǒng)功能)。將當(dāng)前AOP框架的概念擴(kuò)展到群落和生態(tài)系統(tǒng)，可促進(jìn)對(duì)化學(xué)物質(zhì)毒作用機(jī)制和非化學(xué)脅迫因子評(píng)估的研究[54]。

盡管目前只有較少的qAOPs應(yīng)用于化學(xué)品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與管理的案例，隨著更多qAOPs的構(gòu)建與進(jìn)一步完善，它在化學(xué)品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估領(lǐng)域上將得到更廣泛的應(yīng)用。建議參考Patlewicz等[47]提出的支持AOP應(yīng)用于化學(xué)品管控的科學(xué)框架，探索利用現(xiàn)有成熟qAOPs應(yīng)用于不同層次的化學(xué)品監(jiān)管。例如將qAOPs應(yīng)用于化學(xué)品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的初級(jí)階段(化學(xué)品分類與優(yōu)先級(jí)評(píng)估)，可獲得更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步優(yōu)化qAOP模型，為未來(lái)AOP的實(shí)際應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)和經(jīng)驗(yàn)。