瞬態(tài)受體電位香草酸1通過抑制p-JNK和p-p38 MAPK信號(hào)通路減輕小鼠腦缺血后血腦屏障損傷及焦慮樣行為的機(jī)制

張震 王梅芳 宋遠(yuǎn)見

1徐州醫(yī)科大學(xué)遺傳學(xué)學(xué)科（江蘇徐州221004）；2徐州市醫(yī)學(xué)遺傳與工程研究中心（江蘇徐州221004）；3常熟市第二人民醫(yī)院麻醉科（江蘇常熟215500）

缺血性腦卒中是一種常見的腦血管病，是造成患者死亡和殘疾的主要原因［1］。缺血性腦卒中發(fā)作后，在梗死核心區(qū)會(huì)造成相應(yīng)的神經(jīng)元及腦血管損傷，進(jìn)而導(dǎo)致腦內(nèi)環(huán)境紊亂，影響相應(yīng)腦區(qū)的功能［2］。卒中后常伴隨著焦慮行為［3］，該行為與杏仁核的損傷關(guān)系密切。如今，焦慮已經(jīng)成為卒中后最主要的神經(jīng)精神病之一，影響著卒中后神經(jīng)功能康復(fù)［4］。而JNK 和p38 MAPK 信號(hào)通路在焦慮樣行為調(diào)控以及腦缺血后細(xì)胞損傷進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用［5-6］。瞬時(shí)受體電位香草酸1（TRPV1），在神經(jīng)元及腦內(nèi)皮細(xì)胞中廣泛表達(dá)。已有研究報(bào)道，TRPV1 在腦缺血后激活并造成神經(jīng)和運(yùn)動(dòng)功能缺陷［7］。抑制TRPV1 還能減輕外傷性腦損傷后的血腦屏障破壞［8］。這表明TRPV1 在缺血性腦損傷以及血腦屏障損傷中起到重要的調(diào)節(jié)作用。腦缺血后TRPV1 是否會(huì)通過調(diào)控JNK 和p38 MAPK 信號(hào)通路影響腦血管通透性并改變焦慮樣行為尚未明確。探明該問題，對于尋找新的藥物靶點(diǎn)和治療腦缺血后的焦慮情緒，減輕血腦屏障損傷具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑Capsazepine（Sigma 公司）、HE 試劑盒（中國碧云天公司）、CD31 抗體（Abcam 公司）、Claudin5 抗體（Invitrogen 公司）、DAPI 染色液（中國碧云天公司）、p-JNK（Santa Cruz 公司）、p-p38 MAPK（CST 公司）、BCA 試劑盒（中國碧云天公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物7 ～8 周齡SPF 級C57BL6/J 雄性小鼠54只，體質(zhì)量22 ～24 g，分為假手術(shù)組（Sham）、缺血再灌注組（I/R）、缺血再灌注+抑制劑組（I/R+CPZ）。小鼠由山東濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（魯）2019 0003。實(shí)驗(yàn)過程中針對所有小鼠實(shí)驗(yàn)操作均遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指導(dǎo)原則，實(shí)驗(yàn)后小鼠均深度麻醉后脫臼處死。

1.3 小鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型制作采用線栓法構(gòu)建MCAO 模型，缺血1 h，再灌注24 h。術(shù)前將小鼠禁食12 h，麻醉小鼠后，沿頸部正中線切開皮膚，分離右側(cè)的頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈。將線栓從頸外動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈，進(jìn)而進(jìn)入大腦中動(dòng)脈。當(dāng)插線栓的過程中遇到輕微阻力時(shí)，立即停止插線栓，待缺血1 h 后，將線栓緩慢退出。

1.4 側(cè)腦室注射在術(shù)前30 min 側(cè)腦室注射TRPV1抑制劑CPZ（7.50 μg/3 μL每只）。以Bregrma點(diǎn)為原點(diǎn)，定位右側(cè)腦室位置（位于Bregrma 點(diǎn)向后0.50 mm，旁開1.00 mm，深2.20 mm），并用記號(hào)筆標(biāo)記，然后用顱骨鉆鉆孔。用微量注射器吸取3 μL CPZ，注射時(shí)間持續(xù)7 min，然后留針10 min后緩慢退針?？p合并消毒皮膚，將小鼠放入保溫箱中飼養(yǎng)。

1.5 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)用小鼠共36 只。實(shí)驗(yàn)前讓小鼠適應(yīng)15 min，使用75%酒精清理迷宮內(nèi)部。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)將小鼠提起放置于中央?yún)^(qū)域，保持其頭朝開放臂。小鼠進(jìn)入開放臂或封閉臂的條件以四只爪子進(jìn)入該臂區(qū)域?yàn)闇?zhǔn)。實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)保持安靜。每次實(shí)驗(yàn)后同樣用酒精擦拭迷宮。實(shí)驗(yàn)過程中使用Anymaze 行為學(xué)分析軟件對小鼠活動(dòng)進(jìn)行記錄。

1.6 HE 染色實(shí)驗(yàn)用小鼠共9 只。小鼠缺血再灌注24 h 后心臟灌流，然后斷頭取腦，使用冰凍切片機(jī)切片，厚度20 μm。樣本用蘇木精染色，然后1%鹽酸酒精分化，返藍(lán)，伊紅染色，常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，于400×視野下觀察。

1.7 免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)所用樣本與HE 染色為同一批樣本。實(shí)驗(yàn)前將腦片室溫放置30 min 復(fù)溫。將山羊血清滴加到腦片上，封閉2 h。棄去血清，將Claudin5 一抗按比例（1∶300）稀釋，覆蓋腦片，4 ℃冰箱過夜。PBS 洗滌5 min，3 次。將二抗按比例（1∶500）稀釋，覆蓋腦片，室溫孵育2 h。棄去二抗，PBS 洗滌5 min，3 次。DAPI 染色液染核10 min，棄去染色液，PBS 洗滌5 min，3 次。封片后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.8 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)用小鼠共9 只。小鼠缺血再灌注24 h 后處死，取小鼠腦組織提取總蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到NC 膜上，置于5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后加入需要檢測蛋白的一抗、二抗，TBST 洗凈，于奧德賽蛋白顯影儀下顯影，進(jìn)行半定量計(jì)算。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法SPSS 21.0分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料之間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抑制TRPV1 能夠減輕小鼠腦缺血后焦慮樣行為為了檢測小鼠腦缺血后的焦慮樣行為，在小鼠腦缺血再灌注7 d 后進(jìn)行高架十字迷宮檢測（圖1）。結(jié)果顯示，與I/R組比較，I/R+CPZ組小鼠在開臂的移動(dòng)距離和停留時(shí)間顯著增加（P＜0.001），表明抑制TRPV1 可減輕小鼠腦缺血再灌注后焦慮樣行為。

圖1 CPZ 減輕造模后小鼠焦慮樣行為Fig.1 CPZ reduces anxiety-like behavior in mice after MCAO

2.2 抑制TRPV1 能夠減輕小鼠腦缺血后病理損傷、組織水腫在小鼠再灌注24 h 后，通過HE 染色觀察小鼠杏仁核腦區(qū)病理損傷狀況（圖2）。HE染色結(jié)果顯示：相較于I/R 組，I/R+CPZ 組胞質(zhì)著色變深，細(xì)胞核固縮減少，表明抑制TRPV1 減輕小鼠腦部病理損傷。

圖2 Capsazepine 減輕小鼠腦病理損傷、組織水腫（×400）Fig.2 CPZ reduces brain pathological damage and tissue edema in mice（×400）

2.3 抑制TRPV1 能夠減輕小鼠腦缺血后杏仁核區(qū)腦血管損傷為了檢測小鼠腦血管損傷情況，在小鼠再灌注24 h后進(jìn)行了免疫熒光染色（圖3）。結(jié)果顯示，與I/R 組比較，I/R+CPZ 組Claudin5 表達(dá)量增加，表明抑制TRPV1 可減輕小鼠腦血管損傷。

圖3 抑制TRPV1 能夠減輕小鼠腦缺血后杏仁核區(qū)腦血管損傷Fig.3 Inhibition of TRPV1 can alleviate cerebral vascular injury in amygdala after cerebral ischemia in mice

2.4 抑制TRPV1降低腦缺血后p-JNK、p38 MAPK水平為了探討TRPV1對JNK和p38 MAPK信號(hào)通路的影響，通過免疫印記檢測了小鼠再灌注24 h后p-JNK、p-p38MAPK的蛋白水平。對條帶進(jìn)行分析后得出了蛋白的相對表達(dá)量（圖4）。結(jié)果表明，與I/R組比較，I/R+CPZ 組小鼠p-JNK、p-p38 MAPK 水平降低（P＜0.05），表明抑制TRPV1 降低了腦缺血后p-JNK、p-p38MAPK蛋白水平。

圖4 CPZ 減少p-JNK、p-p38 MAPK 蛋白水平Fig.4 CPZ reduces p-JNK，p-p38 MAPK protein levels

3 討論

全世界每年有將近1 700 萬人患腦卒中，其中30%～35%患者死亡，剩下的患者也存在運(yùn)動(dòng)以及精神障礙等后遺癥［9］。焦慮和抑郁已經(jīng)成為卒中后兩大主要的精神病，臨床數(shù)據(jù)表明25%的卒中患者都伴隨著焦慮癥狀［10-11］。TRPV1 在缺血性腦卒中后起到病理性作用［7］，但TRPV1 對腦缺血后血腦屏障和焦慮樣行為的作用還未見報(bào)道，因此本研究選擇TRPV1 作為研究靶點(diǎn)，以期能夠探明TRPV1 在缺血性腦卒中后對血腦屏障和焦慮樣行為的作用。

本研究中，高架十字迷宮結(jié)果表明I/R+CPZ 組小鼠較I/R組小鼠在開臂的移動(dòng)距離和停留時(shí)間顯著增加，表明抑制TRPV1能夠減少小鼠腦缺血后焦慮樣行為。在MARSCH等［12］的研究中，TRPV1 敲除鼠表現(xiàn)出更少的焦慮樣行為。SRIVASTAVA［13］研究表明抑制P2X4 受體減輕腦缺血誘導(dǎo)的焦慮樣行為，本研究結(jié)果與其一致。目前認(rèn)為腦杏仁核區(qū)與焦慮樣行為的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，CHEN 等［14］研究表明，杏仁核給藥能減輕外周神經(jīng)損傷后焦慮樣行為的發(fā)展。本研究通過HE 染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，I/R組小鼠杏仁核腦區(qū)細(xì)胞受損現(xiàn)象嚴(yán)重，大量細(xì)胞核呈核固縮形態(tài)。在抑制TRPV1 后，細(xì)胞損傷減少，細(xì)胞核形態(tài)改善。

腦卒中后常見的一個(gè)病理特征是血腦屏障的破壞［15］，而腦血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接蛋白的破壞是腦卒中后血管通透性升高的主要原因［16］。在正常大鼠中，使用激動(dòng)劑激活TRPV1 本身就會(huì)導(dǎo)致血腦屏障的破壞［17］。YANG 等［8］的研究也表明抑制TRPV1 能減輕外傷性腦損傷后的血腦屏障破壞，而本實(shí)驗(yàn)表明，在缺血性腦卒中后，抑制TRPV1 能夠減輕緊密連接蛋白Claudin5 的表達(dá)，表明在腦缺血后，TRPV1 也是血腦屏障破壞的原因之一。

JNK 和p38 MAPK 通路在腦缺血誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷中具有重要的作用，有研究表明鈣離子敏感受體在小鼠腦缺血后通過激活JNK 和p38 MAPK信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡［18］。在LIU 等［19］的研究中也表明，抑制TRPV1 能減少JNK 的激活。TRPV1作為親鈣離子型離子通道蛋白，因此筆者推測TRPV1 可能通過JNK 和p38 MAPK 信號(hào)通路調(diào)控腦缺血損傷。本研究中免疫印跡結(jié)果也已經(jīng)證明抑制TRPV1 能降低p-JNK、p-p38 MAPK 的蛋白水平，表明TRPV1 可能通過JNK 和p38 MAPK 通路調(diào)節(jié)腦缺血后的焦慮樣行為以及血腦屏障損傷。

TRPV1 在缺血性腦卒中的病理作用已有報(bào)道，然而具體的損傷機(jī)制以及在缺血性腦卒中后TRPV1 對焦慮樣行為和血腦屏障的作用還未見報(bào)道。本研究證明了抑制TRPV1 可以降低小鼠腦缺血后p-JNK、p-p38 MAPK 的蛋白水平，減少腦缺血誘導(dǎo)的緊密連接蛋白Claudin5 的破壞，改善小鼠腦缺血誘導(dǎo)的焦慮樣行為。目前對于缺血再灌注損傷的治療方法還比較少，預(yù)缺血處理治療心臟缺血的方法之一，但對腦缺血來說還比較危險(xiǎn)［20］。本研究結(jié)果表明抑制TRPV1 可通過干擾JNK 和p38 MAPK 信號(hào)通路減少腦缺血后焦慮樣行為及血管損傷，為缺血性腦損傷的治療提供了新的靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而TRPV1 屬于離子通道蛋白，最能反映其活性的應(yīng)該是電生理實(shí)驗(yàn)檢測通道周圍膜電勢，本研究還未進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。而且本研究涉及的損傷機(jī)制尚比較淺薄，需要進(jìn)一步研究。