杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥家系致病基因的遺傳學(xué)研究

徐 盈,宋婷婷,鄭 嬌,郭芬芬,黎 昱,張建芳,李 佳,金 鑫,楊 紅

(空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,西安 710032;*通訊作者,E-mail:yanghongfck@163.com)

杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是一種以進(jìn)行性骨骼肌無(wú)力和肌細(xì)胞死亡為特征,肌細(xì)胞被脂肪和結(jié)締組織代替的致死性X連鎖隱性遺傳病[1,2]?；純褐饕R床表現(xiàn)小腿肥大、關(guān)節(jié)攣縮和進(jìn)行性肌無(wú)力,血清肌酸激酶(creatine kinase,CK)明顯升高,患有DMD的男孩可能會(huì)出現(xiàn)不同程度的語(yǔ)言延遲、學(xué)習(xí)障礙和/或認(rèn)知障礙。多數(shù)患兒在7-13歲時(shí)喪失行走能力,且在十幾歲或二十幾歲死于心肺衰竭[3,4]。該病的發(fā)生是由于肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白(dystrophin)的缺乏破壞了肌膜的穩(wěn)定性,導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)發(fā)育延遲[5]。dystrophin在肌肉中起著重要的結(jié)構(gòu)作用,它是連接細(xì)胞外基質(zhì)及肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的橋梁。dystrophin的氨基末端與肌動(dòng)蛋白結(jié)合,而羧基末端與肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白相關(guān)的蛋白復(fù)合物(DAPC)在肌膜外結(jié)合。DAPC包括營(yíng)養(yǎng)不良聚糖、肌糖蛋白、整聯(lián)蛋白和小窩蛋白,這些成分中的任何一種突變都會(huì)導(dǎo)致遺傳性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥[6,7]。盡管治療DMD藥物在一定程度改善患者的生存質(zhì)量,但是至今仍然無(wú)法徹底治愈[8,9]。研究發(fā)現(xiàn)位于Xp21染色體上的抗肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因(dystrophin gene,DMD)突變是導(dǎo)致該疾病發(fā)生的主要原因。據(jù)報(bào)道約60%的患者存在DMD基因的缺失,6%為重復(fù),其余30%為微小突變,包括點(diǎn)突變、小缺失或小插入(see Leiden muscular dystrophy pages at http://www.dmd.nl)[10,11]。由于該病危害大且突變類型較多,明確DMD家系患者的致病基因,對(duì)有再生育需求的家庭進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷是十分重要的。為此,本研究應(yīng)用一代測(cè)序法和肌肉組織mRNA水平測(cè)序方法對(duì)2個(gè)均生育過(guò)DMD患兒的家庭進(jìn)行基因診斷評(píng)估其致病因素,明確受檢者基因型后,對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)胎兒進(jìn)行產(chǎn)前基因分析,以期達(dá)到避免DMD患兒出生的目的。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

采集2例家系的病史資料,包括一般信息、出生史、發(fā)病年齡、家族史、個(gè)人史、母親孕產(chǎn)史等,以上家系均否認(rèn)近親結(jié)婚,否認(rèn)不良接觸史。所有程序均經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào):KY202003044-1),全部檢測(cè)者簽訂知情同意書。

1.2 樣本的采集

1.2.1 外周血采集 用一次性無(wú)菌注射器取受試者靜脈血4 ml,與含有EDTA抗凝紫色收集管內(nèi),4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 羊水樣本 孕婦在簽署知情同意書的情況下,在無(wú)菌消毒條件下,孕婦排空膀胱,平臥位,找好穿刺點(diǎn)及穿刺方向,消毒鋪無(wú)菌洞巾,在超聲診斷儀引導(dǎo)下經(jīng)腹壁行羊膜腔穿刺術(shù),一次性無(wú)菌注射器緩慢抽取羊水10 ml。

1.2.3 胎兒組織樣本 孕婦排空膀胱,平臥位,無(wú)菌消毒條件下,在B超定位下經(jīng)腹部行絨毛活檢術(shù)取絨毛組織,或者肌肉活檢術(shù),使用雙針18號(hào)針進(jìn)行引導(dǎo),第二針20號(hào)針(Modena,PNM0418-1)進(jìn)行胎兒肌肉活檢。穿刺針必須經(jīng)過(guò)肝素處理,以避免組織凝塊,并直接位于胎兒大腿肌肉上方。然后將標(biāo)本迅速放置于液氮中冷凍送回檢測(cè)室,生理鹽水沖洗兩次后,手術(shù)剪刀將標(biāo)本切成小塊,進(jìn)一步進(jìn)行基因分析,按照文獻(xiàn)12報(bào)道的方法[12]。

1.3 Sanger測(cè)序

血液基因組DNA提取采用西安天隆科技有限公司的全自動(dòng)核酸提取儀(NP986-S)，采用分光光度計(jì)和0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 11 min(94 ℃ 1 min，62 ℃ 75 s，72 ℃ 100 s)10個(gè)循環(huán)，每循環(huán)退火溫度降低1 ℃、延伸時(shí)間延長(zhǎng)2 s；降至50 ℃后再進(jìn)行(95 ℃ 1 min，50 ℃ 90 s，72 ℃ 30 s)25個(gè)循環(huán)；65 ℃延伸20 min；4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工有限公司直接測(cè)序，參考序列為NM_004006.2。

1.4 肌肉組織mRNA測(cè)序分析

RNA提取肌肉組織RNA的提取應(yīng)用TianGen RNA提取試劑盒(TianGen,DP419),使用PrimeScriptTM試劑(Takara Dalian,RR036A)將總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,DMD轉(zhuǎn)錄本通過(guò)PCR擴(kuò)增覆蓋整個(gè)編碼區(qū)域,擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工有限公司直接測(cè)序,按照文獻(xiàn)[12]報(bào)道的方法,DMD參考序列為NG-012232.1。

1.5 突變分析

測(cè)序序列應(yīng)用Vector NTI 11.5軟件進(jìn)行分析,通過(guò)與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)、國(guó)際公共數(shù)據(jù)庫(kù)(ClinVar)及在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)(Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM)等公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析判斷其致病性。

1.6 產(chǎn)前基因診斷

選用STRMP、STR44、STR49結(jié)合AMEL四個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行短串聯(lián)重復(fù)序列STR多態(tài)位點(diǎn)連鎖分析,排除母體污染,參照文獻(xiàn)[13]報(bào)道的方法。

1.7 隨訪

每半年通過(guò)電話進(jìn)行隨訪。

2 結(jié)果

2.1 DMD家系可疑致病性突變位點(diǎn)的確定

1號(hào)家庭:孕婦(Ⅱ-3)32歲,孕13周,孕1產(chǎn)0,孕婦本人及丈夫正常,其姐姐(Ⅱ-1)生一男孩為DMD患者(Ⅲ-1),7歲時(shí)夭折,主訴患兒出生20 d左右雙腿無(wú)力,哭聲減弱,伴有先天性心臟病,肌酸激酶檢測(cè)增高,高度懷疑為進(jìn)行性營(yíng)養(yǎng)不良(見圖1A)。1號(hào)家庭由于先證者7歲時(shí)已經(jīng)死亡現(xiàn)在無(wú)法獲得其標(biāo)本,我們采用一代測(cè)序方法對(duì)孕婦本人及姐姐樣本進(jìn)行基因檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)1號(hào)家庭孕婦本人及姐姐在DMD基因均存在c.2717-2721dupTCCTG移碼突變,檢測(cè)結(jié)果在LOVD基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索分析,c.2717-2721dupTCCTG在數(shù)據(jù)庫(kù)中未見報(bào)道,為移碼突變,可能導(dǎo)致mRNA編碼提前終止,可能與Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥發(fā)生密切相關(guān),孕婦本人及姐姐可能為DMD攜帶者(見圖1B),推測(cè)男性患者可能遺傳該突變導(dǎo)致疾病的發(fā)生。

2號(hào)家庭:孕婦(Ⅱ-1)34歲,孕18周,孕2產(chǎn)1,育一子患有DMD,現(xiàn)年11歲,患兒3歲半時(shí)出現(xiàn)走路易摔跤,上樓梯無(wú)力,肌酸激酶檢測(cè)為3 813 U/L(正常值:37-174 U/L,見圖2A)。DMD基因DNA水平上未鑒定出2號(hào)家庭的致病變異,與家屬充分溝通且獲得同意后,采集2號(hào)家庭先證者(Ⅲ-1)的肌肉組織,進(jìn)行全RNA提取,反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,DMD基因mRNA的分段擴(kuò)增,發(fā)現(xiàn)先證者(Ⅲ-1)樣本DMD基因exon38至exon39擴(kuò)增片段較對(duì)照片段大,懷疑這一區(qū)域存在插入變異。進(jìn)一步BLAST分析發(fā)現(xiàn)在外顯子38和39之間插入了66個(gè)核苷酸(r.5448-5449insMW025259:r124-189),該66個(gè)核苷酸來(lái)源于DMD基因的內(nèi)含子38(NG-0122 32.1:g.996205-g.996270)。該插入片段使得外顯子38和39的閱讀框發(fā)生位移,產(chǎn)生了一個(gè)提前終止密碼子(UAA),阻礙了蛋白質(zhì)的正常翻譯(見圖2B,C),該變異通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)檢索尚未報(bào)道,為新發(fā)突變。

圖2 肌肉組織mRNA水平測(cè)序?qū)?號(hào)家庭致病基因的遺傳學(xué)分析結(jié)果Figure 2 Genetic analysis of the disease-causing genes of family 2 by muscle tissue mRNA level sequencing

2.2 DMD陽(yáng)性家族史產(chǎn)前診斷結(jié)局

2例DMD陽(yáng)性家族史的家庭均有再生育需求,分別應(yīng)用一代測(cè)序和通過(guò)DMD基因mRNA的分段擴(kuò)增方法對(duì)2個(gè)家庭進(jìn)行產(chǎn)前診斷,1號(hào)家庭通過(guò)絨毛活檢術(shù)取絨毛組織,發(fā)現(xiàn)該胎兒(Ⅲ-2)為男性且在DMD基因上存在c.2717-2721dupTCCTG的突變(見圖3A),遺傳自母親,推測(cè)胎兒有較高的患病風(fēng)險(xiǎn),1號(hào)家庭選擇終止妊娠,胎兒未出生。2號(hào)家庭孕婦接受充分遺傳咨詢后選擇在B超定位下經(jīng)腹部行胎兒肌肉活檢術(shù),取胎兒(Ⅲ-2)大腿內(nèi)側(cè)肌肉組織進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷,結(jié)果顯示2號(hào)家庭胎兒男性,但DMD基因序列未見異常,胎兒出生后隨訪為健康男嬰,足月出生,體質(zhì)量3.125 kg,復(fù)查血清肌酸激酶水平正常,表型未見明顯異常(見圖3B),至今已1.5周歲,隨訪一切正常。

藍(lán)色線為孕婦峰型，紅色線為胎兒峰型。胎兒為1個(gè)峰來(lái)自母親，說(shuō)明取材樣本沒(méi)有母源污染圖3 2個(gè)家庭產(chǎn)前診斷結(jié)果Figure 3 Results of prenatal diagnosis in two families

3 討論

DMD是破壞性的進(jìn)行性神經(jīng)肌肉疾病,患者多數(shù)為男性,在兒童早期出現(xiàn)近端肌無(wú)力,未經(jīng)治療的男孩在12歲時(shí)就被限制在輪椅上,并在青少年晚期到20歲出頭時(shí)死于心肺并發(fā)癥[1,8]。該疾病主要通過(guò)糖皮質(zhì)激素治療,預(yù)防攣縮,以及心肌病和呼吸損害的醫(yī)療護(hù)理[14]。到目前為止,可供臨床治療的方法非常有限,尚無(wú)有效的治療方法[15]。

基因突變是否會(huì)破壞閱讀框結(jié)構(gòu)決定了患者病情的嚴(yán)重程度,因此明確患者的致病基因,對(duì)于最終診斷,指導(dǎo)適當(dāng)?shù)呐R床治療以及提供進(jìn)一步的產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢至關(guān)重要[6,16]。研究表明DMD基因突變是導(dǎo)致該疾病的主要原因,該基因是已知的最大的人類基因之一,全長(zhǎng)約2.4 Mb,包含79個(gè)外顯子,最常見的致病突變是基因內(nèi)缺失/重復(fù),占60%-65%。剩余的突變是無(wú)義突變、錯(cuò)義突變、剪接位點(diǎn)突變、移碼小的缺失或插入以及產(chǎn)生隱藏外顯子中內(nèi)含子變異[17]。根據(jù)DMD基因突變類型隨之出現(xiàn)多種分子學(xué)檢測(cè)方法包括STR基因連鎖分析、多重連接依賴性探針擴(kuò)增(MLPA)、多重PCR聯(lián)合變性高效液相色譜法(PCR-DHPLC)技術(shù)、二代測(cè)序(NGS)以及Sanger測(cè)序等。Dinh等[18]成功地通過(guò)STR基因連鎖分析方法對(duì)5個(gè)DMD家系進(jìn)行診斷和產(chǎn)前診斷。該方法可以確定具有疾病風(fēng)險(xiǎn)的X染色體的來(lái)源,但很可能會(huì)得出錯(cuò)誤的結(jié)論,而又不知道該孕婦是散發(fā)性還是生殖細(xì)胞鑲嵌突變的DMD攜帶者。Zhang等[19]通過(guò)應(yīng)用多重連接依賴性探針擴(kuò)增(MLPA)和高通量測(cè)序方法(NGS)對(duì)62例患者進(jìn)行診斷。2017年我們通過(guò)變性高效液相色譜(DHPLC)和Sanger測(cè)序?qū)?37例胎兒進(jìn)行了DMD產(chǎn)前診斷,14例胎兒異常,18例為攜帶者[20]。MPLA和PCR-DHPLC方法可以有效地檢測(cè)DMD基因外顯子中的缺失/重復(fù)突變,但無(wú)法在所有外顯子區(qū)域中發(fā)現(xiàn)點(diǎn)突變,需要結(jié)合Sanger測(cè)序。NGS技術(shù)在一次檢測(cè)中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因具有很大的優(yōu)勢(shì)[21,22]。但由于對(duì)臨床實(shí)驗(yàn)室條件的高度要求和極其復(fù)雜的數(shù)據(jù)處理,NGS的應(yīng)用受到了限制。為了快速明確患者的致病突變從而縮短胎兒產(chǎn)前基因診斷的時(shí)間,目前多采用MLPA或者DHPLC方法首先判斷是否存在缺失或者重復(fù),其次考慮小突變,這些方法可以幫助臨床醫(yī)生發(fā)現(xiàn)大多數(shù)患者的致病性突變。在本組研究中由于1號(hào)家庭先證者的生物樣本無(wú)法獲取,我們通過(guò)Sanger測(cè)序方法對(duì)孕婦本人及姐姐進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)孕婦和姐姐的樣本均存在DMD基因c.2717-2721dupTCCTG移碼突變,該突變?cè)跀?shù)據(jù)庫(kù)中未見報(bào)道,為新發(fā)突變。我們主要結(jié)合四點(diǎn)進(jìn)行致病性判斷:①新發(fā)突變?cè)赑ubmed,Clinvar, LOVD等數(shù)據(jù)庫(kù)是否有報(bào)道;②通過(guò)Mutation Taster、SIFT和polyphen2軟件預(yù)測(cè)基因突變效應(yīng);③該突變位點(diǎn)的改變是否影響氨基酸的改變;④在人群中發(fā)生頻率是否極低。在本組研究中DMD基因c.2717-2721dupTCCTG移碼突變?cè)诠矓?shù)據(jù)庫(kù)中尚未報(bào)道,通過(guò)Mutation Taster軟件預(yù)測(cè)可能致病,且在人群中發(fā)生頻率比較低,依據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)指南,該新發(fā)突變?cè)u(píng)級(jí)為致病突變,可能是導(dǎo)致先證者發(fā)病的主要原因,孕婦本人及姐姐為DMD的攜帶者。對(duì)于既往生育過(guò)DMD患兒的婦女或女性攜帶者,其生育DMD男性的風(fēng)險(xiǎn)為25%[23]。因此,對(duì)該孕婦進(jìn)行了絨毛活檢術(shù)取胎兒樣本進(jìn)行DMD基因診斷結(jié)果發(fā)現(xiàn)該男性胎兒絨毛樣本在DMD基因上同樣存在c.2717-2721dupTCCTG的突變,可以推測(cè)胎兒患病風(fēng)險(xiǎn)較高。從以上研究結(jié)果可以看出,盡管在本組研究無(wú)法獲得先證者的生物醫(yī)學(xué)樣本,但通過(guò)明確攜帶者基因型反推先證者可能的基因型對(duì)于快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行DMD產(chǎn)前診斷具有積極的臨床指導(dǎo)意義。

此外,研究發(fā)現(xiàn)大約1%-2%的進(jìn)行性營(yíng)養(yǎng)不良患者主要是由深層內(nèi)含子改變或其他調(diào)節(jié)改變引起的[24-26]。這些突變改變了mRNA的正常處理過(guò)程,因此對(duì)于少數(shù)病例我們應(yīng)該考慮DMD基因mRNA水平的變化。在臨床工作中,我們通過(guò)常規(guī)方法(MPLA,DHPLC和Sanger測(cè)序分析)在2號(hào)先證者樣本中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)可疑的致病性改變。我們先前的研究報(bào)道通過(guò)mRNA分析方法在2例DMD患者的肌肉組織樣本發(fā)現(xiàn)2個(gè)插入異常轉(zhuǎn)錄本[12]。根據(jù)既往經(jīng)驗(yàn)取2號(hào)家庭先證者的肌肉組織進(jìn)行DMD基因mRNA水平的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)先證者DMD基因在外顯子38和39之間插入了66個(gè)核苷酸((r.5448-5449insMW025259:r124-189),該插入序列來(lái)源于DMD基因的內(nèi)含子38(NG-0122 32.1:g.996205-g.996271),產(chǎn)生一個(gè)額外的“外顯子”且提早出現(xiàn)終止密碼子,該插入變異文獻(xiàn)檢索尚未報(bào)道,屬于新發(fā)突變,其在人群中發(fā)生頻率較低,依據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)指南,該新發(fā)突變?cè)u(píng)級(jí)為可能致病突變,結(jié)合臨床表型、家族史以及變異評(píng)估該突變可能是與DMD發(fā)生密切有關(guān)。由于孕有DMD高風(fēng)險(xiǎn)胎兒的孕婦對(duì)進(jìn)行DMD產(chǎn)前診斷具有極其強(qiáng)烈的意愿,我們嘗試通過(guò)胎兒肌肉活檢術(shù)采集男性胎兒大腿內(nèi)側(cè)肌肉組織進(jìn)行了產(chǎn)前基因診斷,結(jié)果顯示該胎兒基因型未見異常,出生后隨訪一切正常,通過(guò)本組研究表明對(duì)于部分病例在DMD基因DNA水平無(wú)法鑒定要突變位點(diǎn),結(jié)合患者臨床表現(xiàn)、生化指標(biāo)、病理指標(biāo)及家族史對(duì)于高度患有為DMD的可考慮mRNA水平變化的分析。

總之,對(duì)于曾經(jīng)生育過(guò)DMD患兒的家系采取針對(duì)性的DMD基因檢測(cè)策略,可快速、準(zhǔn)確地做出判斷,為該疾病的產(chǎn)前診斷提供可能和有效的保證,降低患兒的出生,提高出生人口的質(zhì)量。