環(huán)磷酰胺激活過氧化物酶體增殖物激活受體-γ介導(dǎo)細胞自噬減輕糖尿病腎病小鼠腎損傷的機制

李 燕,李安琪,余曉洋,張文靜,呂 佳,王志剛,張亞莉,陳 蕾

(1西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎臟病醫(yī)院腎臟內(nèi)科,西安 710061;2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸科;3西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液凈化科;*通訊作者,E-mail:chl1221@hotmail.com)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是發(fā)生在糖尿病患者中的腎臟性疾病,也是2型糖尿病患者死亡的主要原因之一。據(jù)統(tǒng)計,大約有40%的2型糖尿病患者最終發(fā)展為DN,并演變?yōu)榻K末期腎臟病,同時還增加了心血管類疾病的發(fā)生率[1,2]。盡管目前已開發(fā)出可控制DN的藥理策略,但仍需全面了解調(diào)節(jié)DN進展的相關(guān)機制,探究更安全有效的方法來延緩DN進程,這也是當前DN研究的重點與熱點內(nèi)容。

環(huán)磷酰胺是一種烷化劑,已廣泛應(yīng)用于治療人類和動物的多種類型癌癥,具有抗炎和免疫抑制作用,并且能夠有效殺死進入循環(huán)周期的細胞[3]。此外,環(huán)磷酰胺對腎病及腎病綜合征具有治療作用,可降低慢性腎小球炎癥患者的BUN、SCr、MMP-2及24 h尿蛋白水平[4],但其在DN中的作用機制尚不明確。過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferators-activated receptors-γ,PPAR-γ)是細胞核激素受體,也屬于核轉(zhuǎn)錄超家族成員之一,在調(diào)節(jié)脂質(zhì)體和葡萄糖穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,并已有研究發(fā)現(xiàn),PPAR-γ能夠抑制肝臟的纖維化[5,6]。本研究通過環(huán)磷酰胺作用于DN小鼠,并使用PPAR-γ抑制劑進行干預(yù),從而探討環(huán)磷酰胺調(diào)控PPAR-γ改善DN小鼠腎損傷的相關(guān)作用機制,以期為DN的診治研究提供實驗依據(jù)與思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SPF級C57小鼠,體質(zhì)量18-23 g,雌雄各半,由醫(yī)院實驗動物中心飼喂,飼養(yǎng)溫度設(shè)置為(23±2)℃,12 h光照/黑暗交替循環(huán),期間自由進食、飲水。本研究獲得醫(yī)院動物倫理委員會批準(批號:2020-0034)。

1.2 藥品、主要材料與試劑

環(huán)磷酰胺注射液購自江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司(批號:07051521),PPAR-γ抑制劑GW9662和鏈脲佐菌素購自美國Sigma公司,24 h尿蛋白(24 h UP)、血糖(BG)、甘油三酯(TRIG)、膽固醇(CHOL)、血肌酐(SCr)以及尿素氮(BUN)檢測試劑盒購自南京建成生物技術(shù)研究所,ROS熒光探針-二氫乙啶(DHE)檢測試劑盒購自北京百奧萊博生物科技公司,HE染色試劑盒和Epon812包埋樹脂試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司,Masson染色試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司,兔源抗體Beclin1、p62、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ與大鼠源抗體PPAR-γ、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR購自英國Abcam公司,抗體GAPDH和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或山羊抗鼠購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司,BCA蛋白檢測試劑盒和增強型ECL發(fā)光液購自上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.3 動物造模

將實驗小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,實驗組小鼠給予高脂高糖飼料喂養(yǎng),對照組小鼠以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng),連續(xù)喂養(yǎng)8周。8周后,所有小鼠禁食不禁水12 h,實驗組小鼠以35 mg/kg的劑量腹腔注射鏈脲佐菌素-檸檬酸鈉混合溶液,對照組小鼠同時注射等量的檸檬酸鈉溶液。在注射3 d后,通過尾靜脈采血檢測小鼠血糖水平,以血糖大于16.7 mmol/L為糖尿病模型制備成功標準。在注射2周后收集小鼠尿液,檢測24 h尿蛋白,蛋白含量大于30 mg/24 h即為陽性,若3次檢測均為陽性時,則判定為DN小鼠模型構(gòu)建成功。

1.4 動物分組與給藥

取造模成功的45只DN小鼠,按照隨機數(shù)字表法分為3組:模型組、環(huán)磷酰胺組、環(huán)磷酰胺+PPAR-γ抑制劑組,每組15只,另取對照組小鼠15只。環(huán)磷酰胺組小鼠以30 mg/kg的劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺(溶解于生理鹽水中),環(huán)磷酰胺+PPAR-γ抑制劑組小鼠以30 mg/kg的劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺,同時按1 mg/kg的劑量腹腔注射PPAR-γ的抑制劑GW9662,對照組和模型組小鼠同時注射等量生理鹽水,連續(xù)10周。10周后處死各組小鼠前測量體質(zhì)量,收集24 h尿液,并采集靜脈血,腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉并通過頸椎脫臼法處死各組小鼠,切取小鼠雙側(cè)腎臟,清洗干凈后稱質(zhì)量,將一部分腎組織置于液氮中冷凍后保存于-80 ℃冰箱,剩余部分固定于4%多聚甲醛溶液中。

1.5 全自動生化儀檢測各項生化相關(guān)指標

末次給藥結(jié)束后,收集采集的各組小鼠24 h尿液和靜脈血,將采集的血液置于室溫下2 h,通過4 ℃低溫離心機以4 000 r/min離心15 min,獲取上清液,進行各項血指標測定。應(yīng)用全自動生化儀檢測各組小鼠24 h尿蛋白(24 h-urinary proteins,24 h UP)、血糖(blood glucose,BG)、甘油三酯(triglyce-ride,TRIG)、膽固醇(cholesterol,CHOL)、血肌酐(serum creatinine,SCr)和尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)的水平,所有檢測步驟嚴格按照試劑盒說明書執(zhí)行。

1.6 HE染色觀察腎組織病理形態(tài)學(xué)

取在4%多聚甲醛固定好的腎組織樣品,進行常規(guī)石蠟包埋處理,切成5 μm的組織切片,進行HE染色。將腎組織石蠟切片經(jīng)過二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后,加入蘇木精染色5 min,在流水下沖洗干凈,加入伊紅染色3 min,再次通過流水沖洗干凈,程序化脫水、透明,自然晾干,中性樹膠封片,通過光學(xué)顯微鏡觀察各組小鼠腎組織病理形態(tài)變化并拍攝圖像。

1.7 Masson染色檢測腎組織纖維化程度

取制備好的腎組織石蠟切片,進行脫蠟脫水處理,加入weigert鐵蘇木素染色10 min,再用1%鹽酸乙醇分化,流水沖洗干凈后,加入Masson染液進行反藍,蒸餾水洗滌干凈,加入麗春紅酸性品紅染色5 min,接著用1%磷鉬酸水進行分化后,加入苯胺藍染色5 min,1%冰醋酸水溶液浸泡洗滌切片,程序化脫水、透明,中性樹膠封片,通過光學(xué)顯微鏡觀察各組小鼠腎組織染色情況并拍攝圖像。

1.8 透射電子顯微鏡觀察腎組織自噬體

取小鼠腎組織樣品,切成大小為1.0 mm3的小方塊,并固定在PBS緩沖液稀釋的3%戊二醛中,4 ℃過夜。接著使用1%鋨酸固定1 h,不同濃度丙酮(50%-90%)進行脫水,Epon812包埋。取包埋塊,光鏡下進行超薄切片,采用醋酸鈾和枸櫞酸鉛進行雙重染色,在Zeiss 910透射電子顯微鏡下觀察腎組織自噬發(fā)生情況并拍攝圖像。

1.9 ROS熒光探針-DHE檢測腎組織ROS含量

取制備好的腎組織包埋塊,在冰凍切片機上切成5 μm厚的切片,將ROS熒光探針DHE滴加于切片上,37 ℃下孵育30 min,通過熒光顯微鏡觀察小鼠腎組織內(nèi)ROS熒光強度并拍攝圖像。在細胞內(nèi)DHE被ROS氧化形成氧化乙啶,產(chǎn)生紅色熒光,利用Image-ProPlus 6.0圖像分析軟件量化熒光強度。

1.10 Western blot檢測腎組織PPAR-γ、自噬及AMPK/mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達

取保存在-80 ℃冰箱中的腎組織,無菌條件下剪碎后加入液氮進行研磨,加入預(yù)冷的RIPA緩沖液進行裂解,提取總蛋白樣品,BCA法檢測蛋白濃度。取等量各組蛋白樣品,10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì),電轉(zhuǎn)移至PVDF膜,室溫下在5%脫脂奶粉中封閉2 h,加入稀釋的一抗抗體Beclin1(1 ∶1 000)、p62(1 ∶1 000)、LC3Ⅰ(1 ∶1 000)、LC3Ⅱ(1 ∶1 000)、PPAR-γ(1 ∶1 000)、AMPK(1 ∶1 000)、p-AMPK(1 ∶1 000)、mTOR(1 ∶1 000)、p-mTOR(1 ∶1 000),4 ℃下共孵育過夜。次日,棄去一抗工作液,TBST洗膜后,加入對應(yīng)的辣根過氧化物酶標記的二抗抗體(1 ∶5 000),室溫下共孵育1 h,TBST再次洗膜后,滴加增強型ECL液顯色曝光,凝膠成像系統(tǒng)拍照,通過Image-ProPlus 6.0圖像分析軟件對各蛋白條帶進行分析,以GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量與腎臟質(zhì)量比較

各組小鼠體質(zhì)量和腎臟質(zhì)量檢測結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組小鼠體質(zhì)量和腎臟質(zhì)量均顯著減少(P<0.05);環(huán)磷酰胺組小鼠的體質(zhì)量和腎臟質(zhì)量較模型組均顯著增加(P<0.05),而與環(huán)磷酰胺組比較,環(huán)磷酰胺+PPAR-γ抑制劑組小鼠的體質(zhì)量和腎臟質(zhì)量均顯著減少(P<0.05,見圖1)。

與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與環(huán)磷酰胺組比較,&P<0.05圖1 各組小鼠體質(zhì)量與腎臟質(zhì)量比較Figure 1 Comparison of body mass and kidney mass of mice in each group

2.2 各組小鼠24 h UP和血生化指標比較

各生化指標檢測結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組小鼠24 h UP水平顯著升高(P<0.05),血清BG、TRIG、CHOL、SCr和BUN水平也顯著升高(P<0.05);而治療10周后,相較于模型組,環(huán)磷酰胺組小鼠24 h UP水平顯著降低(P<0.05),同時,血清BG、TRIG、CHOL、SCr和BUN水平顯著降低(P<0.05);而環(huán)磷酰胺+PPAR-γ抑制劑組小鼠24 h UP水平與血清BG、TRIG、CHOL、SCr及BUN水平較環(huán)磷酰胺組均顯著升高(P<0.05,見表1)。

表1 各組小鼠24 h UP與血生化指標的水平比較

2.3 各組小鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)觀察

HE染色結(jié)果顯示,對照組小鼠腎組織中腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常,未見明顯病變現(xiàn)象;模型組小鼠腎組織內(nèi)腎小管萎縮、壞死,出現(xiàn)空泡樣,腎小球基底膜增厚,系膜區(qū)增多,并伴隨大量的炎性細胞浸潤;環(huán)磷酰胺組小鼠腎小管萎縮、壞死以及腎小球基底膜增厚等現(xiàn)象較模型組明顯減輕,炎性細胞浸潤減少;而環(huán)磷酰胺+PPAR-γ抑制劑組小鼠腎組織病變現(xiàn)象與模型組較一致,未見明顯改善(見圖2)。

圖2 HE染色觀察小鼠腎組織病理形態(tài)學(xué) (×400)Figure 2 Pathological morphology of mouse kidney tissue by HE staining (×400)

2.4 各組小鼠腎組織纖維化程度比較

Masson染色結(jié)果顯示,對照組小鼠腎組織內(nèi)藍染面積少,膠原沉積少,說明腎組織纖維化程度小;與對照組比較,模型組小鼠腎組織內(nèi)藍染面積增多,膠原沉積增加,纖維束增粗,腎組織纖維化明顯;相較于模型組,環(huán)磷酰胺組小鼠組織內(nèi)藍染面積減少,膠原沉積有所下降,腎組織纖維化程度減小;而與環(huán)磷酰胺組比較,環(huán)磷酰胺+PPAR-γ抑制劑組小鼠腎組織藍染面積增多,腎組織纖維化現(xiàn)象較為明顯(見圖3)。

箭頭顯示腎組織內(nèi)明顯的藍染區(qū)域圖3 Masson染色觀察小鼠腎組織纖維化程度 (×400)Figure 3 Observation of the degree of fibrosis in mouse kidney tissue by Masson staining (×400)

2.5 各組小鼠腎組織足細胞自噬情況

通過透射電子顯微鏡觀察到,對照組小鼠腎組織足細胞可見較多的自噬體與凋亡小體,說明正常情況下腎組織足細胞自噬程度較高;模型組小鼠足細胞自噬體與凋亡小體較對照組則明顯減少;而環(huán)磷酰胺組小鼠足細胞自噬體與凋亡小體較模型組明顯增多,說明環(huán)磷酰胺能夠促進足細胞自噬;環(huán)磷酰胺+PPAR-γ抑制劑組小鼠可見少量自噬體,與模型組比較無明顯變化(見圖4)。

黃色三角箭頭所指為自噬體圖4 透射電子顯微鏡觀察腎組織自噬 (×10 000)Figure 4 Observation of autophagy in kidney tissue under transmission electron microscope (×10 000)

2.6 各組小鼠腎組織ROS含量比較

DHE熒光染色檢測結(jié)果顯示,模型組小鼠腎組織經(jīng)DHE熒光染色后,其ROS熒光強度顯著高于對照組(P<0.05);與模型組比較,環(huán)磷酰胺組小鼠腎組織ROS熒光強度則顯著下降(P<0.05);而相較于環(huán)磷酰胺組,環(huán)磷酰胺+PPAR-γ抑制劑組小鼠腎組織ROS熒光強度顯著升高(P<0.05,見圖5)。

圖5 DHE熒光染色檢測小鼠ROS生成 (×400)Figure 5 ROS level in mice by DHE fluorescent staining (×400)

2.7 各組小鼠腎組織PPAR-γ蛋白、自噬相關(guān)蛋白與AMPK/mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達比較

Western blot檢測結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組小鼠腎組織PPAR-γ、Beclin-1蛋白表達與LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均顯著下調(diào),P62蛋白表達顯著上調(diào)(P<0.05);與模型組比較,環(huán)磷酰胺組小鼠腎組織PPAR-γ、Beclin-1蛋白表達與LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均顯著上調(diào),P62蛋白表達顯著下調(diào)(P<0.05);而相較于環(huán)磷酰胺組,環(huán)磷酰胺+PPAR-γ抑制劑組小鼠腎組織PPAR-γ、Beclin-1蛋白表達與LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值則顯著下調(diào),同時,P62蛋白表達顯著上調(diào)(P<0.05,見圖6)。

與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與環(huán)磷酰胺組比較,&P<0.05圖6 Western blot檢測小鼠腎組織PPAR-γ蛋白與自噬相關(guān)蛋白表達Figure 6 Expression of PPAR-γ protein and autophagy-related protein in mouse kidney tissue by Western blot

通過檢測AMPK/mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達發(fā)現(xiàn),模型組小鼠腎組織p-AMPK/AMPK比值較對照組顯著下降,p-mTOR/mTOR比值則顯著升高(P<0.05);與模型組比較,環(huán)磷酰胺組腎組織p-AMPK/AMPK比值顯著升高,p-mTOR/mTOR比值則顯著下降(P<0.05);相較于環(huán)磷酰胺組,環(huán)磷酰胺+PPAR-γ抑制劑組腎組織p-AMPK/AMPK比值較對照組顯著下降,而p-mTOR/mTOR比值顯著升高(P<0.05,見圖7)。

與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與環(huán)磷酰胺組比較,&P<0.05圖7 Western blot檢測小鼠腎組織AMPK/mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達Figure 7 Expression of AMPK/mTOR signaling pathway related protein expression in mouse kidney tissue by Western blot

3 討論

DN是1型和2型糖尿病患者腎小球和腎小管病變引起的一種頻繁且復(fù)雜的長期性微血管并發(fā)癥。DN的主要病理特征是腎小球濾過率降低,腎小球硬化,腎小管間質(zhì)纖維化和腎小管上皮細胞損傷[2]。由于DN具有隱匿性發(fā)作的特點,因此很難在疾病早期進行檢測和診斷。然而,腎臟病變是不可逆的,當出現(xiàn)某些癥狀時最終發(fā)展為腎功能衰竭的幾率很大[7]。因此,探究DN的早期檢測手段和靶向治療方法對于治療或緩解DN腎損傷具有重要意義。本研究通過模擬2型糖尿病腎病的自然病程建模,探究環(huán)磷酰胺減輕DN小鼠腎損傷的作用,進一步明確環(huán)磷酰胺在DN中相關(guān)調(diào)控機制,為研究DN提供一定的實驗依據(jù)。

環(huán)磷酰胺作為一種抑制細胞增殖的烷化劑,常用于治療不同類型的癌癥、器官移植和自身免疫性疾病[8]。環(huán)磷酰胺會觸發(fā)次級淋巴器官的特定腸道菌群,并通過刺激抗腫瘤細胞因子例如干擾素-γ(IFN-γ)和白細胞介素-17(IL-17)的產(chǎn)生來激活抗腫瘤免疫力[9],例如Wong等[10]報道指出,連續(xù)口服環(huán)磷酰胺對卵巢癌、原發(fā)性腹膜癌和輸卵管癌的化療患者均起到了一定的緩解作用,且未發(fā)現(xiàn)明顯的副作用。環(huán)磷酰胺在增殖性腎臟病中應(yīng)用廣泛,且近年來在糖尿病腎病中的作用機制也逐漸被揭示,前期我們的研究[11]表明了環(huán)磷酰胺能夠抑制DN大鼠腎組織中單核細胞趨化因子蛋白-1(MCP-1)與生長因子β1(TGF-β1)表達,從而緩解DN大鼠腎損傷。PPAR-γ可促進脂肪生成,并調(diào)節(jié)脂肪細胞分泌的蛋白質(zhì)和脂肪細胞因子(如瘦素和脂聯(lián)素)的表達,以此來控制脂質(zhì)代謝和脂肪細胞分化,從而降低脂毒性。研究表明,激活PPARγ可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和改善胰島素敏感性來治療糖尿病,并具有治療DN的潛在作用[12,13]。本研究結(jié)果顯示,DN小鼠通過環(huán)磷酰胺治療后,腎損傷現(xiàn)象得到了明顯改善,同時檢測到腎組織內(nèi)PPAR-γ表達提高,而經(jīng)過環(huán)磷酰胺和PPAR-γ抑制劑共同作用的DN小鼠的腎組織損傷未發(fā)生改變,由此推測,環(huán)磷酰胺可能通過激活PPAR-γ發(fā)揮對DN小鼠腎組織的保護作用。

氧化應(yīng)激是DN的重要病理機制,高血糖是在氧化應(yīng)激中促進多余活性氧(ROS)生成的主要危險因素。ROS具有不成對電子或原子的氧衍生分子,包括超氧陰離子、過氧化氫、單線態(tài)氧和一氧化氮自由基等,參與細胞的生長、凋亡、衰老及多種生理病理過程。而過量的ROS會產(chǎn)生毒性作用,導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和MDA形成,破壞機體的氧化平衡狀態(tài)[14]。ROS刺激DN中包括纖連蛋白和Ⅳ型膠原細胞外基質(zhì)蛋白的積累,這將會導(dǎo)致腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化[15]。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)過環(huán)磷酰胺治療DN小鼠后,其腎組織內(nèi)ROS水平異常升高的現(xiàn)象受到了明顯抑制。腎浸潤或內(nèi)源性細胞異常會產(chǎn)生過量ROS,并與生物分子發(fā)生反應(yīng),從而引發(fā)腎損傷和腎功能障礙。因此,清除組織內(nèi)多余的ROS是DN治療的有效方法。

自噬是一種細胞內(nèi)自我修復(fù)機制,能夠消除降解變性的蛋白質(zhì)和受損細胞器,維持細胞穩(wěn)態(tài)。足細胞具有較高的自噬基礎(chǔ)水平,這對于其應(yīng)激適應(yīng)具有至關(guān)重要的作用[16]。糖尿病患者體內(nèi)營養(yǎng)和能量過量會抑制自噬,并使足細胞出現(xiàn)功能障礙和細胞凋亡,進而引起一系列生理病理變化[17]。本研究通過檢測發(fā)現(xiàn),DN小鼠腎組織Beclin-1蛋白表達、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明顯下降,P62蛋白表達則明顯上升,說明自噬通量受損,而經(jīng)過環(huán)磷酰胺治療的DN小鼠腎組織自噬水平得以提高,表現(xiàn)為腎組織Beclin-1蛋白表達與LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上升,P62蛋白表達下降。

AMP激活的蛋白激酶(AMPK)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程。多項研究表明,AMPK/mTOR信號通路與細胞自噬相關(guān)。細胞接受外界刺激時,AMP/ATP水平升高并激活A(yù)MPK,并增強了對其下游蛋白mTOR的抑制作用,而mTOR是介導(dǎo)自噬發(fā)生的關(guān)鍵蛋白,可調(diào)節(jié)相關(guān)途徑進而抑制細胞自噬[18]。本研究結(jié)果表明,經(jīng)過環(huán)磷酰胺治療的DN小鼠腎組織內(nèi)p-AMPK/AMPK比值升高,而p-mTOR/mTOR比值下降,說明環(huán)磷酰胺通過調(diào)控AMPK/mTOR信號通路影響自噬從而發(fā)揮作用。

綜上,本實驗結(jié)果表明了環(huán)磷酰胺通過激活PPAR-γ促進DN小鼠腎組織足細胞發(fā)生自噬,清除過量的ROS,改善腎損傷現(xiàn)象,該作用機制可能與AMPK/mTOR信號通路有關(guān)。然而,長期或過量使用環(huán)磷酰胺也會增加癌變的風險尤其在膀胱癌,因此,如何更好地將環(huán)磷酰胺運用于DN臨床治療中,還需要大規(guī)模較全面的研究證實。