HIF-1α/EphrinA1信號通路在糖尿病因素削弱七氟醚心肌保護中的作用機制

張 佩,賀建東,韓沖芳,楊文曲,鄧 捷

(1山西醫(yī)科大學(xué)麻醉學(xué)院麻醉教研室,太原 030001;2山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院,山西白求恩醫(yī)院麻醉科;*通訊作者,E-mail:597787162@qq.com)

心血管疾病是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一,而糖尿病是其獨立危險因素[1]。七氟醚后處理已被證明能在急性心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia/reperfusion injury,MI/RI)中起到心肌保護作用,然而這種保護作用在糖尿病合并MIRI時被削弱甚至消失。Xie等[2]研究發(fā)現(xiàn):七氟醚后處理對糖尿病大鼠心肌保護作用消失可能與低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)的信號傳導(dǎo)通路受損有關(guān),具體機制有待進一步研究。HIF-1α是心肌細胞監(jiān)測和適應(yīng)缺氧環(huán)境的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。而保持心肌細胞超微結(jié)構(gòu)和線粒體的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被認為是心肌細胞耐受缺氧的主要原因[3]。EphrinA1是HIF-1α下游的調(diào)節(jié)因子之一。Torres等[4]的研究發(fā)現(xiàn):心內(nèi)注射EphrinA1可以通過穩(wěn)定心肌細胞線粒體時空組織來減少心梗面積和心肌細胞的損傷。先前的研究報道了HIF-1α/EphrinA1信號傳導(dǎo)通路在肺缺血再灌注損傷中的保護作用[5],在心肌缺血再灌注損傷中該信號通路研究較少。本文擬探討七氟醚的心肌保護作用在糖尿病合并心肌缺血再灌注損傷大鼠模型中消失是否與糖尿病因素抑制HIF-1α/EphrinA1信號傳導(dǎo)通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選擇

健康成年雄性SD大鼠,體質(zhì)量210-260 g,由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 糖尿病模型和心肌缺血再灌注模型的制備

依據(jù)參考文獻[6]制備2型糖尿病大鼠模型:在做實驗前禁食12 h,在空腹?fàn)顟B(tài)下腹腔注射鏈脲佐菌素50 mg/kg。于72 h后取大鼠尾靜脈血樣測定血糖濃度≥16.7 mmol/L,然后持續(xù)高脂高糖喂養(yǎng)8周。血糖水平持續(xù)升高8周,且出現(xiàn)多飲多食多尿、體質(zhì)量減輕為2型糖尿病模型制備成功。

取糖尿病模型制備成功的60只大鼠,采用隨機數(shù)字表法,將其分為5組(n=12):假手術(shù)組(sham組)、心肌缺血再灌注(myocardial ischemia/reperfusion injury,I/R)組、七氟烷后處理組(SP組)、HIF-1α激活劑DMOG組(DMOG組)、HIF-1α激活劑DMOG加七氟醚后處理組(DMOG+SP組),隨后進行心肌缺血再灌注損傷模型的建立。

依據(jù)參考文獻[7]制備心肌缺血再灌注損傷模型:腹腔注射25%烏拉坦0.4 ml/100 g進行麻醉,待翻正反射消失后,將大鼠四肢固定于手術(shù)臺,連接生物機能實驗系統(tǒng),監(jiān)測大鼠的Ⅱ?qū)?lián)心電圖,頸部前正中切口暴露氣管進行插管,連接小動物呼吸機進行機械通氣。呼吸參數(shù):潮氣量6-8 ml/kg,通氣頻率60次/min,呼吸比1 ∶1,呼吸機進氣口連接氧氣和七氟醚揮發(fā)罐。于胸骨左側(cè)四五肋間(心尖搏動最強處)開胸,暴露心臟,剪開心包膜,于左心耳下3 mm的地方用6-0絲線穿過左冠脈前降支,將自制小管穿過絲線,用止血鉗推壓小管阻塞冠脈造成缺血。造模成功標(biāo)志:結(jié)扎線以下區(qū)域發(fā)白,室壁運動減弱。心電圖示:ST段抬高,T波高聳。缺血30 min后,松開結(jié)扎線缺血區(qū)變得紅潤,室壁運動逐漸加強,ST段下降明顯,為再灌注成功。sham組只穿線不結(jié)扎,SP組和DMOG+SP組參考文獻[2]在再灌注的前5 min吸入2.5%的七氟醚持續(xù)15 min,DMOG組和DMOG+SP組參考文獻[8]在手術(shù)前24 h腹腔注射DMOG 40 mg/kg。

1.3 實驗方法

于再灌注120 min時,取下心肌組織,采取抽簽法每組抽取4只大鼠心肌標(biāo)本,采用TTC染色法測定心肌梗死面積;剩余8只大鼠取結(jié)扎線以下的心肌組織分為兩部分:一部分制成石蠟切片用于HE染色觀察心肌病理學(xué)損傷和免疫熒光共定位觀察HIF-1α和EphrinA1的位置關(guān)系,一部分采用Western blot法測量心肌組織中HIF-1α和EphrinA1的蛋白含量。

1.3.1 TTC染色測量心肌梗死面積 于再灌注120 min時,取下心肌組織,用冷PBS緩沖液漂洗干凈血漬,置于-20 ℃冰箱中冰凍30 min。在結(jié)扎線以下到心尖部的位置將心臟水平切成5-6片,放入六孔板中。注入1%TTC染液,37 ℃避光孵育30 min,然后將標(biāo)本浸泡于4%多聚甲醛中固定72 h,拍照并用Image-pro plus計算各部分的面積,梗死范圍以梗死面積占左心室面積的百分比表示。

1.3.2 HE染色觀察心肌病理學(xué)損傷 于再灌注120 min時,取下心肌組織于4%多聚甲醛中固定24 h,經(jīng)過酒精脫水,二甲苯透化,石蠟浸蠟包埋,制成石蠟切片。切片機連續(xù)切片,用二甲苯和無水乙醇依次脫蠟水化,蘇木精和伊紅染色,中性樹脂封片。在光學(xué)顯微鏡下,觀察心肌細胞病理學(xué)結(jié)果并拍照。

1.3.3 免疫熒光共定位觀察HIF-1α和EphrinA1的位置關(guān)系 另取部分石蠟切片,常規(guī)脫蠟水化,將切片置于EDTA抗原修復(fù)液中,在微波爐上進行抗原修復(fù)。然后用山羊血清封閉液進行封閉。滴加HIF-1α和EphrinA1兩個特異性一抗,4 ℃孵育過夜。沖洗再滴加DyLight 594熒光素標(biāo)記羊抗小鼠和DyLight 488熒光素標(biāo)記羊抗兔IgG混合二抗,37 ℃孵育45 min。滴加DAPI染色液,室溫孵育3 min。封片。熒光顯微鏡觀察結(jié)果及拍照。

1.3.4 Western blot法測量HIF-1α和EphrinA1的蛋白含量 取左心室前壁缺血區(qū)組織,常規(guī)提取心肌組織蛋白,BCA法測量蛋白濃度。加入5×SDS上樣緩沖液煮沸10 min。以10%分離膠和5%濃縮膠電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)移到PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,加入一抗,4 ℃過夜后將膜取出,用TBST洗3遍,每次10 min。加入二抗,室溫下孵育2 h,然后用TBST洗3遍,每次10 min。用化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒孵育,曝光,顯影,定影。掃描測定條灰度值,以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值反映其表達水平。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心肌梗死面積比較

與sham組相比,其他組大鼠心肌梗死面積均有不同程度的擴大(P<0.05);與I/R組相比,DMOG組和DMOG+SP組心肌梗死面積縮小(P<0.05),SP組無明顯差異(P>0.05);與DMOG組相比,DMOG+SP組心肌梗死面積進一步縮小(P<0.05,見圖1)。

與sham組比,*P<0.05;與I/R組相比,#P<0.05;與DMOG組相比,△P<0.05圖1 各組心肌梗死面積百分比Figure 1 Percentage of myocardial infarction area in each group

2.2 心肌HE染色結(jié)果

sham組心肌組織結(jié)構(gòu)完整,肌節(jié)排列整齊,細胞質(zhì)染色均勻,細胞核完整(見圖2)。其余四組均有不同程度的損傷:I/R組和SP組損傷較為嚴(yán)重,心肌纖維結(jié)構(gòu)疏松紊亂,細胞質(zhì)顏色變淺,心肌細胞水腫;DMOG組和DMOG+SP組損傷較I/R組和SP組輕,其中DMOG+SP組損傷最小(見圖2)。

圖2 各組心肌組織病理學(xué)染色 (HE,×400)Figure 2 Histopathological staining of myocardium in each group (HE,×400)

2.3 HIF-1α和EphrinA1的免疫熒光共定位結(jié)果

HIF-1α和EphrinA1均定位于細胞質(zhì)上(見圖3)。HIF-1α被染成綠色,EphrinA1被染成紅色,細胞核被染成藍色。HIF-1α和EphrinA1重疊的區(qū)域被染成橘紅色,根據(jù)橘紅色熒光可認為HIF-1α和EphrinA1在細胞質(zhì)中存在共定位,二者之間可能發(fā)生相互作用(見圖3)。

圖3 HIF-1α和EphrinA1的免疫熒光共定位結(jié)果Figure 3 Immunofluorescence co-localization of HIF-1α and EphrinA1

2.4 心肌細胞HIF-1α,EphrinA1表達量的結(jié)果

與sham組相比,I/R組、SP組和DMOG組HIF-1α,EphrinA1表達量減少(P<0.05);DMOG+SP組EphrinA1表達量減少(P<0.05),HIF-1α表達量接近sham組(見圖4)。與I/R組相比,DMOG組和DMOG+SP組HIF-1α和EphrinA1表達量增多(P<0.05,見圖4)。與DMOG組相比,DMOG+SP組HIF-1α,EphrinA1表達量進一步增加(P<0.05,見圖4)。與I/R組相比,SP組上述指標(biāo)沒有顯著差異(P>0.05,見圖4)。

與sham組比,*P<0.05;與I/R組相比,#P<0.05;與DMOG組相比,△P<0.05圖4 Western blot法檢測HIF-1α和EphrinA1在心肌組織中的表達Figure 4 Expression of HIF-1α and EphrinA1 in myocardial tissue by Western blot

3 討論

腹腔注射鏈脲佐菌素可以破壞部分胰島β細胞,造成胰島素來源減少;高能量物質(zhì)喂養(yǎng)可造成胰島素利用率下降。以上兩種措施聯(lián)合可有效模擬2型糖尿病模型的病理生理過程,是經(jīng)典的制備2型糖尿病模型的方法[6]。大鼠出現(xiàn)隨機血糖水平≥16.7 mmol/L,飲食、飲水、尿量增多,毛發(fā)干枯發(fā)黃,消瘦狀態(tài),提示造模制備成功。結(jié)扎心臟左冠脈前降支30 min,再灌注120 min是實驗中廣泛應(yīng)用的制備急性MI/RI模型的方法[7]。本研究結(jié)果顯示:與sham組相比,I/R組心肌結(jié)構(gòu)紊亂,病理學(xué)損傷加重,心肌梗死面積增大,提示MI/RI模型制備成功。

HIF-1α是缺血缺氧環(huán)境中重要的信號傳遞分子[9],其通過調(diào)控下游的1 000多種調(diào)節(jié)因子的表達,來維持細胞內(nèi)氧的供需平衡和葡萄糖代謝的正常運轉(zhuǎn),尤其是可以調(diào)控心肌細胞、心肌纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞中相關(guān)因子的表達[10]。Yang等[11]的研究發(fā)現(xiàn):在健康大鼠MI/RI時,HIF-1α可以減少線粒體自由基的產(chǎn)生,保持線粒體酶的活性,維持線粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整性來減少心肌損傷,七氟醚通過上調(diào)HIF-1α的表達發(fā)揮心臟保護作用,然而這一現(xiàn)象在合并糖尿病時消失。本實驗結(jié)果顯示:與I/R組比較,SP組HIF-1α、心肌梗死面積、心肌病理損傷無顯著差異(P<0.05),提示糖尿病因素使七氟醚上調(diào)HIF-1α表達的能力消失,同時七氟醚的心肌保護作用消失,與其結(jié)果一致。

EphrinA1是HIF-1α下游的調(diào)節(jié)因子之一。當(dāng)心肌細胞缺氧時會激活HIF-1α,其通過嵌合到缺氧反應(yīng)原件(hypoxia response elements,HRE)的核心DNA序列上就會激活下游的EphrinA1基因的轉(zhuǎn)錄,從而使EphrinA1蛋白表達增加。EphrinA1是一種心肌細胞中表達的膜結(jié)合受體絡(luò)氨酸激酶配體[6],其可通過控制α-微管蛋白的磷酸化來保護心肌細胞的骨架結(jié)構(gòu)和線粒體的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),從而減少了心肌梗死面積,炎癥反應(yīng)和細胞凋亡指數(shù)[12]。DuSablon等[13]的研究發(fā)現(xiàn):HIF1α/EphrinA1信號通路在MI/RI中通過減少各種有毒物質(zhì)的產(chǎn)生,增加糖酵解維持能量供應(yīng),保持組織結(jié)構(gòu)的完整性,促進胞漿內(nèi)各種物質(zhì)轉(zhuǎn)運分子的轉(zhuǎn)運,穩(wěn)定線粒體功能,改善缺血期心肌細胞的生存和代謝效率,從而減少心臟的損傷[6]。

本實驗結(jié)果顯示:在免疫熒光共定位中,HIF-1α與EphrinA1主要分布于細胞質(zhì)中且兩者存在重疊部分;在Western blot中,與I/R組相比,DMOG組HIF-1α蛋白表達量增加(P<0.05),EphrinA1蛋白表達量也出現(xiàn)了相應(yīng)的增加(P<0.05)。說明HIF-1α與EphrinA1可能存在相互作用,且HIF-1α可能對EphrinA1蛋白起正向調(diào)控作用。在糖尿病合并MI/RI時,HIF-1α和EphrinA1蛋白含量在不同組間差異表達(P<0.05);I/R組與SP組比較,HIF-1α和EphrinA1蛋白含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);提示HIF-1α/EphrinA1信號傳導(dǎo)通路可能參與糖尿病大鼠MI/RI的過程,但是糖尿病因素使七氟醚未能激活該保護通路,不能發(fā)揮心臟保護作用。

DMOG是特異性HIF-1α激活劑。在氧氣正常情況下,脯氨酸羥化酶會使HIF-1α蛋白上的脯氨酸殘基羥基化,同時HIF-1α的N端的氧依賴降解結(jié)構(gòu)域與pVHL蛋白結(jié)合,招募多種泛素蛋白,共同組成泛素連接蛋白酶復(fù)合體,作用于HIF-1α使其降解。而DMOG是一種脯氨酸羥化酶抑制劑,通過抑制HIF-1α的降解來增強HIF-1α的含量和活性。本研究中DMOG的給藥方法參照Warbrick等[8]的實驗給藥劑量和給藥時間點。Zhang等[14]的研究發(fā)現(xiàn):糖尿病因素使七氟醚上調(diào)HIF-1α表達的作用減弱,通過增強HIF-1α的表達,可恢復(fù)七氟醚的心肌保護作用,具體機制尚不清楚。本實驗結(jié)果顯示:與I/R組比較,SP組HIF-1α、EphrinA1、心肌梗死面積、心肌病理損傷無顯著差異(P<0.05),提示糖尿病因素使七氟醚的心肌保護作用消失,與其結(jié)果一致。在加入DMOG后,與I/R組和SP組相比,DMOG組和DMOG+SP組HIF-1α、EphrinA1表達量均升高,心肌梗死面積減少,心肌病理損傷程度減輕。且DMOG+SP組受損程度小于DMOG組(P<0.05),說明七氟醚的保護作用有所恢復(fù)。提示:在糖尿病合并MI/RI中,七氟醚的心肌保護作用消失可能與糖尿病因素抑制HIF-1α/EphrinA1信號傳導(dǎo)通路有關(guān)。

本實驗不足之處:本實驗未設(shè)置抑制劑組或基因敲除作對照,后期實驗應(yīng)進一步研究,以更好的驗證本實驗結(jié)果。

綜上所述,七氟醚的心臟保護作用消失可能與糖尿病因素抑制HIF-1α/EphrinA1信號保護通路有關(guān)。