miR-4778-3p在胃癌組織中的表達及對胃癌MGC803細胞增殖的影響

吳 菁,蔣志勇,李奎生,劉 芳,呂志武,黃明沂,肖 瑤

(1深圳市寶安區(qū)福永人民醫(yī)院消化內(nèi)科,深圳 518103;2武漢大學中南醫(yī)院影像科;3南方醫(yī)科大學附屬深圳寶安醫(yī)院消化內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:drjinjie@126.com)

胃癌是人類消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,發(fā)病率不斷上升[1]。很多胃癌患者在首次確診時已位于晚期,失去手術(shù)治療機會,5年生存率很低[2]。探求胃癌的發(fā)病機制及新的治療策略是目前胃癌研究領(lǐng)域的熱點。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼RNA,在真核細胞中高度保守[3]。miRNA可通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵基因表達,影響細胞的分化、增殖和發(fā)育[4]。據(jù)報道,胃癌組織中存在多個miRNA異常表達,其在胃癌的發(fā)生和發(fā)展過程發(fā)揮重要作用[5,6]。Zhang等[7]研究發(fā)現(xiàn),miR-4778-3p在復發(fā)或轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者組織中呈低表達,抑制宮頸癌細胞的惡性生物學行為。miR-4778-3p在胃癌組織中的表達及對胃癌細胞增殖的影響尚不清楚。本研究旨在檢測miR-4778-3p在胃癌組織中的表達,通過體外實驗探討miR-4778-3p對胃癌細胞增殖和細胞周期的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 組織標本

選取2018年7月至2020年12月間本院胃腸外科行手術(shù)切除的38例胃癌組織及癌旁組織(距腫瘤邊緣>5 cm)。男性25例,女性13例,年齡51.76±8.96歲。病灶直徑<5 cm 12例,病灶直徑≥5 cm 26例。Ⅰ期4例,Ⅱ期6例,Ⅲ期28例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例。所有患者術(shù)前均未接受放療或化療。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準,所有患者均簽署知情同意書。

1.2 細胞株與主要試劑

胃癌MGC803細胞購于中國科學院上海生科院細胞資源中心,收集對數(shù)生長期細胞用于實驗;miR-4778-3p mimic、miR-NC、SMC4-Wt野生型質(zhì)粒、SMC4-Mut突變型質(zhì)粒均購于廣州銳博生物科技有限公司;Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購于美國Invitrogen公司;胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購于美國Gibco公司;雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于美國Promega公司;qRT-PCR試劑盒購于日本TaKaRa公司;引物購自武漢擎科生物技術(shù)公司;BCA蛋白濃度檢測試劑盒和細胞周期檢測試劑盒購于南京凱基生物科技有限公司;CCK-8試劑盒購于武漢碧云天生物科技有限公司;一抗GAPDH、SMC4、TGFBR3和p-Smad3購于美國Affinity公司;辣根過氧化物酶標記的二抗購于武漢博士德生物科技公司。

1.3 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

MGC803細胞復蘇后在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2、飽和濕度。將對數(shù)生長期的MGC803細胞接種至24孔板,分別轉(zhuǎn)染miR-NC(control組)和miR-4778-3p mimic(miR-4778-3p組),根據(jù)Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行操作。

1.4 qRT-PCR檢測miR-4778-3p和染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白4(chromosome structure maintenance protein 4,SMC4)mRNA相對表達量

利用TRIzol提取樣本總RNA,通過逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA,根據(jù)qRT-PCR試劑盒說明書擴增檢測。以U6為內(nèi)參計算miR-4778-3p的相對表達,以GAPDH作為內(nèi)參計算SMC4 mRNA的相對表達。miR-4778-3p上游引物:5′-ACTCTGCAAAGGAAGAAGA-3′,下游引物:5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′;U6上游引物:5′-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3′,下游引物:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;GAPDH上游引物:5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,下游引物:5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′;SMC4上游引物:5′-CGCCTCCAGCAATGACCAAT-3′,下游引物:5′-CCCCAGCATAGGATTTGAAGTT-3′。根據(jù)2-ΔΔCt方法計算miR-4778-3p和SMC4 mRNA相對表達量。

1.5 CCK-8法檢測MGC803細胞增殖能力

將“1.3”分control組和miR-4778-3p組MGC803細胞按照每孔1 000個細胞接種于96孔板,培養(yǎng)1,2,3,4,5 d后,根據(jù)CCK-8試劑盒說明書進行操作,使用酶標儀讀取每孔在波長490 nm處吸光度(A)值,繪制MGC803細胞生長曲線。

1.6 流式細胞術(shù)檢測MGC803細胞周期變化

收集“1.3”分control組和miR-4778-3p組MGC803細胞,離心后采用預冷的PBS溶液洗3次細胞,加入預冷的乙醇溶液(體積分數(shù)70%),在4 ℃下固定過夜。加入溴化乙錠(PI)和RNA酶(RNase A),在4 ℃下避光孵育20 min,使用流式細胞儀檢測、分析各組細胞周期變化。

1.7 雙熒光素酶報告基因檢測

運用miRecords和miRGator數(shù)據(jù)庫預測miR-4778-3p的靶基因可能是SMC4。運用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析SMC4基因在胃癌組織和正常胃組織中的表達差異。分別將所構(gòu)建的SMC4-Wt野生型質(zhì)粒、SMC4-Mut突變型質(zhì)粒以及miR-4778-3p mimic或miR-NC共轉(zhuǎn)染MGC803細胞。轉(zhuǎn)染48 h后分別測定螢火蟲熒光素酶值(F值)和海腎熒光素酶值(R值),R/F比值代表相對熒光素酶活性。

1.8 Western blot檢測SMC4蛋白和TGF-β/Smad信號通路表達

收集control組和miR-4778-3p組MGC803細胞,加入RIPA裂解液在冰上充分裂解。BCA蛋白測定試劑盒檢測各組蛋白濃度后,加入蛋白緩沖液制備蛋白樣本,經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠凝膠電泳、PVDF膜轉(zhuǎn)膜后,在脫脂牛奶封閉2 h,在一抗SMC4(濃度1 ∶2 000)、TGFBR3(濃度1 ∶2 000)、p-Smad3(濃度1 ∶2 000)、GAPDH(濃度1 ∶1 000)中孵育過夜。在辣根過氧化物酶標記的二抗(濃度1 ∶10 000)孵育1 h。使用ECL顯影劑進行顯影、拍照。

1.9 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織中miR-4778-3p的表達水平

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,miR-4778-3p在38例胃癌組織和癌旁組織中的表達分別為2.03±0.65和6.85±0.62。與癌旁組織相比,miR-4778-3p在胃癌組織中的表達水平顯著降低(t=34.51,P<0.01)。

2.2 miR-4778-3p瞬時轉(zhuǎn)染效率

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,control組和miR-4778-3p組MGC803細胞中miR-4778-3p表達分別為0.99±0.07和14.26±0.56,miR-4778-3p組miR-4778-3p表達量是control組的14.40倍,差異有統(tǒng)計學意義(t=23.67,P<0.01),提示miR-4778-3p序列轉(zhuǎn)染成功。

2.3 miR-4778-3p對MGC803細胞增殖能力的影響

CCK-8法結(jié)果顯示,miR-4778-3p組MGC803細胞在第2,3,4,5天的吸光度A值明顯低于control組(均P<0.05,見圖1),表明上調(diào)miR-4778-3p能夠顯著抑制胃癌MGC803細胞的增殖能力。

與control組相比,*P<0.05,**P<0.01圖1 miR-4778-3p對MGC803細胞增殖能力的影響Figure 1 Effect of miR-4778-3p on the proliferation of MGC803 cells

2.4 miR-4778-3p對MGC803細胞周期的影響

流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,與control組相比,miR-4778-3p組G0-G1期細胞增多(P<0.01),S期細胞降低(P<0.01,見圖2)。miR-4778-3p能夠阻遏MGC803細胞在G0-G1期。

圖2 流式細胞術(shù)檢測miR-4778-3p對MGC803細胞周期的影響Figure 2 The effect of miR-4778-3p on the cell cycle of MGC803

2.5 miR-4778-3p靶向結(jié)合SMC4的靶向關(guān)系

miRecords和miRGator數(shù)據(jù)庫預測miR-4778-3p可能的靶基因是SMC4(見圖3)。GEPIA數(shù)據(jù)庫分析顯示,SMC4基因在胃癌組織中的表達明顯高于正常胃組織(P<0.01,見圖4)。雙熒光素酶活性實驗結(jié)果顯示,與miR-NC組相比,miR-4778-3p組熒光素酶活性降低,差異有統(tǒng)計學意義(t=7.93,P<0.01,見圖5),表明SMC4-3′-UTR存在miR-4778-3p結(jié)合位點。

圖3 SMC4-3′-UTR與miR-4778-3p的結(jié)合位點Figure 3 The binding site of SMC4-3′-UTR and miR-4778-3p

與正常組織相比,**P<0.01圖4 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析SMC4在胃癌組織和正常組織中的表達Figure 4 The expression of SMC4 in gastric cancer tissues and normal tissues based on GEPIA database

與miR-NC組相比,**P<0.01圖5 雙熒光素酶活性實驗驗證SMC4-3′-UTR與miR-4778-3p的結(jié)合Figure 5 Dual luciferase activity experiment verified the binding of SMC4-3′-UTR and miR-4778-3p

2.6 上調(diào)miR-4778-3p對MGC803細胞SMC4 mRNA表達的影響

qRT-PCR檢測顯示,control組和miR-4778-3p組MGC803細胞中SMC4 mRNA表達量分別為1.00±0.14和0.22±0.06,差異有統(tǒng)計學意義(t=5.03,P<0.01),提示上調(diào)miR-4778-3p顯著促進SMC4 mRNA表達。

2.7 上調(diào)miR-4778-3p對MGC803細胞SMC4蛋白和TGF-β/Smad信號通路表達的影響

Western blot檢測顯示,與control組相比,miR-4778-3p組MGC803細胞中SMC4蛋白表達明顯降低(P<0.01),TGF-β/Smad信號通路蛋白如TGFBR3和p-Smad3表達明顯降低(P<0.01,見圖6)。

與control組相比,**P<0.01圖6 上調(diào)miR-4778-3p對SMC4蛋白和TGF-β/Smad信號通路表達的影響Figure 6 The effect of up-regulation of miR-4778-3p on the expression of SMC4 protein and TGF-β/Smad signaling pathway proteins

3 討論

越來越多的miRNA被證實在腫瘤組織和癌旁組織中存在表達差異,表現(xiàn)為類似癌基因或抑癌基因的作用[8,9]。研究顯示,miR-146b-5p[10]、miR-877-5p[11]、miR-96-5p[12]、miR-760[13]等miRNA在胃癌組織中呈高表達或低表達,參與調(diào)控胃癌細胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、分化等過程,與胃癌患者的臨床分期、病理分級、生存率密切相關(guān)。miR-4778-3p是一個新發(fā)現(xiàn)的抑癌性miRNA,其可增強宮頸癌細胞對放療的敏感性,抑制細胞活力、細胞周期及細胞轉(zhuǎn)移[7]。本研究通過檢測miR-4778-3p在胃癌組織和癌旁組織中的表達差異,結(jié)果顯示miR-4778-3p在胃癌組織中呈低表達。本研究通過轉(zhuǎn)染miR-4778-3p mimic至胃癌MGC803細胞,上調(diào)miR-4778-3p表達能顯著抑制MGC803細胞的增殖和細胞周期,miR-4778-3p在胃癌細胞中表現(xiàn)為抑癌基因作用。

miRNA發(fā)揮作用的主要機制是通過在轉(zhuǎn)錄后水平特異性結(jié)合靶基因mRNA 3′-UTR,降低靶基因mRNA的穩(wěn)定性,抑制靶基因蛋白的表達[14]。miRecords和miRGator數(shù)據(jù)庫預測miR-4778-3p可能的靶基因是染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白4(structural maintenance of chromosome protein,4,SMC4)。SMC4蛋白屬于染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白(structural maintenance of chromosome protein,SMC)家族,其在細胞有絲分裂過程負責調(diào)控染色體的凝集和分離,影響細胞周期的進展[15]。近年來研究顯示,SMC4蛋白在結(jié)直腸癌、膠質(zhì)瘤、乳腺癌、肺癌等多種腫瘤組織高表達,其可通過激活TGF-β/Smad信號通路的轉(zhuǎn)導,促進腫瘤細胞增殖和細胞周期進展,發(fā)揮顯著的癌基因作用[16-18]。GEPIA數(shù)據(jù)庫分析顯示,SMC4基因在胃癌組織中的表達明顯高于正常胃組織,可能表現(xiàn)為癌基因作用。雙熒光素酶活性分析實驗證實miR-4778-3p靶向作用SMC4 mRNA的3′-UTR堿基位點。本研究結(jié)果顯示,上調(diào)miR-4778-3p表達可靶向抑制SMC4基因在mRNA和蛋白水平的表達,miR-4778-3p對胃癌細胞增殖和細胞周期的影響可能與下調(diào)SMC4基因表達有關(guān)。MGC803細胞中SMC4基因表達降低后,TGF-β/Smad信號通路蛋白表達明顯降低。

綜上所述,miR-4778-3p在胃癌組織中呈低表達,上調(diào)miR-4778-3p通過靶向調(diào)控SMC4基因表達,阻滯TGF-β/Smad信號通路轉(zhuǎn)導,有效抑制胃癌MGC803細胞增殖和細胞周期。miR-4778-3p有望成為胃癌新的分子治療靶點。