基于龍牙百合胚拯救技術(shù)的植物組織培養(yǎng)綜合實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)

卻志群， 沈春修， 李潤(rùn)根， 肖秋生

(宜春學(xué)院 生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院， 江西 宜春 336000)

植物組織培養(yǎng)是以植物細(xì)胞全能性為理論基礎(chǔ)，在無(wú)菌和人工控制的環(huán)境條件下利用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，對(duì)離體的植物器官、組織、細(xì)胞及原生質(zhì)體進(jìn)行培養(yǎng)，使其再生細(xì)胞或完整植株的技術(shù)[1]?！吨参锝M織培養(yǎng)》是園藝專業(yè)的核心課程，該門課程涉及植物學(xué)、植物生理學(xué)、育種學(xué)等多個(gè)知識(shí)領(lǐng)域并且應(yīng)用性強(qiáng)、實(shí)踐性豐富[2]。為鍛煉學(xué)生動(dòng)手操作能力，使理論知識(shí)和實(shí)際操作技能有機(jī)結(jié)合，提高學(xué)生創(chuàng)新思維和綜合素質(zhì)，結(jié)合宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院植物組織實(shí)驗(yàn)課內(nèi)容單一、綜合性實(shí)驗(yàn)偏少的現(xiàn)狀，特開(kāi)設(shè)龍牙百合胚拯救技術(shù)植物組織培養(yǎng)綜合實(shí)驗(yàn)。龍牙百合在宜春市萬(wàn)載縣有500多年的種植歷史，是當(dāng)?shù)刂髟云贩N之一，但如今存在品種退化、病害發(fā)生嚴(yán)重等問(wèn)題[3]，亟待培育優(yōu)良的百合新品種。常規(guī)雜交由于百合親和性的影響導(dǎo)致后代存活率差異很大，胚拯救技術(shù)是克服受精后障礙的主要方法[4-5]。筆者所在教學(xué)團(tuán)隊(duì)前期通過(guò)胚拯救技術(shù)解決了龍牙百合和蘭州百合遠(yuǎn)緣雜交受精后障礙，成功獲得雜種苗[6-7]，并將其設(shè)計(jì)成植物組織培養(yǎng)課程綜合實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目?，F(xiàn)將基于龍牙百合胚拯救技術(shù)的植物組織培養(yǎng)綜合實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)介紹如下，以期為植物組織培養(yǎng)及相近課程實(shí)驗(yàn)教學(xué)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)教學(xué)目的

通過(guò)實(shí)驗(yàn)課程掌握胚拯救技術(shù)的具體操作方法，定期觀察胚萌發(fā)情況，統(tǒng)計(jì)雜種胚萌發(fā)率，分析不同激素配比對(duì)胚萌發(fā)的影響，探討胚拯救技術(shù)的適用領(lǐng)域，提出自己的看法，能自行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)解決生產(chǎn)上面臨的實(shí)際問(wèn)題。

2 教學(xué)實(shí)施

2.1 實(shí)施對(duì)象

在宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院2017級(jí)園藝專業(yè)32名學(xué)生中，以小組的形式開(kāi)展該綜合實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，每組4人，共8組。本項(xiàng)目課時(shí)10學(xué)時(shí)，其中理論講解2學(xué)時(shí)，培養(yǎng)基配制與滅菌4學(xué)時(shí)，胚拯救接種操作4學(xué)時(shí)。

2.2 教學(xué)安排

綜合實(shí)驗(yàn)安排在《植物組織培養(yǎng)》課程授課學(xué)期，開(kāi)課第10～11周時(shí)學(xué)生對(duì)該課程的理論、基本操作已熟悉。采用翻轉(zhuǎn)課堂[8]的教學(xué)模式，教師在第8周通過(guò)超星學(xué)習(xí)通平臺(tái)發(fā)送實(shí)驗(yàn)相關(guān)PPT、課件、視頻材料及相關(guān)問(wèn)題，要求學(xué)生根據(jù)具體情況選取材料、試劑，查閱相關(guān)文獻(xiàn)，撰寫實(shí)驗(yàn)方案，并確定小組負(fù)責(zé)人及實(shí)驗(yàn)工作分工。課堂講授階段學(xué)生以PPT形式匯報(bào)實(shí)驗(yàn)流程及操作要點(diǎn)，各小組互評(píng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)方案不足之處進(jìn)行修正，教師最后進(jìn)行點(diǎn)評(píng)，確定實(shí)驗(yàn)方案。隨后進(jìn)入正式實(shí)施階段，考慮到實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的連續(xù)性和百合生長(zhǎng)的季節(jié)性，實(shí)驗(yàn)操作安排在第10～11周教學(xué)工作日進(jìn)行。第10周完成培養(yǎng)基的制作，第11周完成百合雜交果的取樣、消毒、無(wú)菌接種、培養(yǎng)工作。定期觀察百合雜交果的萌發(fā)狀態(tài)并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)全部結(jié)束后提交完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備

1) 百合。以種植于宜春學(xué)院園藝基地的龍牙百合作母本，蘭州百合作父本，取授粉后生長(zhǎng)45 d以上的雜交果作為實(shí)驗(yàn)材料(圖1)。

圖1 百合雜交果

2) 儀器設(shè)備與試劑。儀器設(shè)備有超凈工作臺(tái)、高壓蒸汽滅菌鍋、烘箱、搖床、微波爐、移液器、離心機(jī)、光照培養(yǎng)箱、純水系統(tǒng)、磁力攪拌器等。試劑有MS培養(yǎng)基干粉、蔗糖、瓊脂粉、6-BA、NAA、HCL、NaOH、酒精燈。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)方法

1) 培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)。根據(jù)筆者所在教學(xué)團(tuán)隊(duì)前期探索結(jié)果，本次綜合實(shí)驗(yàn)以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，共設(shè)計(jì)9個(gè)組合培養(yǎng)基配方[6-7](表1)。

表1 不同激素配比的培養(yǎng)基配方

2) 外植體的消毒和接種。百合雜交果在流水下沖洗1 h，放入滅菌的空三角瓶中，置于超凈工作臺(tái)上，倒入75%酒精浸泡30 s，然后倒出，加入無(wú)菌水漂洗3次，取出雜交果放入另一滅菌的空三角瓶中，加入0.1%氯化汞溶液浸泡10 min，期間不斷晃動(dòng)，再用無(wú)菌水漂洗5次，清除殘留在材料表面的化學(xué)試劑，最后取出雜交果放在干燥的無(wú)菌濾紙上，吸干表面水分。用手術(shù)刀沿著果皮縫劃開(kāi)，再用無(wú)菌鑷子取出有胚種子，在靠近酒精燈外焰處打開(kāi)培養(yǎng)基瓶蓋，接種到培養(yǎng)基上。

3) 外植體的培養(yǎng)。胚萌發(fā)之前放在溫度25℃的暗室培養(yǎng)，2周后胚開(kāi)始萌發(fā)移入光室培養(yǎng)，設(shè)定溫度25℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，光照時(shí)間12 h/d。每組共9個(gè)處理(每個(gè)激素配比培養(yǎng)基配方對(duì)應(yīng)一個(gè)處理)，每處理2瓶，每瓶接種2～3粒雜種胚，接種60 d后統(tǒng)計(jì)不同處理雜種胚萌發(fā)情況。

2.3 教學(xué)效果

本次綜合性實(shí)驗(yàn)課程結(jié)束后，筆者與部分2017級(jí)學(xué)生進(jìn)行了面對(duì)面交流，學(xué)生普遍對(duì)這類實(shí)驗(yàn)的開(kāi)設(shè)持滿意態(tài)度，主動(dòng)提出要加入相關(guān)教師科研團(tuán)隊(duì)從事簡(jiǎn)單的研究工作；也有部分學(xué)生提出了自己的建議，即在培養(yǎng)基配方設(shè)計(jì)上是否可以按照多因素統(tǒng)計(jì)分析方法設(shè)計(jì)更多組配方，因?yàn)槭鞘状螄L試，考慮到實(shí)驗(yàn)材料比較緊缺，以免造成浪費(fèi)，所以在下一年的實(shí)驗(yàn)開(kāi)設(shè)過(guò)程中將對(duì)此進(jìn)行優(yōu)化。

本實(shí)驗(yàn)以宜春特色品種龍牙百合雜交果作為研究對(duì)象，利用植物組織培養(yǎng)中胚拯救技術(shù)克服大田雜交不親和導(dǎo)致百合雜交果不能發(fā)育成熟的問(wèn)題，成功獲得雜種苗，為后期通過(guò)雜交培育優(yōu)質(zhì)百合種苗奠定了基礎(chǔ)。

通過(guò)以上綜合性實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展，學(xué)生完全掌握了植物組織培養(yǎng)中胚拯救技術(shù)的知識(shí)要點(diǎn)，體會(huì)到了課本知識(shí)轉(zhuǎn)化為實(shí)踐成果的樂(lè)趣，激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣，促進(jìn)了學(xué)生專業(yè)能力的培養(yǎng)。本綜合性實(shí)驗(yàn)與實(shí)際生產(chǎn)結(jié)合緊密，注重培養(yǎng)學(xué)生對(duì)知識(shí)的應(yīng)用能力，同時(shí)有利于激發(fā)學(xué)生的科研興趣。通過(guò)學(xué)習(xí)百合雜種胚拯救技術(shù)綜合實(shí)驗(yàn)，把以前實(shí)驗(yàn)教學(xué)中單一的項(xiàng)目全部串聯(lián)起來(lái)，對(duì)每一個(gè)知識(shí)點(diǎn)進(jìn)行總結(jié)歸納，容易形成系統(tǒng)的知識(shí)架構(gòu)，有利于創(chuàng)新思維能力的培養(yǎng)。

3 小結(jié)

龍牙百合胚拯救技術(shù)綜合性實(shí)驗(yàn)選題來(lái)自百合團(tuán)隊(duì)多年科研成果的部分內(nèi)容，是科研學(xué)術(shù)成果轉(zhuǎn)化為教學(xué)內(nèi)容的具體體現(xiàn)，實(shí)現(xiàn)了科研和教學(xué)的有機(jī)統(tǒng)一。學(xué)生在參與過(guò)程中，改變了過(guò)去被動(dòng)學(xué)習(xí)知識(shí)的狀態(tài)，提高了創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)和科研思維能力，也激發(fā)了其科研潛力[9]。總之，該實(shí)驗(yàn)教學(xué)整合了植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)課中多個(gè)知識(shí)點(diǎn)，貼近實(shí)際，實(shí)驗(yàn)效果好，有利于培養(yǎng)學(xué)生實(shí)踐能力與創(chuàng)新能力，能夠體現(xiàn)科研成果轉(zhuǎn)化為實(shí)驗(yàn)教學(xué)的優(yōu)越性，在后續(xù)教學(xué)過(guò)程中將逐步調(diào)整優(yōu)化，爭(zhēng)取在更大學(xué)生群體和更多相近專業(yè)中進(jìn)行推廣。